一种超灵敏SERS免疫传感器的制备方法及其在宫颈癌血清生物标志物检测的应用

技术领域

本发明涉及一种超灵敏SERS免疫传感器的制备方法及其在宫颈癌血清生物标志物检测的应用，属于宫颈癌检测技术领域。

背景技术

宫颈癌是最常见的妇科癌症之一，对妇女的健康构成了严重威胁。宫颈癌的早期筛查和准确诊断与有效治疗密切相关，从而提高患者的生存率。但是，在早期阶段，没有典型临床症状的宫颈癌患者很难被诊断。因此，迫切需要具有高灵敏度和特异性的用于早期筛查的新型诊断工具。如今，检测技术已经取得了长足的进步，监测肿瘤标志物的变化可以筛查和诊断癌症。生存素(survivin)是凋亡蛋白家族的成员，它不仅抑制肿瘤细胞凋亡，而且还促进其增殖和侵袭的能力。骨桥蛋白(OPN)是一种分泌的糖蛋白，在各种生理和病理过程(包括肿瘤的发生和发展)中起着重要的作用。根据survivin和OPN的生物学特性，它们的血清水平在肿瘤发生过程中会发生变化，可以被认为是肿瘤筛查和诊断的生物标志物。

目前，已开发出酶联免疫吸附试验(ELISA)、比色法、化学发光免疫测定(CLIA)和局部表面等离振子共振(LSPR)来检测肿瘤标志物。尽管这些方法具有一些优势，但高成本，费时和复杂的反应条件限制了它们的临床应用。表面增强拉曼散射(SERS)是一种方便，快速且超灵敏的传感技术，由于其独特的光谱指纹图谱，在单分子水平上的高选择性和灵敏性，已被广泛用于生物标志物的定量分析。特别地，窄线宽的SERS光谱特征峰有利于同时采集不同被分析物的信号，提高检测效率并节省检测成本。Yang的小组报告了基于SERS的免疫测定的实际应用，该测定实现了对铁蛋白抗原的定量检测。Ma等研究人员开发了由Fe

拉曼信号的大幅增强是SERS技术实现高灵敏度检测的关键。目前，人们普遍认为SERS信号的放大是由于等离子体纳米材料表面等离子体共振(SPR)激发的局域电磁场增强。电磁场最强的区域称为“热点”。金属纳米颗粒之间的纳米级间隙形成强的局部电磁场，这对于获得SERS“热点”特别有益。为了获得高密度的“热点”，研究人员已经将各种形态的纳米材料组装到基底中。这些SERS基底主要分为：无序或高度有序。可重复性是定量检测方法的另一个重要因素。与无序的SERS基底相比，高度有序的SERS基底由于其出色的信号均匀性和可重复性而保证了数据的可靠性。此外，与无机物质(抗生素，农药等)的检测相比，生物标志物的检测对SERS底物的生物传感活性还有其他要求。SiO

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供基于高密度热点Au@SiO2阵列基底和Au-Ag纳米壳探针的SERS免疫传感器及其在宫颈癌血清生物标志物的超灵敏检测的应用。

本发明通过使用AuNPs@SiO

在survivin和OPN被免疫底物捕获后，添加了两个免疫探针，用于形成夹心免疫复合物。接下来，通过监测免疫传感器的SERS信号强度对这些生物标志物进行定量分析。它表现出良好的重现性，出色的灵敏度和低检测限。最后，对健康受试者和宫颈上皮内瘤样变1(CIN 1)，CIN 2，CIN 3和子宫颈癌患者血清中的survivin和OPN进行了检测，取得了与ELISA一致的结果。可想而知，这种极具吸引力的SERS免疫传感器在宫颈癌早期诊断中具有出色的临床应用。

具体的，本发明SERS免疫传感器的制备方法如下：

步骤1)血液样本的采集和处理：

血清样本分为健康人群、CIN 1、CIN 2、CIN 3和宫颈癌患者五组，在早餐前抽取5mL静脉血，在4℃下3000r/min转速离心处理10min之后，将获得的血清样本保存在-80℃下。

步骤2)免疫基底的制备：

2.1)AuNPs的合成

首先，将25mL 1mM的HAuCl

2.2)SiO

遵循溶胶-凝胶法合成SiO

2.3)亲水硅片的制备

用食人鱼溶液处理硅片以获得亲水硅片；将过氧化氢以3:7的体积比加入浓硫酸中以制备食人鱼溶液；然后，将硅片切成10×15mm的小片，浸入食人鱼溶液中30min，然后用超纯水和无水乙醇超声清洗3次；

