同时测定鱼肉中十六种全氟烷基化合物的方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种超高效液相色谱-高分辨质谱法同时测定鱼肉中16种全氟烷基化合物。

背景技术

全氟烷基化合物(Perfluorinated alkylated substances，PFASs)是一类人工合成的具有多种应用价值的含氟有机物，因其良好的化学稳定性、耐热性、疏水疏油性及高表面活性等特性，被广泛应用于纺织品、皮革保护剂、纸张涂料、农药和灭火泡沫等领域。随着PFASs的大规模生产和使用，排放到自然环境中的PFASs逐年增多，水、底泥等环境介质和生物体中均检出PFASs。研究表明，PFASs可通过食物链逐级放大并蓄积在人或动物体内，从而产生多种毒性效应，甚至可导致器官衰竭或癌变。2009年，全氟辛烷磺酸及其盐类、全氟辛基磺酰氟均被列入斯德哥尔摩公约附件B中，并限制其在全球范围内使用。鱼及其它水产品是人类膳食的重要组成部分，据报道，当人类食用被PFASs污染的鱼后，血液中PFASs的浓度含量明显增加，对人体健康构成潜在威胁。2010年欧盟委员会发布2010/161/EU号议案，建议开展鱼、肉等各类动物源性食品中PFASs的监测行动。因此，建立快速、灵敏、准确地测定鱼肉中多种PFASs的分析方法，可积极推进此项监测工作。

目前，检测PFASs的方法主要有酶联免疫法(ELISA)、荧光光谱法、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等。其中LC-MS/MS法，具有灵敏度高、重现性好、抗干扰性强等特点，是目前分析PFASs的主要检测技术。近年来迅速发展起来的液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)技术，其分辨率可达140000，能获取目标物的精确质量数，且质量偏差在0.1～1.0×10

鱼肉样品基质具有蛋白质含量高、脂肪和磷脂等杂质干扰多的特点，快速高效的前处理是实现准确分析的关键。目前，对鱼肉中PFASs多残留检测的前处理方法主要有碱消解法、离子对萃取法、固相萃取法、和QuEChERS法等。碱消解法，主要通过加入NaOH溶液进行消解，其过程与酶解类似，耗时长；离子对萃取法是使用离子对试剂结合甲基叔丁基醚进行震荡提取，该方法需剧烈振荡1h才能将离子对试剂充分离子化，分析时间长，通量低；固相萃取法作为传统的分析技术，采用固相萃取装置结合WAX固相萃取柱可有效去除鱼肉蛋白质、磷脂等物质，但方法操作繁琐、耗时且成本高；QuEChERS方法，最初由美国农业部Anastassiades教授开发的用于检测农产品中农药残留的前处理技术，该方法具有简单、快速、高效、绿色等优点，现已广泛应用于其他污染物的痕量分析。基于QuEChERS法改良优化的快速滤过型净化法(m-PFC)，是一种通过式净化法，样品提取液可直接通过净化柱实现一步净化。其净化柱是由一定比例的十八烷基硅烷键合硅胶(C

发明内容

为克服现有技术存在的问题，本申请提供一种鱼肉中16种PFASs的快速分析的新方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种超高效液相色谱-高分辨质谱法同时测定鱼肉中十六种全氟烷基化合物的方法，包括如下步骤：

取鱼样肌肉组织进行匀浆，准确称取2.0g匀浆样品于50mL聚丙烯离心管中，加入5mL超纯水，振荡摇匀，静置5min；加入10mL体积比为1：100的甲酸：乙腈混合溶液，涡旋混匀1min，超声提取8min；加入萃取盐包，剧烈振荡3min，以5000r/min冷冻离心8min；移取5mL上清液直接加载至通过式m-PFC固相萃取柱上，缓慢推动助推杆收集全部流出液；将收集的流出液在40℃下水浴氮吹至1mL，吸取1mL浓缩液，过0.22μm尼龙有机相针式滤器后得到待测液；

