一种花青苷调控蛋白JrMYB10及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及花青苷基因蛋白技术领域，特别涉及一种花青苷调控蛋白JrMYB10及其编码基因和应用。

背景技术

“医食同源”是发展方向。核桃（

中国也是世界核桃起源中心之一，种质资源相当丰富，其中就包括红核桃,主要分布于我国河南修武县、北京门头沟区、四川广源县、陕西城固县等地；其典型的生物学性状为嫩芽、叶片、枝条、核桃青皮和核仁种皮均为红色，不仅遗传多样性丰富，而且富含花青苷等功能、保健成分，是核桃育种中稀有而珍贵的资源。

花青苷( Anthocyanin) 属黄酮类化合物，由花青素( Anthocyanidin) 和糖类(Saccharides) 通过形成糖苷键合成。花青苷作为天然色素，广泛分布于植物多种组织器官中，是使植物组织呈黄、红、紫、蓝和黑( 深紫) 等多种颜色的重要色素。花青苷同时也具有抗癌、抗炎等药用及保健作用，并广泛应用到药、食品领域。目前在植物中已检测到上百种花青苷，而其特殊的生物学功能也吸引了科学家的关注，并提出了很多关于其功能的假说，如光保护、防辐射及植物抗逆等功能。早在1916 年，Whldale 就曾提出花青苷的合成可能是植物在强光下的一种自身保护行为，通过对光合作用的研究表明，过强光线照射下会使植物叶片中天线色素和聚光色素产生大量的质子，这些质子会对光合作用发生的类囊体有较强的伤害作用，而花青苷由于其特殊的光谱性质则可以吸收红色光谱，在植物细胞内部减弱光照的强度，这就使红色或紫色叶植物可以更适合在强光下生存。

除上述功能以外，花青苷积累也与植物繁衍后代有密切的关系，通常花青苷最易积累的部位是植物生殖器官，如花和果实，尤其是虫媒花，通常颜色非常深，这有助于被蜜蜂，蝴蝶，蜂鸟等动物识别，在采集植物花粉和花蜜的同时，也可以协助其进行传粉，而果实在被食用后，其种子也有机会被带到更远的地方，这就有利于该植物扩大自身的分布面积和范围。

因此，培育富含大量花青苷的红核桃品种意义重大。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种花青苷调控蛋白JrMYB10及其编码基因和应用，以解决背景技术中提到的技术问题。

本发明提供一种蛋白质，是如下（a1）或（a2）：

（a1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（a2）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花青苷含量相关的由序列1衍生的蛋白质。

进一步的本发明还包括编码上述蛋白质的基因。

进一步的所述基因为如下（1）或（2）或（3）：

（1）编码区序列表中序列2所示的DNA分子；

（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码与植物花青苷含量相关的蛋白质的DNA分子；

（3）与（1）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码与植物花青苷含量相关的蛋白质的DNA分子。

进一步的，所述严格条件可为用0.1×SSPE 或 0.1×SSC，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

本发明还包括包含上述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织或重组菌。

本发明还包括上述蛋白质的应用，为如下（b1）或（b2）：

（b1）调控植物的花青苷含量；

（b2）增加植物的花青苷含量。

本发明还包括上述基因的应用，为如下（b1）或（b2）：

（b1）调控植物的花青苷含量；

（b2）增加植物的花青苷含量。

进一步的，所述（b1）或（b2）中的植物为双子叶植物或单子叶植物。

本发明还包括一种培育转基因植物的方法，所述转基因植物中含有上述基因，包括如下步骤：将上述基因（1）或（2）或（3）导入出发植物，得到转基因植物，所述转基因植物的花青苷含量高于所述出发植物；

所述植物花青苷含量相关的蛋白质是如下（a1）或（a2）：

（a1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（a2）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花青苷含量相关的由序列1衍生的蛋白质。

培育转基因植物的具体方法，包括如下步骤：

（1）利用现有的双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体植物表达载体构建含有

在构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，使用翻译增强子或转录增强子，增强子的区域为ATG起始密码子或邻接区域起始密码子，其中所述翻译控制信号和起始密码子的来源为天然的或合成的。翻译起始区域来自转录起始区域或结构基因。