2.4)单层SiO

单层SiO2微球阵列是通过Langmuir-Bloadgate气液界面组装方法制造的；将氯仿以2:3的体积比添加到微球悬浮液中，然后每次取5μL SiO

2.5)Au@SiO

首先，将4mL AuNPs胶体溶液和2mL己烷依次加入到烧杯中，然后逐滴添加2mL乙醇；加入乙醇后，AuNPs在油水界面形成金属光泽的薄膜；其次，利用组装好的单层SiO

2.6)抗survivin抗体和抗OPN抗体偶联的Au@SiO

将抗survivin抗体(包被)和抗OPN抗体(包被)修饰到Au@SiO

接下来，用5mL 150mM的EDC和30mM的NHS混合溶液活化了修饰在底物上的DMSA的羧基(-COOH)，反应0.5h后用PBS清洗底物；接下来，将20μL的200μg/mL抗survivin抗体(包被)和200μg/mL抗OPN抗体(包被)混合物添加到DMSA修饰的Au@SiO

步骤3)Au-AgNS的合成：

第一步，将1.5mL 0.01M的AgNO

第二步，将溶液混合物在室温下磁力搅拌15min后，将0.5mL0.05 M的NaBH

第三步，使用光输出为0.5mW cm

第四步，在室温下和磁力搅拌下，将150μL 0.3M的NaOH和5.5mL 100mM的L-AA依次添加到50mL Ag种子溶液中；接下来，将100μL 1mM的HAuCl

步骤4)Au-AgNSs免疫探针的制备：

首先，将200μL 1mM的4-ATP乙醇溶液添加到5mL Au-AgNSs溶液中，在室温下振动1h，4-ATP和Au-AgNSs之间形成了共价键；在5000r/min转速下离心5min后，弃去上清液，然后将其重新分散在5mL PBS中；然后，将50μL200μg/mL的抗survivin抗体(标记)添加到溶液中，然后添加50μL 150mM的EDC以激活抗survivin抗体的羧基(-COOH)；将获得的溶液在37℃下孵育1h，然后通过在5000r/min转速下离心5min将溶液纯化，将制备的survivinAu-AgNSs免疫探针分散在等体积的PBS溶液中；对于OPNAu-AgNSs免疫探针的制备，将200μL1mM的DTNB乙醇溶液和5mL Au-AgNSs溶液在室温下反应1h，并通过离心纯化后再分散于5mLPBS中，然后再依次加入于50μL 150mM的EDC和50μL30 mM的NHS；接下来，通过振摇1.5h使羧基(-COOH)活化，并向溶液中加入50μL200μg/mL的抗OPN抗体(标记)；最后，在37℃下孵育2h后，合成了OPNAu-AgNSs免疫探针。

宫颈癌是全世界女性癌症相关死亡的常见原因，血清肿瘤标志物的定量检测对宫颈癌的早期诊断具有实际意义。本发明提出了一种基于表面增强拉曼散射(SERS)的同时检测宫颈癌患者血清中生存素(survivin)和骨桥蛋白(OPN)的免疫传感器，该传感器由AuNPs@SiO

综上所述，本发明研制了一种由Au@SiO

附图说明

图1是用于同时检测survivin和OPN的基于SERS的免疫传感器的示意图；制备免疫基底(A)；两个免疫探针(B)；准备的SERS免疫传感器(C)用于定量分析survivin和OPN；

图2：(A)通过油水界面自组装获得的单层AuNPs；(B)通过L-B方法制备的单层SiO

图3：(A)通过在Au@SiO

图4：(A)FDTD从透视模型模拟了Au@SiO

图5：Au-AgNSs的(A)SEM图像；(B)TEM图像；(C)HRTEM图像和(D)部分放大图；(E)SAED图案和(F)STEM HAADF图像；其中(G)Au和(H)Ag元素映射；(I)Au-AgNSs的紫外可见吸收光谱和相应的数字照片；

图6每个制备步骤中SERS免疫传感器的FT-IR光谱：(A)DMSA标记的Au@SiO

图7不同种类的生物标志物样品和空白样品的SERS光谱，说明所制备的SERS免疫传感器具有选择性；

图8(A)免疫传感器检测不同浓度的survivin和OPN分散在PBS中的SERS光谱；根据不同浓度的survivin和OPN在1083cm

图9用10个不同批次的SERS免疫传感器检测同一份含有survivin和OPN的人血清样本(100ng/mL)的SERS光谱，以及每个光谱中(B)1083cm

图10(A)各组临床样本的平均SERS光谱，以及对应的(B)108cm

具体实施方式

一、制备方法

1.材料

所有材料均直接使用，无需进一步纯化。四水合氯金酸(HAuCl

2、血液样本的采集和处理

血清样本分为健康人群、CIN 1、CIN 2、CIN 3和宫颈癌患者五组，均来自扬州大学临床医学院。在志愿者早餐前抽取5mL静脉血，在4℃下3000r/min转速离心处理10min之后，将获得的血清样本保存在-80℃下。实验得到扬州大学临床医学院伦理委员会的批准，与志愿者签署了知情同意书，并根据《赫尔辛基宣言》遵循了涉及人类受试者的医学研究的道德原则。