利用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS对待测液进行分析，具体参数如下：

色谱柱：50mm×2.1mm，1.7μm的C

质谱条件：加热电喷雾离子源；毛细管温度：350℃；离子传输管温度：325℃；喷雾电压：3.2kV；S-lens RF电压：60V；鞘气流速：35arb；辅助气流速：10arb；碰撞裂解气：纯度99％高纯氮气；扫描模式：Full MS/dd-MS

进一步地，检出限为0.015～0.05μg/kg。

进一步地，定量限为0.05～0.15μg/kg。

进一步地，十六种PFASs的平均回收率在70.7％～110.1％之间。

进一步地，相对标准偏差在0.5％～12.8％之间。

本申请的超高效液相色谱-高分辨质谱法同时测定鱼肉中十六种全氟烷基化合物的方法的有益效果是：

本研究针对鱼肉样品高蛋白和高脂肪等特点，采用快速滤过净化法(m-PFC)结合超高效-四极杆-静电场离子轨道阱高分辨质谱(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS)快速、精准和高灵敏度的技术优势，通过优化前处理条件，建立了同时测定鱼肉中16种PFASs的快速分析方法。方法成功应用于实际鱼肉样品中PFASs的多残留分析，在13min内即可完成目标物的检测分析，检出水平处于μg/kg级别。该方法具有分析速度快、灵敏高、准确性高等优点，为鱼肉中多种PFASs的快速定量分析提供了新的解决方案，具有较强的实用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请实施例提供的一种16种标准溶液的提取离子流图；

图2为本申请实施例提供的一种不同浓度的甲酸-乙腈溶液对目标物回收率的影响(n＝3)；

图3为本申请实施例提供的一种不同体积的超纯水浸泡对目标物回收率的影响(n＝3)；

图4为本申请实施例提供的一种鲫鱼阳性样品中PFOS的一级(A)和二级质谱图(B)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1实验部分

1.1仪器与试剂

DionexUltiMate3000超高效液相色谱及Q Exactive Plus四极杆-静电场离子轨道阱高分辨质谱(美国Thermo-Fisher公司)；ST16R型高速冷冻离心机(美国Thermo-Fisher公司)；N-EVAP-111氮吹仪(美国Organomation公司)；Vortex-Genie2型涡旋混合器(美国Scientific Industries公司)；BSA124S型电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；SimplicityUV便携型超纯水机(美国Millipore公司)；0.22μm尼龙有机相针式滤器(上海安谱实验科技有限公司)；通过式m-PFC固相萃取柱(350mg MgSO

16种标准物质：全氟丁酸(PFBA，98％)、全氟戊酸(PFPeA，98％)、全氟己酸(PFHxA，98％)、全氟庚酸(PFHpA，98％)、全氟辛酸(PFOA，98％)、全氟壬酸(PFNA，95％)、全氟葵酸(PFDA，97％)、全氟十一酸(PFUnDA，94.5％)、全氟十二酸(PFDoDA，93％)、全氟十三酸(PFTriDA，96.5％)、全氟十四酸(PFTeDA，95％)、全氟丁烷磺酸(PFBS，98％)、全氟己烷磺酸(PFHxS，98％)、全氟庚烷磺酸(PFHpS，98％)、全氟辛烷磺酸(PFOS，98％)、全氟葵烷磺酸(PFDS，98％)，均购自上海安谱实验科技有限公司；9种PFASs内标混合物(纯度为99％，加拿大Wellington实验室)。

乙腈、甲醇、甲酸、乙酸铵(色谱纯，美国Fisher公司)；萃取盐包(4g Na

1.2标准溶液的配制

内标标准储备液：用甲醇作为稀释溶剂，将9种PFASs内标混合物(MPFAC-MXA)的混合标准溶液(质量浓度为2.0μg/mL)配制成100.0μg/L的内标标准溶液，并逐步稀释，配制成10.0μg/L内标储备液，于4℃密封贮存。

