一种食品中敌草快的前处理方法及残留量检测方法

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种食品中敌草快的前处理方法及残留量检测方法。

背景技术

敌草快是一种应用广泛的水生杂草除草剂，可迅速被绿色植物组织吸收，与土壤接触后很快失去活性。近年来，敌草快作为百草枯的替代品大量出现在市场上，对人体的伤害也非常大，敌草快为碱性阳离子有机化合物，在低pH范围下(pH≤3)已完全电离，成为高度溶剂化、纸质化的阳离子，几乎不能被憎水性的反相柱保留，由于和残留的硅羟基的二级相互作用色谱峰严重拖尾，所以这类化合物是反相液相色谱法的一个难题。因此，建立一种灵敏、快速、高效、可靠定性定量检测方法是十分重要的。

目前，在敌草快的测定方法中，主要采用两种标准方法，SN/T 0293-2014标准适用于大米、大豆、小麦、苹果、香蕉等基质，甲醇-盐酸溶液匀浆提取，经弱酸性阳离子交换固相萃取柱净化后，采用Hilic色谱柱，用甲酸水-乙腈体系作为流动相，用液相色谱串联质谱测试，外标法定量。GB/T 5009.221-2008仅适用于玉米和大麦基质，95％乙醇提取敌草快，与硼氢化钠反应后，用三氯甲烷萃取，除去三氯甲烷，以正己烷定容，采用HP-5MS柱，气相色谱-质谱检测器测定，外标法定量。但是这两个标准中针对的基质范围均太窄，并且在实验操作过程中存在问题。GB/T 5009.221-2008由于标准品和样品都需要衍生化，且步骤多而繁琐，实际操作中很难控制实验过程的稳定性，对于方法的定性以及定量都带来很大的难度。SN/T 0293-2014，在实际应用中，对于复杂基质，如脱水蒜粒、葡萄干、枸杞、辣椒粉等干物和含糖量较高的基质结果不理想，干扰强，无法准确定量。

上述现有标准的前处理方法，无法测试含糖量高、含蛋白高的复杂基质样品，例如枸杞、葡萄干、脱水蔬菜、辣椒、蛋白粉等干扰严重，质控差，无法定性定量。而针对简单基质，例如果汁、油、液态奶等，也同样需要衍生、反复萃取(GB/T 5009.221-2008：1次衍生，2次抽滤、2次旋蒸、多次萃取、2次反萃)以及匀浆、过柱净化(SN/T 0293-2014：匀浆提取2次，调pH后过柱净化)的复杂流程，操作繁琐。另外，现有技术还没有使用反相色谱柱的液相进行测定的方法。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了一种食品中敌草快的前处理方法及残留量检测方法，采用一种全新的前处理方法和仪器方法测定食品中敌草快的残留量。采用本发明方法，测试基质不受限制，针对粮谷类、含糖量较高基质等复杂基质以及新鲜水果、蔬菜等简单基质都有不同的前处理方式。解决了现有标准中方法抗干扰性差，质控差，无法准确定性和定量的问题，同时节省了人员操作时间。该方法也有效的解决了敌草快在反相液相色谱上无保留的问题，使测试方法可以准确定性定量，更加快捷、灵敏，提高了检测效率。

本发明的技术方案是：

一种食品中敌草快的前处理方法，适于食品类各种基质，基质适用范围不受限制，包括以下三种操作方法：

方法一，硫酸回流法，对高含糖量、高蛋白等复杂基质利用硫酸回流法可以显著降低干扰物，可准确定性定量；其具体步骤包括：

(1)向样品中加入25％硫酸溶液，混匀，加热100℃回流2.5～3.5h；待冷却后合并回流溶液并过滤；(2)取一定体积滤液，用1mol/L碳酸钠溶液调pH值至6～7，9000r/min离心2～4min；(3)过强阳离子交换柱净化，先进行柱活化，上样后采用水和甲醇依次淋洗，真空抽干，再加入1mol/L乙酸铵的25％乙腈溶液，真空抽干进行洗脱；(4)涡旋混匀后用10mmol/L乙酸铵溶液稀释1倍，过滤，待检测；

上述为全新的前处理方式，采用硫酸回流法，强阳离子交换柱净化，可以有效的去除高糖、高蛋白等复杂基质中的干扰物，降低基质效用，提高上机检测响应，可以准确定性定量，提高实验质量。

方法二，酸提取净化法，其具体步骤包括：

(a)向样品中加入含2％甲酸的50％甲醇溶液，振荡一段时间，4℃条件下9000r/min离心2～4min，取上清液过滤，待净化；

(b)过强阳离子交换柱净化，先进行柱活化，上样后采用水和甲醇依次淋洗，真空抽干，再加入1mol/L乙酸铵的25％乙腈溶液，真空抽干进行洗脱；

(c)涡旋混匀后用10mmol/L乙酸铵溶液稀释5倍，过滤，待检测；

方法三，直接提取法，针对简单基质，简化前处理流程，可提高检测效率；其具体步骤包括：向样品中加入含2％甲酸的50％甲醇溶液，振荡一段时间，4℃条件下9000r/min离心2～4min，取上清液过0.22μm滤膜，待检测。直接提取法通过简化前处理流程，极大的提高了简单基质的处理效率，并且不再使用固相萃取柱净化，大大降低了成本。

上述几种前处理方法中，仅需要10mL含2％甲酸的50％甲醇震荡提取，极大节省了人力，节省了耗材成本，提高产出率。

所述方法一步骤(1)中回流时间为3h；采用玻纤滤纸过滤；步骤(2)中离心时间为3min；步骤(3)中上样前的柱活化采用甲醇和水依次淋洗；步骤(4)中采用0.22μm尼龙滤膜过滤。