3、免疫基底的制备

3.1、AuNPs的合成

首先，将25mL 1mM的HAuCl

3.2、SiO

遵循溶胶-凝胶法合成SiO

3.3、亲水硅片的制备

用食人鱼溶液处理硅片以获得亲水硅片。简而言之，将过氧化氢(30％)以3:7的体积比加入浓硫酸中以制备食人鱼溶液。然后，将硅片切成10×15mm的小片，浸入食人鱼溶液中30min，然后用超纯水和无水乙醇超声清洗3次。

3.4、单层SiO

单层SiO

3.5、Au@SiO

首先，将4mL AuNPs胶体溶液和2mL己烷依次加入到烧杯中，然后逐滴添加2mL乙醇。加入乙醇后，AuNPs在油水界面形成金属光泽的薄膜。其次，利用组装好的单层SiO

3.6、抗survivin抗体和抗OPN抗体偶联的Au@SiO

将抗survivin抗体(包被)和抗OPN抗体(包被)修饰到Au@SiO

4、Au-AgNS的合成

Au-AgNSs的合成分为四个步骤。

第一步，将1.5mL 0.01M的AgNO

第二步，将溶液混合物在室温下磁力搅拌15min后，将0.5mL0.05 M的NaBH

第三步，使用光输出为0.5mW cm

第四步，在室温下和磁力搅拌下，将150μL 0.3M的NaOH和5.5mL 100mM的L-AA依次添加到50mL Ag种子溶液中。接下来，将100μL 1mM的HAuCl

5、Au-AgNSs免疫探针的制备

首先，将200μL 1mM的4-ATP乙醇溶液添加到5mL Au-AgNSs溶液中，在室温下振动1h，4-ATP和Au-AgNSs之间形成了共价键。在5000r/min转速下离心5min后，弃去上清液，然后将其重新分散在5mL PBS中。然后，将50μL200μg/mL的抗survivin抗体(标记)添加到溶液中，然后添加50μL 150mM的EDC以激活抗survivin抗体的羧基(-COOH)。将获得的溶液在37℃下孵育1h，然后通过在5000r/min转速下离心5min将溶液纯化，将制备的survivinAu-AgNSs免疫探针分散在等体积的PBS溶液中。对于OPNAu-AgNSs免疫探针的制备，将200μL1mM的DTNB乙醇溶液和5mL Au-AgNSs溶液在室温下反应1h，并通过离心纯化后再分散于5mLPBS中，然后再依次加入于50μL 150mM的EDC和50μL30 mM的NHS。接下来，通过振摇1.5h使羧基(-COOH)活化，并向溶液中加入50μL200μg/mL的抗OPN抗体(标记)。最后，在37℃下孵育2h后，合成了OPNAu-AgNSs免疫探针。

6、同时检测

survivin和OPN的检测过程如下：首先，将20μL包含survivin和OPN的抗原溶液添加到制备的免疫基底上，并在37℃下孵育1h。接下来，滴加包含10μL survivinAu-AgNSs免疫探针和10μLOPNAu-AgNSs免疫探针的混合溶液，并在37℃下继续反应1h。用PBS溶液冲洗掉过量的反应物之后，进行SERS测量。

7、表征

使用紫外-可见分光光度计(Cary UV-5000，Agilent，美国)监测纳米材料的紫外可见吸收光谱。傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析在显微镜红外光谱仪(Cary 610/670，Varian，美国)进行。采用透射电镜(Tecnai 12，Philips，荷兰)和场发射扫描电镜(FESEM)(S-4800Ⅱ，Hitachi，日本)观察纳米材料的形貌和结构。采用S-twin透射电镜(Tecnai G2F30,FEI,美国)对纳米材料进行选区电子衍射(SAED)图像和高分辨率透射电镜(HRTEM)图像测量。雷尼绍拉曼光谱仪在785nm激发波长下，使用50×物镜，5mw激光功率，10s采集时间，在室温下测量样品的SERS光谱。

8、时域有限差分(FDTD)模拟

Lumerical Solutions公司的FDTD模拟软件(8.9版本)用于模拟电磁场分布和增强Au@SiO

二、本发明优势

1、Au@SiO

图1A生动地展示了金阵列基底薄膜的制作过程。当正己烷加入AuNPs溶液时，由于密度差形成了油水界面，乙醇的加入降低了AuNPs的表面电荷密度，促使其在油水界面上自组装形成单层AuNPs膜。图2A为AuNPs薄膜的数码照片和SEM图像。在这张数码照片中，可以清楚地看到位于油水界面上的均匀Au薄膜。从SEM图像可以看出，Au膜由形貌均匀，直径约为20nm的AuNPs排列，AuNPs之间的小间隙有利于SERS性能的提高。图2B为L-B方法组装的基片的SEM图像和光学照片。在亲水硅片上有序排列直径约为450nm的SiO

