金露梅提取物在抑制眼细胞凋亡中的用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及金露梅提取物在抑制眼细胞凋亡中的用途。

背景技术

眼细胞凋亡成因复杂，由多因素引起，可导致多种临床疾病。近视是一种复杂的多因素疾病，其治疗比较复杂，又要权衡疗效与安全的关系，还要重视远期效应，目前尚无一种比较妥善的治疗方法。徐格致等在高度近视眼的视网膜中检测到凋亡的感光细胞，提示高度近视与眼细胞凋亡有关，为高度近视眼的治疗提供了一条新思路——抗凋亡治疗；有研究表明干眼的发病与炎症反应、细胞凋亡、性激素水平变化等密切相关，且眼表的炎症环境可以激活凋亡途径，引起角结膜上皮的凋亡，通过抑制眼细胞的凋亡可缓解由眼细胞凋亡引起的临床症状。

金露梅(Potentilla fruticosa L.)，又名金老梅、药王茶、金腊梅等，为蔷薇科(Rosaceae)委陵菜属(Potentilla)落叶灌木。分布于青海、甘肃、新疆、西藏等地。据《中国植物志》、《中国高等植物志》、《宁夏中药志》等10余种地方植物志记载：金露梅嫩叶可代茶叶饮用，有健脾，化湿、清暑、治暑热眩晕，两目不清，亦可用于预防心脑血管疾病。金露梅的根、茎、叶、花和枝都具有非常强的药理活性，其中，根茎提取物具有很强的免疫调节特性和抗氧化性；枝的提取物在降糖、降脂及抗炎免疫等代谢性疾病相关的研究中显示出良好的效果，目前金露梅提取物抑制眼细胞凋亡的研究鲜少，最新研究发现其对眼细胞凋亡有较好的改善作用。

发明内容

基于此，本发明提供了一种金露梅提取物在制备用于预防、治疗或抑制眼细胞凋亡的药物中的用途。

根据本发明，金露梅提取物为金露梅水提物，优选的，金露梅水提物包括以下组分：(+)-儿茶素-7-O-葡萄糖苷、(+)-儿茶素、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸、槲皮素、柚皮素、3-阿拉伯糖葡糖基槲皮素(quercetin 3-vicianoside)、2R-圣草酚-7-O-β-D-葡萄糖苷和2S-圣草酚-7-O-β-D-葡萄糖苷，各物质的结构如下式：

优选的，金露梅水提物各成分含量包括：(+)-儿茶素-7-O-葡萄糖苷150～180μg/g、(+)-儿茶素80～105μg/g、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸205～230μg/g、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸50～80μg/g、槲皮素30～50μg/g、柚皮素5～15μg/g、3-阿拉伯糖葡糖基槲皮素(quercetin 3-vicianoside)10～30μg/g、2R-圣草酚-7-O-β-D-葡萄糖苷和2S-圣草酚-7-O-β-D-葡萄糖苷25～50μg/g。

根据本发明，眼细胞凋亡由霉酚酸吗啉乙酯诱导。

根据本发明，眼细胞凋亡中的眼细胞为脊椎动物眼细胞。

根据本发明，眼细胞凋亡的眼组织病理学表现为眼细胞固缩、染色质边集。金露梅提取物能够抑制眼细胞固缩、染色质边集；视网膜各层结构边界清楚，细胞形态正常。

根据本发明，金露梅提取物在制备用于预防、治疗或抑制眼细胞凋亡的药物为液体制剂。

优选的，金露梅提取物液体剂的浓度为13.9～125μg/mL。示例性为41.7μg/mL。

优选的，称取15～30g金露梅样品，加入250～500ml蒸馏水，加热煮沸10～20min，重复加水煮沸过程，提取2～4次后，提取液由黄褐色变为无色，将所述提取液经40～60℃加热，经冷凝旋蒸，得金露梅提取物备用，所述金露梅提取物为棕色水提物粉末；使用时用标准稀释水按需配制成母液，例如母液为2.5mg/mL。

优选的，金露梅样品选自金露梅红茶、金露梅绿茶、金露梅花茶和金露梅叶中的至少一种。

优选的，金露梅提取物液体剂对斑马鱼眼凋亡细胞相对于施加GSH 615μg/mL的阳性对照为100％的情况下，抑制功效为81％～137％，示例性为108％。

本发明的有益效果：

现有技术中，环孢素(CsA)因分子量大，疏水性强，生物利用度较低，难以通过眼部的屏障系统到达眼内的病灶部位，且环孢素眼用制剂的处方组成中使用的助溶剂和表面活性剂存在着一定的安全性和刺激性问题。由于目前的眼药制剂治疗眼部疾病产生较多的副作用，因此，从天然药物资源中寻找疗效好、复发少、安全性高的抑制眼细胞凋亡的药物具有重要的价值。

