一种硒或硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸及其合成方法

技术领域

本发明涉及修饰三磷酸合成以及核酸分子检测技术领域，尤其涉及一种硒或硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸及其核酸合成以及核酸分子检测运用的方法。

背景技术

核酸分子检测和核酸测序是病原体、肿瘤、疾病和环境检测鉴定和流行病控制的重要基础和依据。其中，碱基配对是核酸分子识别的基础，它们在研究包括核酸诊断、分子序列识别、测序分析、遗传信息存储、DNA复制、RNA转录和蛋白质翻译，等等机制发现和实际应用方面具有重要意义。此外，DNA碱基(T/A和C/G)的正常准确配对和堆叠决定了DNA双链的结构和稳定性。然而，RNA中的非正常碱基对(如U/G)，使RNA结构多样化，增强RNA功能，如核酶和病毒的RNA。但是，在DNA识别和合成中并不欢迎非正常碱基对(如碱基摆动配对T/G，典型的错配)，因为它们会导致突变并降低DNA聚合的特异性。T/G配对的产生是通过胸腺嘧啶碱基上2-氧形成G摆动氢键导致的，而2-氧并不参与T/A碱基对。由于在同族元素中，硒的原子半径

现有技术中，主要使用商业化的RT-PCR或PCR或RT-qPCR或qPCR核酸检测试剂盒进行病原体、肿瘤、疾病和环境核酸的检测。在RNA反转录(RT,reverse transcription)之后，DNA分子检测的基本原理如下所述：以TaqMan探针为例，TaqMan探针是一段寡核苷酸单链，与目标DNA互补，探针两端分别有一个报告基团和一个淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，不会检测到荧光，PCR扩增时，Taq DNA聚合酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，报告基团释放并发出荧光。每合成一条DNA链，就会切断一条探针，并产生一个单位荧光信号，信号的强度与结合到DNA链上的探针成正比，如图1所示。

现有技术最大的痛点问题在于针对低拷贝数下，病原体、肿瘤、疾病和环境核酸样本检测的灵敏的不够高，导致假阴性结果的产生。这是因为现有技术在检测过程中，由于有错配的存在(尤其是典型的T/dG和T/rG摆动错配)，会导致低拷贝核酸分子的信号偏弱，背景噪音会将其淹没，无法被仪器准确检测到。由于病原体有可能会快速传播(例如新冠病毒)，因此，解决假阴性的痛点问题显得尤为重要。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种硒或硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸及其合成方法，用硒或硫取代碱基2-氧原子得到的2-Se-胸苷三磷酸(

为了实现上述技术方案，本发明提供了一种硒代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸，该硒代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸为化合物5Se，即

所述化合物5Se由化合物4Se通过一锅合成法转化为

所述化合物4Se是通过化合物3与三氯乙酸进行脱保护反应，得到

其中X为Se,Z为O,R

为了实现上述技术方案，本发明还提供了一种硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸的创新合成，该硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸为化合物5S，即

所述化合物5S由化合物4S通过一锅合成法转化为

所述化合物4S是通过化合物1与三氯乙酸进行脱保护反应，得到

其中X为S,Z为O,R

该发明的进一步说明在于:所述化合物3和1为一种嘧啶核苷类似物，其分子结构为

其中R

R

R

Z为Te、Se、S或O；

X为Te、Se、S或O；

X和Z不同时为O。

进一步改进在于:所述化合物3的部分是通过化合物2与NaSeH反应以完成硒取代，并得到化合物3，所述化合物2的分子结构为

其中R

R

R

R

Z为Te、Se、S或O；

X为S或O；

一种硒代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸的化学合成方法，包括以下合成步骤：

步骤一：采用5′-DMTr-2-硫代胸苷作为化合物1，用CH

步骤二：化合物2与NaSeH反应以完成硒取代，得到化合物3；

步骤三：化合物3与三氯乙酸进行脱保护反应，得到

步骤四：通过一锅合成法将化合物4Se转化为

步骤五：将化合物5Se纯化后通过核磁共振、质谱和高效液相色谱对其进行表征，以确认其结构和纯度，然后用

进一步改进在于：在步骤一中，将化合物1溶于干燥的二氯甲烷中，然后添加甲苯，在室温下将N,N-二异丙基乙胺和碘甲烷添加到反应混合物中，用薄层色谱板监测反应，反应时间为0.5-1h；再向反应体系中加入甲醇并搅拌5分钟以终止反应；旋干有机相，然后添加二氯甲烷；有机层用去离子水洗涤一次，然后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次；将有机相用无水硫酸镁干燥，旋干，过柱纯化，得到化合物2。

进一步改进在于：在步骤二中，在0℃下，向硒和硼氢化钠中加入无水乙醇得到NaSeH溶液，反应时间为0.5h，反应结束后为透明溶液；再将乙醇溶液添加到化合物2中并且在氩气下搅拌该混合物过夜，旋干，加入乙酸乙酯，再用水洗涤有机相三次，然后用无水硫酸镁干燥，过柱纯化，得到化合物3。

进一步改进在于：在步骤三中，将化合物3置于干燥的圆底烧瓶中，然后添加含有巯基乙醇的二氯甲烷，向烧瓶中逐滴加入三氯乙酸溶液，搅拌10分钟，当有沉淀产生，用TLC板监测反应；待反应完成后，收集沉淀并用DCM洗涤，得到化合物4Se。