对所用植物表达载体进行加工或不进行任何加工，直接以表型筛选转化植株，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因，使便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选。

将pRI101真以为重组表达载体的出发载体，所述重组表达载体在pRI101载体的SalI和BamHI酶切位点之间插入序列表的序列2所示的双链DNA分子得到的重组质粒。

（2）所述

将得到的植物细胞或组织进行培养，收第一代（T1）种子后，播种培育为植株，收第二代（T2）种子，继续播种培育为纯合转基因植株。得到花青苷含量高于所述出发植物的转基因植物。

本发明的JrMYB10蛋白及其功能，可用于培育花青苷含量改变的转基因植物，在植物育种中具有重大应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例转

图2为本发明实施例转对照基因拟南芥幼苗图；

图3为本发明实施例转空载体拟南芥幼苗图；

图4为本发明实施例野生型拟南芥幼苗图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置五次重复实验，结果取平均值。

实施例1：

一种蛋白质，其特征在于：是如下（a1）或（a2）：

（a1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（a2）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花青苷含量相关的由序列1衍生的蛋白质。

编码权利要求1所述蛋白质的基因。

所述基因为如下（1）或（2）或（3）：

（1）编码区序列表中序列2所示的DNA分子；

（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码与植物花青苷含量相关的蛋白质的DNA分子；

（3）与（1）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码与植物花青苷含量相关的蛋白质的DNA分子。

所述严格条件可为用0.1×SSPE 或 0.1×SSC，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

本发明还包括含上述（1）或（2）或（3）基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织或重组菌。

本发明包括所述（a1）或（a2）蛋白质的应用，为如下（b1）或（b2）：

（b1）调控植物的花青苷含量；

（b2）增加植物的花青苷含量。

本发明还包括含上述（1）或（2）或（3）基因的应用，为如下（b1）或（b2）：

（b1）调控植物的花青苷含量；

（b2）增加植物的花青苷含量。

所述（b1）或（b2）中的植物为双子叶植物。

本发明还包括一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将基因（1）或（2）或（3）导入出发植物，得到转基因植物，所述转基因植物的花青苷含量高于所述出发植物；

所述植物花青苷含量相关的蛋白质是如下（a1）或（a2）：

（a1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（a2）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花青苷含量相关的由序列1衍生的蛋白质。

本发明还包括基因（1）或（2）或（3），蛋白质（a1）或（a2）在植物育种中的应用。

实施例2：

本发明提供了一种蛋白质，命名为JrMYB10蛋白，是如下（a1）或（a2）：

（a1）由序列表中序列1所示的氨基酸序成的蛋白质；

（a2）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花青苷含量相关的由序列1衍生的蛋白质。

该蛋白从核桃中获得。

为了使（a1）、（a2）中的JrMYB10蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

上述（a1）、（a2）中的JrMYB10蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（a1）、（a2）中的JrMYB10蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错译突变，和/或在其5´端和/或3´端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述蛋白的基因具体可为如下（1）或（2）或（3）：

（1）编码区序列表中序列2所示的DNA分子；

（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码与植物花青苷含量相关的蛋白质的DNA分子；

（3）与（1）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码与植物花青苷含量相关的蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE (或 0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有所述

利用现有的双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体植物表达载体构建含有

在构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，使用翻译增强子或转录增强子，增强子的区域为ATG起始密码子或邻接区域起始密码子，其中所述翻译控制信号和起始密码子的来源为天然的或合成的。翻译起始区域来自转录起始区域或结构基因。

对所用植物表达载体进行加工或不进行任何加工，直接以表型筛选转化植株，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因，使便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选。

将pRI101真以为重组表达载体的出发载体，所述重组表达载体在pRI101载体的SalI和BamHI酶切位点之间插入序列表的序列2所示的双链DNA分子得到的重组质粒。