混合标准工作液：用甲醇作为稀释溶剂，将16种目标化合物的标准溶液(质量浓度为50.0μg/mL)配制成1.0μg/mL的混合标准溶液，并逐级稀释配制成质量浓度分别为0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0μg/L的16种PFASs混合标准工作液，其内标的质量浓度均为2.0μg/L，现配现用。

1.3样品前处理

将市售鲫鱼(体重：361.1g；体长：29.0cm)鱼样用超纯水洗净后，沿背脊两侧解剖，取出肌肉组织进行匀浆，混匀后包裹至铝箔纸中放入冰箱冷藏保存，以备分析用。准确称取2.0g匀浆样品于50mL聚丙烯离心管中，加入5mL超纯水，振荡摇匀，静置5min；加入10mL含1％(V/V)甲酸的乙腈溶液，涡旋混匀1min，超声提取8min；加入萃取盐包，剧烈振荡3min，以5000r/min冷冻离心8min；移取5mL上清液直接加载至通过式m-PFC固相萃取柱上，缓慢推动助推杆收集全部流出液；将收集的流出液在40℃下水浴氮吹至1mL，吸取1mL浓缩液，过0.22μm尼龙有机相针式滤器后，供UHPLC-Q-Orbitrap HRMS检测分析。

1.4液相色谱-串联质谱分析条件

色谱柱：Acquity Waters BEH C

质谱条件：加热电喷雾离子源(HESI)；毛细管温度：350℃；离子传输管温度：325℃；喷雾电压：3.2kV；S-lens RF电压：60V；鞘气流速：35arb；辅助气流速：10arb；碰撞裂解气：高纯氮气(纯度99％)；扫描模式：Full MS/dd-MS

表1 16种PFASs及9种内标的质谱分析参数

PFBA：全氟丁酸(Perfluoro-n-butanoic acid)；PFPEA：全氟戊酸(Perfluoro-n-pentanoic acid)；PFHxA：全氟已酸(Perfluoro-n-hexanoic acid)；PFHpA：全氟庚酸(Perfluoro-n-heptanoic acid)；PFOA：全氟辛酸(Perfluoro-n-octanoic acid)；PFNA：全氟壬酸(Perfluoro-n-nonanoic acid)；PFDA：全氟葵酸(Perfluoro-n-decanoic acid)；PFUNDA：全氟十一酸(Perfluoro-n-undecanoic acid)；PFDoDA：全氟十二酸(Perfluoro-n-dodecanoic acid)；PFTriDA：全氟十三酸(Perfluoro-n-tridecanoic acid)；PFTeDA：全氟十四酸(Perfluoro-n-tetradecanoic acid)；PFBS：全氟丁烷磺酸(Perfluoro-1-butanesulfonic acid)；PFHxS：全氟己烷磺酸(Perfluoro-1-hexanesulfonic acid)；PFHpS：全氟庚烷磺酸(Perfluoro-1-heptanesulfonic acid)；PFOS：全氟辛烷磺酸(Perfluoro-1-octanesulfonic acid)；PFDS：全氟葵烷磺酸(Perfluoro-1-decanesulfonic acid)；MPFBA：1，2，3，4-

2结果与讨论

2.1质谱条件的优化

采用Full MS/dd-MS

2.2色谱条件的优化

PFASs既有疏水性，又有亲水性，故采用较低硅羟基活性填料的C

2.3前处理条件优化

2.3.1提取溶剂的选择

16种PFASs的理化性质差异较大，如PFBA的lgK

2.3.2加水量优化

快速滤过型净化法是基于传统QuEChERS方法改良优化的通过式净化法。在现行有效的QuEChERS方法中显示加入一定量的超纯水浸泡对目标物的回收率具有促进作用，但加水量过量则会导致一些水溶性杂质析出，影响净化效果。所以实验考察了加入不同体积(0、5、10mL)的超纯水浸泡对各目标物回收率的影响，结果见图3。加入5mL超纯水浸泡时，目标物的提取效率高，且各目标物在70.0％～120.0％的回收情况高于其余两组。因此，选择5mL超纯水为最终加水量。