金露梅为青藏高原天然药用植物资源，具有抗氧化、抗炎症作用，在斑马鱼眼细胞凋亡模型中，金露梅提取物能明显抑制眼部细胞凋亡，具有显著的眼保护作用，对眼凋亡斑马鱼的眼组织病理结构有明显的改善功效，疗效佳，副作用小。且金露梅野生资源量丰富，容易获得，具有有良好的开发应用前景。

本研究通过进行动物实验，探究金露梅提取物的抑制眼细胞凋亡作用，提出了一种抗眼细胞凋亡的新方法，为临床应用提供相应思路和数据。

附图说明

图1为金露梅提取物处理后斑马鱼眼凋亡细胞荧光强度表型图。

其中，虚线标注部分为斑马鱼眼睛，E＝眼睛。

图2为金露梅提取物处理后斑马鱼眼凋亡细胞荧光强度。

其中，与模型对照组比较，

图3为金露梅提取物对眼凋亡细胞的抑制功效。

图4为金露梅提取物处理后斑马鱼眼凋亡细胞病理切片H&E染色。

其中，虚线标注部分为斑马鱼眼睛，E＝眼睛；放大倍数为400倍。

图5为不同浓度金露梅绿茶提取物对DPPH·的清除效果。

图6为不同浓度金露梅绿茶提取物对ABTS·的清除效果。

图7为ABTS法测定不同浓度金露梅绿茶提取物的总抗氧化性。

图8为FRAP法测定不同浓度金露梅绿茶提取物的总抗氧化性。

图9为金露梅提取物对大鼠MDA水平的影响。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

实施例1

一、实验过程

1、实验动物

野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行，共600尾，每实验组为30尾，年龄为受精后1天(1dpf)，用于金露梅提取物对眼凋亡细胞抑制功效的最大检测浓度(MTC)测定，评价金露梅提取物对眼凋亡细胞的抑制功效及对眼组织病理学的影响。斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μS/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100mg/L CaCO3)，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。

2、实验药物

称取23.9g金露梅绿茶，用KDM-2000型可调式电热套，每次加300ml蒸馏水，加热煮沸，保持底沸状态，防止水蒸发过快，每次15min，提取4次，即提取液由黄褐色变为无色，经50℃加热，0℃冷凝条件旋蒸后，得3.0122g水提物，棕色粉末，阴凉干燥处避光保存，临用时用标准稀释水按需配制成2.5mg/mL母液，现配现用。还原性谷胱甘肽(GSH)，白色粉末，批号为SLCF2362，阴凉干燥柜保存，购自Sigma-Aldrich。临用时用超纯水配制成61.5mg/mL母液，现配现用。霉酚酸吗啉乙酯，白色粉末，批号为H14J6335，阴凉干燥柜保存，购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。用DMSO配制成173mg/mL母液，-20℃保存，临用时按需稀释。

3、仪器与试剂

体式显微镜(SZX7，OLYMPUS，Japan)，CCD相机(VertA1，上海土森视觉科技有限公司，China)；电动聚焦连续变倍荧光显微镜(AZ100，Nikon，Japan)；精密电子天平(CP214，OHAUS，America)；6孔板(Nest Biotech，China)；切片机(KD2258，KEDEE，China)。甲基纤维素(批号079K0054V，Sigma，USA)；吖啶橙(AO)染料(批号494-38-2，Sigma，China)；二甲苯(批号C10631736，上海麦克林生化科技有限公司，China)；无水乙醇(批号20200302，国药集团化学试剂有限公司，China)；PBS缓冲液(批号10C16B30，武汉博士德生物工程有限公司，China)；Mayer苏木素染色液(批号YH0170326，上海依赫生物科技有限公司，China)；伊红染色液(批号YH180124，上海依赫生物科技有限公司，China)；中性树脂封片剂(批号YH0170419，上海依赫生物科技有限公司，China)；软蜡(熔点54-56℃，批号20180108，上海华永石蜡有限公司，China)；硬蜡(熔点62-64℃，批号20190628，上海华永石蜡有限公司，China)。

