枇杷炭疽病菌巢式PCR特异性引物及其检测方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及枇杷炭疽病菌的检测，具体涉及一种枇杷炭疽病菌巢式PCR特异性引物及其检测方法和应用。

背景技术

枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)是一种起源于中国的亚热带常绿果树，因其风味独特、营养丰富、具药用价值而深受消费者喜爱，但随着其种植面积增大，病害问题突显，其中枇杷炭疽病是一种发病率最高、发病范围最广的病害，严重制约了产业发展。该病害主要为害枇杷叶片、果实，造成叶斑和果实软腐症状，且危害时间长，从生长发育至采后贮藏时期均可发病，为果农和经销商带来了巨大的经济损失。

枇杷炭疽病主要由真菌胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和尖孢炭疽菌(C.acutatum)侵染所致，其分生孢子一般从伤口、气孔等入侵，有时也可以直接穿透表皮入侵。分生孢子借助风、雨、昆虫等媒介进行传播，其孢子萌发的适宜温度为20-30℃，其中在25℃时萌发率最高；适宜相对湿度为90％以上，在饱和湿度和水滴中的萌发率最高，为72.35％。孢子萌发后可产生芽管，芽管与寄主表面接触后顶端膨胀形成附着胞附着于寄主表面，从附着胞的下方产生菌丝通过细胞间隙对寄主细胞进行侵染。

由于未成熟枇杷中绿原酸含量较高，同时含有的一些抑菌物质能够钝化病原菌分泌的水解酶，所以病原菌的附着胞通过皮孔侵入枇杷后不会立即产生侵入菌丝，而是埋藏在枇杷表皮或角质层内，静止休眠可达数月，表明炭疽病菌具有潜伏侵染的特性，若在田间观察到病症再进行防治已为时过晚。因此，建立一种快速、准确的枇杷炭疽病菌分子检测技术十分必要。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，根据本发明的第一方面，本发明提供一种枇杷炭疽病菌巢式PCR特异性引物，分别作为胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌的内侧引物对，以待测样品基因组DNA为模板进行两轮PCR扩增后对扩增产物进行电泳检测，通过目标片段判定供试样品是否携带胶孢炭疽菌或尖孢炭疽菌。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种枇杷炭疽菌巢式PCR特异性引物，其特征在于：所述枇杷炭疽菌为枇杷胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)或枇杷尖孢炭疽菌(C.acutatum)；

所述枇杷胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的ITS区内侧特异性引物的上游引物Cg1F:5’-GAAGGAAGGGTCTCCGCGAC-3’；

所述枇杷胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的ITS区内侧特异性引物的下游引物Cg1R:5’-TCCTAGTGCGAGACGTAA-3’。

所述枇杷尖孢炭疽菌(C.acutatum)的ITS区内侧特异性引物的上游引物Ca1F:5’-ACCCTTTGTGACATACCTAACC-3’；

所述枇杷尖孢炭疽菌(C.acutatum)的ITS区内侧特异性引物的下游引物Ca1R:5’-GAGCCGAGTTCAACCTGTAA-3’。

本发明的一个实施方案，巢式PCR的检测过程中，

所述枇杷炭疽菌的ITS区外侧通用引物的上游引物：

ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；

所述枇杷炭疽菌的ITS区外侧通用引物的下游引物：

ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种枇杷炭疽菌巢式PCR检测方法，该方法对枇杷胶孢炭疽菌、枇杷尖孢炭疽菌基因组DNA的检测灵敏度高，特异性强，实用性好。

一种枇杷炭疽菌(胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌)巢式PCR高效检测方法，其特征在于：先提取待测样品基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，利用上述通用引物作为第一轮反应引物进行第一轮PCR扩增，然后以第一轮PCR反应产物作为第二轮PCR扩增的模板，以上述特异性引物对Cg1F/R或Ca1F/R作为第二轮PCR扩增引物进行第二轮PCR扩增，最后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，通过目标片段判定供试样品是否携带胶孢炭疽菌或尖孢炭疽菌。

上述方法中，第一轮PCR扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

上述方法中，第二轮PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。

上述方法中，若利用引物对Cg1F/R扩增出一条392bp的特异性条带，则确定所测样本为胶孢炭疽菌或被胶孢炭疽菌侵染的枇杷组织；若利用引物对Ca1F/R扩增出一条490bp的特异性条带，则确定所测样本为尖孢炭疽菌或被尖孢炭疽菌侵染的枇杷组织。