2.3.3净化方式的选择

鱼肉样品中蛋白、磷脂含量丰富。在前处理过程中，净化除脂效果不仅影响目标物的准确分析，还会造成色谱柱堵塞。据报道，采用传统WAX固相萃取柱对鱼肉基质净化效果较好，但活化、淋洗及洗脱等多个步骤使得操作繁琐、耗时。相比之下，本实验选择通过式固相萃取方法对样品净化，为获得最佳净化效果，对比了Oasis HLB Prime和m-PFC两种不同类型的通过式固相萃取柱对样品的净化效果和各目标物回收率的影响。结果表明，采用Oasis HLB Prime通过式固相萃取柱净化样品时，所得净化液在浓缩过程中有少量脂质析出，且长链PFASs的回收率低于60％。而通过式m-PFC固相萃取柱是由C

2.4方法的线性范围与检出限

采用纯甲醇配制一系列的混合标准工作溶液，以内标法进行定量分析，在优化的仪器条件下进行测定。以各待测物和内标物的色谱峰面积比值为纵坐标，对应的质量浓度为横坐标，进行线性回归分析，所得的线性方程、线性范围及相关系数，结果见表2。16种PFASs在0.10～20.0μg/L浓度范围内线性关系良好，相关系数(R

表216种PFASs的线性范围、线性方程、检出限和定量限

2.5回收率与精密度

选取市售鲫鱼的肌肉组织进行低、中、高的加标回收和精密度实验(n＝3)。分别在样品中添加了浓度水平相当于0.50、2.0、5.0μg/kg的混合标准溶液进行测定，每个水平重复3次，以考察方法的精密度。同时做基质空白和流程空白实验，扣除实验基底值后，计算其加标回收率和相对标准偏差RSD，结果见表3。在加标浓度范围内，16种PFASs的平均回收率在70.7％～110.1％之间，相对标准偏差(RSD)在0.5％～12.8％之间。回收率、精密度均满足实际样品分析要求，可用于鱼肉样品中16种PFASs的定量分析检测。

表3方法的加标回收率和相对标准偏差

2.6实际样品分析

采用该方法对2020年5月采自贵州草海湖泊的25份野生鱼(包括鲫鱼、黄黝鱼、鰕虎)进行分析测定，结果见表4。在16种目标化合物中，3种短链PFASs及7种中长链PFASs均被不同程度检出。其中PFHxA、PFHpA这2种物质虽检出，但含量低于定量限。在以上检出PFASs中，检出浓度最高的物质是PFOS，残留浓度最大值为1.424μg/kg，出现在鲫鱼体内，总体含量范围为0.019～1.424μg/kg。与珠江三角洲河流(鱼肉PFOS：0.03～79.0μg/kg)

表4鱼肉中PFASs的检测结果

本申请建立了快速滤过型净化(m-PFC)结合UHPLC-Q-Orbitrap HRMS法同时测定鱼肉中16种PFASs的方法。样品经1％甲酸-乙腈溶液超声提取、通过式m-PFC固相萃取柱净化，有效去除了鱼肉中蛋白质、磷脂等干扰物质。方法简单快速、净化效果好，且整个进样分析在13min内即可完成，大幅度提高了样品分析效率。同时采用高分辨质谱检测最大程度地减少了基质共流出物干扰，显著提高了目标物定性和定量结果的准确性。本方法具有操作简捷、精准高效、高通量等特点，可以满足批量鱼肉样品中PFASs定量分析和定性筛查的需要，为鱼肉中全氟烷基化合物的快速分析提供了又一技术方案。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。