本发明还包括所述JrMYB10蛋白的应用，为如下（b1）或（b2）：

（b1）调控植物的花青苷含量；

（b2）增加植物的花青苷含量。

所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

所述植物为十字花科植物。

所述植物为拟南芥属植物。

所述植物为拟南芥。

述植物为拟南芥‘哥伦比亚野生型’。

本发明还保护所述

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将所述

本发明还保护所述JrMYB10蛋白或所述

实施例3：

JrMYB10蛋白及其编码基因的获得

从红仁核桃中发现了一个新蛋白，如序列表的序列1所示，将其命名为JrMYB10蛋白。将编码JrMYB10蛋白的基因命名为

将序列表的序列3所示的蛋白质命名为对照蛋白（GENBANK ACCESSION NO. XP_018816575.1）。将对照蛋白的编码基因命名为对照基因，如序列表的序列4所示。

实施例4：构建重组质粒

1、构建重组质粒pRI101-

（1）通过化学合成法人工合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。

（2）以步骤（1）得到的DNA分子为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5’-

R1：5’-

下划线分别标注为Sal I和BamH I酶切位点。

（3）用限制性内切酶Sal I和BamH I双酶切步骤（2）得到的PCR扩增产物，回收酶切产物。

（4）用限制性内切酶Sal I和BamH I双酶切pRI101载体，回收约10kb的载体骨架。

（5）将步骤（3）的酶切产物与步骤（4）的载体骨架连接，得到重组质粒pRI101-

2、构建对照质粒

将人工合成的序列表的序列4所示的双链DNA分子取代pRI101载体的Sal I和BamHI酶切位点之间的小片段，得到对照质粒。

实施例5：JrMYB10蛋白的功能鉴定

一、转

1、将重组质粒pRI101-

2、将步骤1得到的重组农杆菌接种至30ml 含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的YEP液体培养基，28℃振荡培养至OD

3、将拟南芥已开花和结荚的剪掉，未开花的花序浸没到步骤2得到的侵染液中，室温侵染5s。

4、完成步骤3后，对植株套筒，避光、过夜培养。

5、完成步骤4后，第二天将植株移入正常生长培养箱中（22℃，光照16h），待种荚变黄、干枯后收第一代（T1）种子。

6、 T1种子用75%乙醇冲洗2min，ddH

7、培养2周左右的拟南芥幼苗转移到基质（蛭石：珍珠岩=3：1）中，浇足水分，保鲜膜覆盖4d后揭膜；继续培养至开花、结荚，待种荚变黄、干枯后收第二代（T2）种子。采用F2和R2组成的引物对T2种子进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的即为转

F2：5’-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’；

R2：5’-TCAGAAGTTAGCCAAAAAACTG-3’；

F2对应载体骨架上的35S启动子部分序列，R2对应

8、完成步骤7后，取转

二、对照拟南芥的获得

将对照质粒代替重组质粒pRI101-

将pRI101载体代替重组质粒pRI101-

三、表型鉴定

各个拟南芥幼苗的照片见图1-图4。图1为步骤一中培养15天后得到的转

四、含量鉴定

待测拟南芥幼苗分别为：步骤一中培养15天后得到的转

具体步骤如下：

1、称取0.5g待测拟南芥幼苗，加入液氮并研磨成粉末，然后加入5ml 4℃预冷的1%盐酸甲醇溶液，然后4℃避光静置浸提24h，然后8000r/min离心10min，收集上清液。

2、取1ml步骤1得到的上清液，加入4ml0.025M KCl缓冲液（pH=1.0）并混匀，然后4℃避光静置浸提15min，然后8000r/min离心10min，收集上清液。

3、取1ml步骤1得到的上清液，加入4ml0.4M NaAc缓冲液（pH=4.5）并混匀，然后4℃避光静置浸提15min，然后8000r/min离心10min，收集上清液。

4、分别取步骤2得到的上清液和步骤3得到的上清液，测定510nm和700nm下的吸光值。

花青苷含量(mg/g) =△A×5×0.005×1000×449.2/(26900×0.5)；

△A=(A

花青苷含量单位“mg/g”中的 “g”指的是拟南芥幼苗的鲜重。

进行五次重复试验，每次重复试验中每个待测拟南芥幼苗各取10份，结果取平均值。

结果见表2：转

表2 花青苷含量实验结果

上述实施例中：pRI101载体（又称“pRI101-AN DNA”）：Takala公司，Code No.3262。农杆菌LBA4404：Tiangen公司，产品目录号：CC2901。‘哥伦比亚野生型’拟南芥（

上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所做出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 山东省果树研究所