具体的说，一种枇杷炭疽菌巢式PCR检测方法，包括以下步骤：

①提取待测样品基因组DNA

采用真菌改良CTAB法提取枇杷炭疽菌(胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌)菌株、其他供试菌株的基因组DNA；采用

②第一轮PCR扩增

以第①步所获得的基因组DNA为模板，利用通用引物ITS1/ITS4作为第一轮反应引物，反应体系为：2×PCR Mastermix(含染料)(上海生工)20μL，引物ITS1和ITS4各2μL，DNA模板(50ng/mL)1μL，加dd H

③第二轮PCR扩增

取1μL第一轮PCR反应产物稀释1000倍作为第二轮PCR扩增的模板，特异性引物对Cg1F/R或Ca1F/R作为第二轮PCR扩增引物，反应体系为2×PCR Mastermix(含染料)(上海生工)20μL，引物各1μL，模板1μL，加dd H

④PCR扩增产物的检测

取10μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上检测并拍照。若利用引物对Cg1F/R扩增出一条392bp的特异性条带，则确定所测样本为胶孢炭疽菌或被胶孢炭疽菌侵染的枇杷组织；若利用引物对Ca1F/R扩增出一条490bp的特异性条带，则确定所测样本为尖孢炭疽菌或被尖孢炭疽菌侵染的枇杷组织。

根据本发明的第三方面，本发明提供上述枇杷炭疽菌巢式PCR特异性引物在枇杷炭疽菌检测中的应用，所述枇杷炭疽菌为枇杷胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)或枇杷尖孢炭疽菌(C.acutatum)。

有益效果：

本发明提供一种枇杷炭疽菌(胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌)巢式PCR特异性引物Cg1F/R和Ca1F/R，分别作为胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌的内侧引物对，以待测样品基因组DNA为模板进行两轮PCR扩增后对扩增产物进行电泳检测，通过目标片段判定供试样品是否携带胶孢炭疽菌或尖孢炭疽菌。本发明的方法对枇杷胶孢炭疽菌、枇杷尖孢炭疽菌基因组DNA的检测灵敏度高，特异性强，实用性好，可用于快速、准确和灵敏地检测枇杷叶片中微量的胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌，对枇杷炭疽病的早期诊断和精准防治具有重要意义。

本发明方法灵敏度高、特异性强、实用性好，具体体现为：

(1)灵敏度高：通过倍比稀释DNA标准品(100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL)进行灵敏度检测，针对胶孢炭疽菌可检测到最低浓度为1pg/μL，较常规PCR提高了10

(2)特异性强：引物对Cg1F/R或Ca1F/R的凝胶电泳结果显示，枇杷上常见的21种病原菌(其中包括6种炭疽菌属真菌)和其他寄主上常见的5种病原真菌均未见扩增条带，只有胶孢炭疽菌或尖孢炭疽菌产生扩增条带。

(3)实用性好：本发明不仅可用于枇杷炭疽病潜伏期或发病初期的病害检测，还可用于枇杷炭疽菌不同种的鉴别，为枇杷炭疽病的早期诊断、及时预防、精准用药提供了技术支撑。

附图说明

图1为枇杷胶孢炭疽菌C.gloeosporioides特异性引物对Cg1F/R巢式PCR扩增结果，图中泳道M：DL1000 DNAmarker；泳道1-28：表1中所对应编号的供试菌株；29：阴性对照。

图2为枇杷胶孢炭疽菌C.gloeosporioides特异性引物对Cg1F/R常规PCR与巢式PCR灵敏度检测对比图，其中M：DL1000 DNAmarker；泳道1-7：枇杷胶孢炭疽菌基因组DNA浓度分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL。

图3为不同情况下携带胶孢炭疽菌C.gloeosporioides的枇杷组织DNA Cg1F/R扩增结果，其中M：DL1000 DNAmarker；泳道1-9为健康枇杷叶片组织DNA；泳道10-12为田间典型炭疽病样枇杷叶片DNA；泳道13-16为人工接种C.gloeosporioides但未显症枇杷叶片DNA；泳道17-18为人工接种C.gloeosporioides且显症枇杷叶片DNA；泳道19为阴性对照。

图4为枇杷尖孢炭疽菌C.acutatum特异性引物Ca1F/R nested-PCR扩增结果，图中泳道M：DL1000 DNA marker；泳道1-28：表1中所对应编号的供试菌株；29：阴性对照。