除了出色的增强性能外，还需要基材的均匀性和稳定性。因此，在40×40μm

2、FDTD模拟

为了确认在线性偏振光束的照射下所制备的Au@SiO

3、Au-AgNS的表征

图5给出了合成的Au-AgNS的组成和结构特征。如SEM图像所示(图5A)，制备了具有完整结构和相对均匀的形态的Au-AgNS。从TEM图像可以更清楚地观察到Au-AgNSs的粒径约为40nm，具有光滑表面和致密壁的中空结构，如图5B所示。图5C中的HRTEM图像显示了Au-AgNS的更多细节，进一步证实了中空特征。壳层的厚度约为5nm，这有利于增强SPR效果。图5D是HRTEM图像的局部放大图，并且清晰可见具有0.232nm节距的晶格结构。如图5E所示，SAED图案中的明亮衍射环分别对应于{111}，{200}，{220}和{311}平面，表明所制备的Au-AgNSs是多晶的。STEM-HAADF图像从另一个角度证实了Au-AgNSs是一种特殊的中空壳结构，如图5F所示。此外，测量Au-AgNS的元素映射可以更直观地了解Au和Ag的分布。图5G和5H示出了Au和Ag的元素映射。Au和Ag元素的无规分布形成了结构和化学上稳定的合金结构，进一步证实了Au-AgNS的合成。这种合金结构不仅具有良好的热力学稳定性，而且具有很强的SERS活性。如图5I所示，Au-AgNSs溶液在可见光范围内为深蓝色，相应的UV-vis吸收光谱在612nm处具有最强的吸收峰。以上结果表明成功制备了均质的Au-AgNSs。

4、SERS免疫传感器的FT-IR表征

材料表面的化学键和官能团在FT-IR光谱中具有相应的吸收峰，并通过FT-IR对SERS免疫传感器的制备过程进行了表征。在免疫传感器的制备过程中，通过洗涤避免了多余试剂(EDC，NSH等)的干扰。DMSA具有巯基和羧基，并且不具有拉曼信号，这是制备免疫底物的不错选择。图6A是通过巯基基团偶联到Au@SiO

5、SERS免疫传感器的选择性

在检测真实样本的过程中，由于存在其他生物标志物，SERS免疫传感器对靶标的精确识别就显得尤为重要，其良好的选择性可以避免假阳性的发生。免疫底物捕获抗原后，加入免疫探针形成三明治免疫复合物，通过监测探针中4-ATP和DTNB的SERS信号来检测抗原的含量。检测相同浓度(1μg/mL)的CEA、APF、survivin、OPN和survivin/OPN样品，空白样品作为对照。对应的光谱如图7所示，可以清楚地看到，只有含有survivin(1083cm

6、在PBS和人血清中同时检测survivin和OPN

将survivin和OPN溶解的PBS溶液不断稀释，得到浓度梯度为1pg/mL至1μg/mL的样品。图8A为不同浓度样品经过5次SERS免疫传感器检测后的平均SERS光谱。结果表明，SERS信号随着survivin和OPN浓度的降低而降低，空白样本的微弱信号可以忽略。剂量反应曲线更直观地说明SERS信号强度与survivin(1083cm

为了验证其实际应用能力，我们使用SERS免疫传感器对含有不同浓度survivin和OPN的人体血清样本进行分析。同样，将survivin和OPN溶解于空白人血清中，然后连续稀释，得到浓度梯度为1pg/mL～1μg/mL的样品。图8D所示为每种类型样本进行5次测量的平均光谱，同样，在空白人血清中，随着survivin和OPN浓度的降低，所测量的SERS信号也随之减弱。图8E和图8F分别为空白人血清中survivin和OPN对应的剂量反应曲线，线性回归方程分别为：y＝23250.310+1876.532x,y＝26556.096+2142.8933x,R

此外，通过10个不同批次的SERS免疫传感器检测同一样品来评估其重复性。图9A显示了survivin和OPN浓度为100ng/mL的人血清样本的光谱。不同光谱的峰形没有明显差异，峰强也相似。为了更直观地理解SERS信号的波动,图9B和图9C分别给出了各频谱在1083cm

7、临床应用

通过对临床血清样本的分析，进一步验证了构建的SERS免疫传感器的实际操作性能。图10A显示了40名健康受试者、38名CIN 1、35名CIN 2、33名CIN 3和35名宫颈癌患者的血清样本的平均SERS光谱。每个光谱的特征峰分别为1083cm

表1临床样本中survivin和OPN的平均血清水平。

三、结论

综上所述，本发明研制了一种由Au@SiO