4、浓度组别

(1)MTC测定

实验1组 正常对照组

实验2组 模型对照组

实验3组 金露梅提取物7.81μg/mL

实验4组 金露梅提取物15.6μg/mL

实验5组 金露梅提取物31.3μg/mL

实验6组 金露梅提取物62.5μg/mL

实验7组 金露梅提取物125μg/mL

实验8组 金露梅提取物250μg/mL

(2)金露梅提取物对眼凋亡细胞的抑制功效评价

实验1组 正常对照组

实验2组 模型对照组

实验3组 阳性对照组GSH 615μg/mL

实验4组 金露梅提取物13.9μg/mL

实验5组 金露梅提取物41.7μg/mL

实验6组 金露梅提取物125μg/mL

(3)金露梅提取物对眼组织病理学的影响评价

实验1组 正常对照组

实验2组 模型对照组

实验3组 阳性对照组GSH 615μg/mL

实验4组 金露梅提取物13.9μg/mL

实验5组 金露梅提取物41.7μg/mL

实验6组 金露梅提取物125μg/mL

浓度确定依据

根据浓度摸索实验结果，金露梅提取物对眼凋亡细胞抑制功效的最大检测浓度(MTC)为125μg/mL。选取浓度为1/9MTC、1/3MTC和MTC，确定金露梅提取物对眼凋亡细胞抑制功效实验浓度设置为13.9、41.7和125μg/mL。

模型制作

用霉酚酸吗啉乙酯173μg/mL浓度处理野生型AB品系斑马鱼24h，建立斑马鱼眼凋亡模型。

5、实验方法

(1)MTC测定

随机选取240尾1dpf野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每孔(每实验组)30尾，用霉酚酸吗啉乙酯诱导斑马鱼建立眼凋亡模型。分别水溶给予金露梅提取物7.81、15.6、31.3、62.5、125和250μg/mL浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余实验组分别与霉酚酸吗啉乙酯共同处理24h后，观察记录斑马鱼的毒性表型和死亡情况，确定金露梅提取物的MTC。

(2)金露梅提取物对眼凋亡细胞抑制功效评价

随机选取180尾1dpf野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每孔(每实验组)30尾，用霉酚酸吗啉乙酯诱导斑马鱼建立眼凋亡模型。分别水溶给予金露梅提取物13.9、41.7和125μg/mL浓度，阳性对照组GSH 615μg/mL浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余实验组分别与霉酚酸吗啉乙酯共同处理24h。金露梅提取物处理结束后，用吖啶橙进行染色，染色结束后每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照并用NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件分析与采集数据，分析统计斑马鱼眼凋亡细胞荧光强度(S)，以眼凋亡细胞荧光强度的统计学意义评价金露梅提取物对眼凋亡细胞的抑制功效。统计学处理结果采用mean±SE表示。眼凋亡细胞的抑制功效计算公式如下：

用SPSS进行统计学分析，p<0.05说明具有显著性差异。

(3)金露梅提取物对对眼组织病理学的影响评价

随机选取180尾1dpf野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每孔(每实验组)30尾，用霉酚酸吗啉乙酯诱导斑马鱼建立眼凋亡模型。分别水溶给予金露梅提取物13.9、41.7和125μg/mL浓度，阳性对照组还原性谷胱甘肽(GSH)615μg/mL浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余实验组分别与霉酚酸吗啉乙酯共同处理24h。金露梅提取物处理结束后，将各组斑马鱼经系列脱水-包埋-切片-烘片-染色-封片等步骤，对斑马鱼进行H&E染色，并进行组织病理学分析。

二、实验结果

1.MTC测定

在实验终点，模型对照组斑马鱼眼睛异常，发育迟缓。金露梅提取物7.81、15.6、31.3、62.5和125μg/mL浓度组均未见明显异常；250μg/mL浓度组较模型对照组状态严重。故确定金露梅提取物对眼凋亡细胞抑制功效的MTC为125μg/mL。详见表1。

表1.金露梅提取物“浓度-死亡率”原始数据(n＝30)

2.金露梅提取物对眼凋亡细胞的抑制功效评价

模型对照组斑马鱼眼凋亡细胞荧光强度(744916像素)与正常对照组(359267像素)比较p<0.01，说明模型建立成功。阳性对照组GSH 615μg/mL浓度组斑马鱼眼凋亡细胞荧光强度为168962像素，与模型对照组(744916像素)比较p<0.001，眼保护功效为149％。说明在本实验浓度条件下，GSH对眼凋亡细胞有明显的抑制功效。

金露梅提取物在13.9、41.7和125μg/mL浓度时，眼凋亡细胞荧光强度分别为433664、330288和217513像素，与模型对照组(744916像素)比较p>0.05&p<0.05&p<0.001，眼凋亡细胞抑制功效分别为81％、108％和137％。说明在本实验浓度条件下，金露梅提取物对眼凋亡细胞有明显的抑制功效。详见表2、图1、图2和图3。