图5为枇杷尖孢炭疽菌C.acutatum特异性引物对Ca1F/R常规PCR与巢式PCR灵敏度检测对比图，其中M：DL1000 DNA marker；泳道1-12：枇杷胶孢炭疽菌基因组DNA浓度分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL、10ag/μL、1ag/μL

图6为不同情况下携带尖孢炭疽菌C.acutatum的枇杷组织DNA Ca1F/R扩增结果，其中M：DL1000 DNA marker；泳道1-9为健康枇杷叶片组织DNA；泳道10-12为田间典型炭疽病样枇杷叶片DNA；泳道13-16为人工接种C.acutatum但未显症枇杷叶片DNA；泳道17-18为人工接种C.acutatum且显症枇杷叶片DNA；泳道19为阴性对照。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明所用原料及试剂均为市售产品。

实施例1：枇杷炭疽菌PCR检测的引物特异性验证

选择枇杷上常见炭疽属菌株和其他物种上常见真菌(表1)分别对用于检测胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌的引物对Cg1F/R和Ca1F/R的特异性进行验证。

表1供试枇杷炭疽菌及其他真菌病害的病原菌菌株

具体步骤为：

(1)炭疽菌及其他供试菌株基因组DNA的提取(真菌改良CTAB法)

①将纯化的枇杷炭疽菌转接至PDA培养基上，待菌落长满整个平板后，刮取适量菌丝放入1.5mL灭菌离心管中，使用Coyote G200高通量组织研磨仪研磨菌丝至粉末；

②在研磨后的菌丝中加入500μL DNA提取液[Tris-HCl 0.2mol/L(pH 7.5)，NaCl0.5mol/L，EDTA 0.01mol/L，SDS 10g/L]中，冰上放置10min；

③加500μL氯仿/异戊醇(24:1)，充分涡旋，12000rpm离心10min，取上清液(约400μL)；

④加400μL酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)，涡旋2min；

⑤加200μL碱酚，涡旋2min，再加入200μL氯仿混合均匀(涡旋)；

⑥13000rpm离心10min，取上清液(约300μL)；

⑦加300μL氯仿/异戊醇(24:1)，充分涡旋，13000rpm离心10min；

⑧取上清液(约200μL)于1.5mL离心管中，加入预冷的无水乙醇500μL，置于-80℃下沉淀30min以上；

⑨6000rpm离心1min弃去上清液，加入300μL 75％乙醇洗涤；

⑩6000rpm离心1min弃去上清液；

(2)以菌株基因组DNA为模板，真菌通用引物对ITS1/ITS4(ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'/ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')作为外引物，获得第一轮PCR产物。反应体系为：2×PCR Mastermix(含染料)(上海生工)20μL，引物ITS1和ITS4各2μL，DNA模板(50ng/mL)1μL，加dd H

取1μL第一轮PCR反应产物稀释1000倍作为第二轮PCR扩增的模板，以特异性引物对Cg1F/R(Cg1F:5’-GAAGGAAGGGTCTCCGCGAC-3’/Cg1R:5’-TCCTAGTGCGAGACGTAA-3’)或Ca1F/R(Ca1F:5’-ACCCTTTGTGAC ATACCTAACC-3’/Ca1R:5’-GAGCCGAGTTCAACCTGTAA-3’)为内引物，获得第二轮扩增产物。反应体系为2×PCR Mastermix(含染料)(上海生工)20μL，引物各1μL，模板1μL，加ddH2O至40μL。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。

(3)琼脂糖凝胶电泳及成像观察

取10μL扩增产物用1.2％的琼脂糖胶进行电泳检测(0.5×TBE电泳缓冲液，120V电压)，在BIO-RAD凝胶成像系统下观察是否有明亮条带并照相存档。结果显示，引物对Cg1F/R仅有胶孢炭疽菌出现一条392bp的特异性条带(图1)，引物对Ca1F/R仅有尖孢炭疽菌扩增出一条490bp的特异性条带(图4)，表明引物对Cg1F/R、Ca1F/R分别对枇杷胶孢炭疽菌、尖孢炭疽菌具有较强的特异性，可用于上述两种枇杷炭疽菌的鉴定和检测。

实施例2：枇杷炭疽菌常规PCR和巢式PCR灵敏性检测

(1)DNA标准品的制备

将胶孢炭疽菌基因组DNA以10倍浓度为一个数量级从100ng/μL稀释至1pg/μL，即100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL；将尖孢炭疽菌基因组DNA以10倍浓度为一个数量级从100ng/μL稀释至10ag/μL，即100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL、10ag/μL。