进一步改进在于：在步骤四中，在干燥的圆底烧瓶中放入一干燥的磁力搅拌子和

一种硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸的化学合成方法，包括以下合成步骤：

步骤一：化合物1与三氯乙酸进行脱保护反应，得到

步骤二：通过一锅合成法将化合物4S转化为

步骤三：将化合物5S纯化后通过质谱和高效液相色谱对其进行表征，以确认其结构和纯度，然后用

进一步改进在于：在步骤一中，将化合物1置于干燥的圆底烧瓶中，然后添加含有巯基乙醇的二氯甲烷，向烧瓶中逐滴加入三氯乙酸溶液，搅拌10分钟，当有沉淀产生，用TLC板监测反应；待反应完成后，收集沉淀并用DCM洗涤，得到化合物4S。

进一步改进在于：在步骤二中，在干燥的圆底烧瓶中放入一干燥的磁力搅拌子和

本发明的有益效果是：本发明创新设计并且合成了

附图说明

图1为现有RT-qPCR核酸检测试剂盒进行病毒核酸检测的核心示意图。

图2为本发明的硒或硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸的合成方法示意图。

图3为本发明的化合物2的合成示意图。

图4为本发明的化合物3的合成示意图。

图5为本发明的化合物4Se的合成示意图。

图6为本发明的化合物5Se的合成示意图。

图7为本发明的

图8为本发明的

图9为本发明的

图10为本发明的

图11为本发明的

图12为本发明的

图13为本发明的

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

实施例一

根据图1-13所示，本实施例提供了一种硒代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸及其合成方法，其特征在于，包括以下合成步骤：

步骤一：采用5′-DMTr-2-硫代胸苷作为化合物1，用CH

步骤二：化合物2与新鲜制备的NaSeH反应以完成硒取代，以80％的产率得到化合物3

步骤三：化合物3与三氯乙酸进行脱保护反应，得到

步骤四：通过一锅合成法将化合物4Se转化为

步骤五：将化合物5Se纯化后通过核磁共振、质谱和高效液相色谱对其进行表征，以确认其结构和纯度，然后用

如图3所示，在步骤一中，将化合物1溶于干燥的二氯甲烷中(DCM，10ml)，然后添加5ml甲苯，在室温下将N,N-二异丙基乙胺(DIEA，0.69g，5.34mmol)和碘甲烷(0.76g，5.35mmol)添加到反应混合物中，用TLC薄层色谱板监测反应(10％甲醇溶于二氯甲烷中，

如图4所示，在步骤二中，在0℃下，向硒(0.41g，5.19mmol)和硼氢化钠(NaBH4，0.25g，6.61mmol)中加入5mL无水乙醇得到NaSeH溶液，反应时间为0.5h，反应结束后为透明溶液；再将乙醇溶液添加到化合物2(0.5g，0.87mmol)中并且在氩气下搅拌该混合物过夜，旋干，加入5mL乙酸乙酯，再用水洗涤有机相三次(3×30ml)，然后用无水硫酸镁干燥，过柱纯化(流动相为含5％甲醇的二氯甲烷)，得到产率为83％的化合物3(0.44g，0.72mmol)，经核磁共振和质谱分析。

如图5所示，在步骤三中，将化合物3(0.22g，0.38mmol)置于干燥的10mL圆底烧瓶中，然后添加含有巯基乙醇(0.2g，2.56mmol，7当量)的二氯甲烷(5mL，DCM)，向烧瓶中逐滴加入三氯乙酸(TCA)溶液(1mL 10％TCA，DCM，m/v)；搅拌10分钟，当有沉淀产生，用TLC板监测反应(含10％甲醇的二氯甲烷，Rf＝0.3)；待反应完成后，收集沉淀并用少量DCM洗涤，得到产率为95％的化合物4Se(0.10g，0.34mmol)，核磁共振和质谱分析结果如图7-图9所示：

分子式:C

如图6所示，在步骤四中，在干燥的10ml圆底烧瓶中放入一干燥的磁力搅拌子和

本实施例在实验中采用安捷伦1260高效液相色谱仪和月旭液相色谱柱。缓冲液A为：三乙胺乙酸盐溶液,20mM,pH 7.0；缓冲液B为:含有50％乙腈的三乙胺乙酸盐溶液,20mM,pH 7.0。在1mL/min的流速下洗脱30min，程序中缓冲液B的比例从2％变到15％。

分子式:C

COVID-19rna模板：模板用T7 HighYield RNA Synthesis Kit(购自NEB)转录。从另外两个质粒中克隆了相应的DNA模板，分别含有COVID-19病毒ORF1ab和N基因序列。转录的RNA模板用Monarch RNA Cleanup Kit(购自NEB)纯化。

所述化合物2为5'-DMTr-MeST，分子结构为

所述化合物3为5’-DMTr组，分子结构为

所述化合物4Se为2-Se-T核苷，分子结构为

所述化合物5Se为硒代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸，即

碱基错配会影响DNA聚合反应的准确性，导致DNA复制产生突变和错误的检测结果。为了解决碱基错配问题，本实施例首次合成了2-Se-胸腺嘧啶核苷三磷酸(

本发明的优点在于能够提高核酸检测的准确性，而且使用简单，只需要在原有体系中按照一定比例补加适量化合物

本实施例合成了2-Se-三磷酸胸苷(

实施例二

如图1所示，本实施例提供了一种硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸化学合成方法，包括以下合成步骤：

步骤一：采用5′-DMTr-2-硫代胸苷作为起始反应物，即化合物1，化合物1与三氯乙酸进行脱保护反应，得到

步骤二：通过一锅合成法将化合物4S转化为

步骤三：将化合物5S纯化后对其进行表征，以确认其结构和纯度，然后用

所述化合物4S的分子结构为

所述化合物5S的分子结构为

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。