<120> 一种花青苷调控蛋白JrMYB10及其编码基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 248

<212> PRT

<213> 核桃(Juglans regia)

<400> 1

Met Glu Gly Thr Ser Leu Gly Val Arg Lys Gly Ala Trp Thr Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asp Val Leu Leu Arg Gln Cys Ile Glu Lys His Gly Glu Gly Lys

20 25 30

Trp His Gln Val Pro Leu Arg Ala Gly Leu Asn Arg Cys Arg Lys Ser

35 40 45

Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Ile Arg Ala Ile Ile Lys Arg Gly

50 55 60

Asp Phe Ala Val Asp Glu Val Asp Leu Met Ile Arg Leu His Lys Leu

65 70 75 80

Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu Pro Gly Arg Thr

85 90 95

Pro Asn Gly Val Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Gln Arg Lys Lys Pro

100 105 110

Ile Ser Pro Ile Val Asp Val Leu Glu Glu Lys Glu Gln Asn Met Ile

115 120 125

Val Lys Thr Lys Val Ile Lys Pro Arg Pro Arg Thr Phe Cys Lys Lys

130 135 140

Leu Thr Trp Leu Ser Gly Lys Pro Ser Thr Ile Ile Arg Glu Arg Thr

145 150 155 160

Leu Ile Gln Pro Lys Asp Asp Ile Ala Thr Asn Ile Met Ser Pro Thr

165 170 175

Leu Thr Pro Ser Glu Asn Arg Met Lys Tyr Arg Trp Glu Cys Leu Leu

180 185 190

Gly Ala Asn Glu Ala Gly Asp Glu Leu Ala Thr Arg Ala Leu Asn Thr

195 200 205

Gly Phe Asp Glu Glu Leu Ser Thr Thr Ile Trp Ser Asp Asp Glu Ile

210 215 220

Ala Ser Ala Ala Lys Val Gly Gly Thr Phe Asp Ile His Asp Gln Asp

225 230 235 240

Gly Phe Ser Phe Leu Ala Asn Phe

245

<210> 2

<211> 3

<212> DNA

<213> 核桃(Juglans regia)

<400> 2

<210> 3

<211> 248

<212> PRT

<213> 核桃(Juglans regia)

<400> 3

Met Glu Gly Thr Ser Leu Gly Val Arg Lys Gly Ala Trp Thr Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asp Ile Leu Leu Arg Gln Cys Ile Glu Lys His Gly Glu Gly Lys

20 25 30

Trp His Gln Val Pro Leu Arg Ala Gly Leu Asn Arg Cys Arg Lys Ser

35 40 45

Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Lys Pro Asn Ile Lys Arg Gly

50 55 60

Asp Phe Ala Val Asp Glu Val Asp Leu Met Ile Arg Leu His Lys Leu

65 70 75 80

Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu Pro Gly Arg Thr

85 90 95

Pro Asn Asp Val Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Gln Arg Lys Lys Ser

100 105 110

Ile Ser Pro Ile Val Asp Val Leu Glu Glu Lys Glu Gln Asn Met Ile

115 120 125

Val Lys Thr Lys Val Ile Lys Pro Arg Pro Arg Thr Phe Cys Lys Lys

130 135 140

Leu Thr Trp Leu Ser Gly Lys Pro Ser Thr Ile Ile Arg Glu Arg Thr

145 150 155 160

Leu Ile Gln Pro Lys Asp Asp Ile Ala Thr Asn Ile Met Ser Pro Thr

165 170 175

Leu Thr Pro Ser Glu Asn Arg Met Lys Tyr Arg Trp Glu Cys Leu Leu

180 185 190

Gly Asp Asn Glu Ala Gly Asp Glu Ile Ala Thr Arg Ala Leu Asn Thr

195 200 205

Gly Phe Asp Glu Glu Leu Ser Thr Thr Ile Trp Ser Asp Asp Glu Ile

210 215 220

Ala Ser Ala Ala Lys Val Gly Gly Thr Phe Asp Ile His Asp Gln Asp

225 230 235 240

Gly Phe Ser Phe Leu Ala Asn Phe

245

<210> 4

<211> 3

<212> DNA

<213> 核桃(Juglans regia)

<400> 4