表2.金露梅提取物处理后眼凋亡细胞荧光强度(n＝10)

与模型对照组比较，

3.金露梅提取物对眼组织病理学的影响评价

眼部病理切片结果(图4)显示，模型对照组斑马鱼眼球形态较正常对照组缩小，视网膜各层结构边界模糊，普遍细胞凋亡，表现为细胞固缩、染色质边集，说明模型建立成功。阳性对照组GSH尽管存在少量凋亡细胞，但眼球形态明显恢复，视网膜各层结构接近正常对照组，大部分细胞形态正常，说明GSH能明显抑制眼部细胞凋亡，具有显著的眼保护作用。

金露梅提取物在13.9、41.7和125μg/mL浓度时斑马鱼眼球形态接近正常对照组，视网膜各层结构边界清楚，大部分细胞形态正常，仅存在少量细胞固缩、染色质边集。说明金露梅提取物对眼凋亡斑马鱼的眼组织病理结构有明显的改善功效。

结论：在本实验浓度条件下，金露梅提取物对眼凋亡细胞有明显的抑制功效，对眼凋亡斑马鱼的眼组织病理结构有明显的改善功效。

实施例2

金露梅提取物抗氧化实验显示，金露梅提取物具有较好的抗氧化作用。

1.体外抗氧化结果显示：在试验浓度范围内，浓度为1.00mg/mL时，金露梅绿茶的清除率达到最大。在1.00mg/mL时，VC的清除率达97.21％，金露梅绿茶的清除率达93.50％略小于Vc的清除作用，说明金露梅绿茶提取物中含羟基类的化合物随浓度的增加而增加，而DPPH与抗氧化类物质反应的速度是与羟基结构的数目有关(见图5)；在浓度为1mg/ml时，金露梅绿茶及VC的ABTS+自由基的清除率分别为91.81、86.72％，说明金露梅茶清除ABTS+自由基的能力更好；在试验浓度范围内，金露梅绿茶比VC的ABTS+自由基的清除能力高(见图6)，总抗氧化能力测定实验(ABTS法)结果显示，随着浓度升高，金露梅绿茶提取物的总抗氧化性高于Vc的抗氧化性,总抗氧化能力测定试验(FRAP法)结果显示,随着浓度升高，金露梅绿茶提取物的总抗氧化性略低于Vc的抗氧化性，由结果知，两种方法测得的金露梅绿茶和Vc的总抗氧化能力由所差异(见图7、图8)。

2.体内实验结果显示：与空白正常组相比，模型组SOD活力明显降低(P<0.001)，金露梅绿茶提取物干预后，SOD活力向空白组恢复得趋势(P>0.05)；在实验中，金露梅绿茶提取物组与阳性对照组GSH-Px活性之间无显著差异(P>0.05)，阳性对照组和正常组的GSH-Px的活力接近，阳性对照组、金露梅绿茶提取物组GSH-Px活性与模型组差异极显著(P<0.001)；而大鼠CAT活力中，模型组显著低于空白组(P<0.001)，与模型组相比，阳性对照组、金露梅绿茶提取物组CAT活力显著上升(P<0.001)(见表3)，模型组的MDA含量显著高于正常组的MDA含量(P<0.001)；阳性对照组的MDA含量显著低于模型组(P<0.001)，趋近正常对照组；金露梅绿茶提取物组的MDA含量显著低于模型组(P<0.001)，但高于正常组、阳性对照组的MDA含量，说明金露梅绿茶提取物可明显降低MDA含量，但效果略低于阳性对照组(见图9)。

表3金露梅绿茶对大鼠SOD、GSH-Px、CAT活力的影响

注：与空白对照组比较，

实施例3

将300g的金露梅提取物悬浮与水，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，获得的水层和乙酸乙酯层，先经过Diaion HP20SS用甲醇/水(0:1-1:0)脱糖除色素，再经Sephadex LH-20用甲醇/水(0:1-1:0)洗脱后，再分别经MCI-gel CPH-20P(MeOH-H2O洗脱)，Rp-18(MeOH-H2O洗脱)，ToyopearlHW-40(MeOH-H2O洗脱)，硅胶(CHCl3-MeOH-H2O洗脱)，Sephadex LH-20等柱层析反复纯化后，获得纯化分离的化合物；将化合物分三个批次，均通过液相-离子阱色谱质谱联用仪进行测定分析，金露梅提取物中各组分含量如表4所示。

表4金露梅提取物中各组分含量

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。