(2)常规PCR灵敏度检测

取1μL稀释标准品作为常规PCR灵敏度检测的模板，分别以Cg1F/R和Ca1F/R为引物对胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌进行常规PCR反应。反应体系为：2×PCRMastermix(含染料)(上海生工)20μL，引物各1μL，模板1μL，加dd H2O至40μL。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。

(3)巢式PCR灵敏度检测

取1μL稀释标准品作为第一轮PCR模板，真菌通用引物对ITS1/ITS4(ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'/ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')作为外引物，获得第一轮PCR产物。反应体系为：2×PCR Mastermix(含染料)(上海生工)20μL，引物ITS1和ITS4各2μL，DNA模板(50ng/mL)1μL，加dd H

取1μL第一轮PCR反应产物稀释1000倍作为第二轮PCR扩增的模板，以特异性引物对Cg1F/R(Cg1F:5’-GAAGGAAGGGTCTCCGCGAC-3’/Cg1R:5’-TCCTAGTGCGAGACGTAA-3’)或Ca1F/R(Ca1F:5’-ACCCTTTGTGACATACCTAACC-3’/Ca1R:5’-GAGCCGAGTTCAACCTGTAA-3’)为内引物，获得第二轮扩增产物。反应体系为2×PCR Mastermix(含染料)(上海生工)20μL，引物各1μL，模板1μL，加ddH2O至40μL。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。

(4)琼脂糖凝胶电泳及成像观察

取10μL扩增产物用1.2％的琼脂糖胶进行电泳检测(0.5×TBE电泳缓冲液，120V电压)，在BIO-RAD凝胶成像系统下观察是否有明亮条带并照相存档。结果显示，常规PCR能检测到枇杷胶孢炭疽菌的的基因组DNA最低浓度为1ng/μL，巢式PCR能从浓度为1pg/μL以上的模板中扩增出约392bp的特异性条带(图2)，胶孢炭疽菌对巢式PCR灵敏度较常规PCR提高了10

实施例3：不同情况下携带枇杷炭疽菌的枇杷叶片检测

(1)待检测样品制备

以枇杷胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌为研究对象，待检测样品包括四种类型：9个健康枇杷叶样、3个田间具有典型炭疽病病症的枇杷叶样、4个人工接种枇杷炭疽菌后未显症的枇杷叶样和2个人工接种枇杷炭疽菌后显症的枇杷叶样。人工接种枇杷炭疽菌的操作如下：将马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养6天的枇杷胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌用无菌水冲洗出孢子，配制成浓度为1×10

①准确称量0.5g枇杷病叶样品，使用Coyote G200高通量组织研磨仪研磨菌丝至粉末，加入1mL SLX-Mlus缓冲液，在涡旋机上充分涡旋3～5min以溶解细胞；

②加入100μLDS缓冲液，涡旋，充分混匀后，将离心管放在70℃水浴锅中孵育10min，水浴过程中颠倒离心管数次以充分混合样品。室温下，3000g离心3min；

③取800μL上清液，转移至一个新的2mL离心管中，加入270μL P2缓冲液，涡旋，充分混匀。冰上孵育5min；

④4℃下，13000g离心5min，随后小心地将上清液转移至一个新的2mL离心管中，向离心管中加入上一步上清液0.7倍体积的异丙醇。上下颠倒离心管30min以充分混匀。4℃下，13000g离心10min；

⑤使用微量移液器小心地吸出上清液，注意不要损坏DNA。倒置离心管于干净的吸水纸上，放置1min以排出管中液体；

⑥使用微量移液器加入200μL裂解液，涡旋10sec。之后在70℃水浴锅中水浴20min，使DNA充分溶解；

⑦加入100μLHTR试剂，充分涡旋后，室温放置2min。之后将上清液转移至新的2mL离心管中；

⑧加入与上述上清液等量的XP1缓冲液，充分混匀后转入

⑨倒掉滤液后，重复上一步骤⑧；

⑩

(2)按照实例1中的步骤(2)进行巢式PCR扩增；

(3)按照实例1种的步骤(3)进行琼脂糖凝胶电泳及成像观察。结果显示，田间具有典型炭疽病的枇杷叶样、人工接种胶孢炭疽菌(图3)或尖孢炭疽菌(图6)显症或未显症枇杷叶样扩增出一条大392bp或490bp的条带，而健康叶片和阴性对照(ddH2O)均未能扩增出任何条带(图3、图6)。表明本发明所涉及的引物可用于检测携带微量胶孢炭疽菌或尖孢炭疽菌的枇杷叶样。