所述方法二步骤(a)中振荡时间为25～35min；离心时间为3min；采用0.45μm尼龙滤膜过滤；步骤(b)中上样前的柱活化采用甲醇和水依次淋洗；步骤(c)中采用0.22μm尼龙滤膜过滤。

所述方法三中振荡时间为25～35min；离心时间为3min；所述滤膜为0.22μm尼龙滤膜。

该前处理方法的基质适用范围更广，除了标准中涉及的基质，其他高糖高蛋白等复杂基质同样适用，适用于如下所列出的复杂基质及简单基质。

所述方法一适用于含糖量较高的样品或粉末样品，包括脱水蒜粒、葡萄干、枸杞、辣椒粉、坚果、紫薯粉、茶叶、蛋白粉、糖浆。

所述方法二适用于包括蔬菜、水果、浓缩果汁或奶粉类的样品前处理。

所述方法三适用于包括食用油、葡萄酒、澄清果汁类的样品前处理。

一种包括上述前处理方法的食品中敌草快残留量检测方法。

所述检测方法还包括将待测样品溶液进行高效液相色谱串联质谱法检测的步骤；

其中液相色谱的条件为：色谱柱：Agilent SB-Aq 1.8μm size 3.0×100mm或性能相当者；流动相A：0.1％甲酸-250mmoL/L乙酸铵水，流动相B：乙腈，柱温30℃，进样量10μL，流速为0.4mL/min，梯度洗脱程序见下表：

其中质谱的条件如下表所示：

本发明的有益效果：

(1)本发明提出三种不同的前处理方式，针对各类基质都有相应的处理方法，方法更全面，适用性更强，操作更有针对性，对于不同基质可以分别选择不同的前处理方法，一是避免因选择方法不当而返工，二是去除了衍生后反复萃取的繁琐操作，极大提高了产出效率。

(2)本发明采用硫酸回流的方法处理复杂基质，采用强阳离子交换柱净化，可以有效去除高糖、高蛋白等基质中的干扰物，降低基质效应，提高上机响应，可以准确定性定量；采用直接提取法，通过简化前处理流程，极大的提高了简单基质的处理效率，直提法中不再使用固相萃取柱净化，大大降低了成本。

(3)现有技术还没有使用反相色谱柱的液相方法，本发明在此方向上进行突破，利用AQ色谱柱，0.1％甲酸-250mmoL/L乙酸铵水-乙腈体系作为流动相，色谱峰稳定，响应较高，解决了敌草快在反相色谱柱上无保留的问题。

附图说明

图1为敌草快标准品溶液(浓度为10μg/L)谱图；

图2为辣椒粉基质样品谱图；

图3为辣椒粉基质添加样品(添加浓度为10μg/kg)谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了进一步理解本发明，将结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

采用硫酸回流法对高糖、高蛋白样品进行前处理，具体步骤如下：

(1)将脱水蒜粒、葡萄干、枸杞、辣椒粉、坚果、紫薯粉、茶叶、蛋白粉、糖浆等样品切碎或捣碎后，称取4g样品于250mL平底烧瓶中，加入40mL 25％硫酸溶液，混匀，加热100℃回流3h；

(2)待烧瓶冷却至室温，用100mL水冲洗回流管，合并溶液后用玻纤滤纸过滤；

(3)取5mL滤液，用1mol/L碳酸钠溶液调pH值至6～7，9000r/min离心3min；待净化；

(4)采用5mL甲醇和5mL水依次淋洗活化强阳离子交换柱，将上述待净化的溶液全部转移至已活化的强阳离子交换柱中，依次采用10mL水和5mL甲醇淋洗，真空抽干；再准确加入2mL含1mol/L乙酸铵的25％乙腈溶液，真空抽干进行洗脱；

(5)将上述得到的样品溶液经涡旋混匀后，用10mmol/L乙酸铵溶液稀释1倍，过0.22μm尼龙滤膜，待用LCMSMS分析。

实施例2

采用酸提取净化法对蔬菜、水果、浓缩果汁、奶粉类样品进行前处理，具体步骤如下：

(1)称取2g样品于50mL离心管中，加入10mL含2％甲酸的50％甲醇溶液，振荡30min；4℃下9000r/min离心3min，取上清液过0.45μm尼龙滤膜，待净化；

(2)采用5mL甲醇和5mL水依次淋洗活化强阳离子交换柱，将上述待净化的溶液全部转移至已活化的强阳离子交换柱中，依次采用10mL水和5mL甲醇淋洗，真空抽干；再准确加入2mL含1mol/L乙酸铵的25％乙腈溶液，真空抽干进行洗脱；

(3)将上述得到的样品溶液经涡旋混匀后，用10mmol/L乙酸铵溶液稀释5倍，过0.22μm尼龙滤膜，待用LCMSMS分析。

实施例3

采用直接提取法对食用油、葡萄酒、澄清果汁类样品进行前处理，具体步骤如下：

称取2g样品于50mL离心管中，加入10mL含2％甲酸的50％甲醇溶液，振荡30min；4℃下9000r/min离心3min，取上清液过0.45μm尼龙滤膜，待上机测试。

实施例4

将上述实施例1、2、3中经过前处理的待测试样品溶液进行检测，采用高效液相色谱串联质谱法检测，液相色谱条件设置如下：

色谱柱：Agilent SB-Aq 1.8μm size 3.0×100mm或性能相当者；

柱温：30℃；

进样量：10μL；

流速：0.4mL/min；

流动相A为：0.1％甲酸-250mmoL/L乙酸铵水；

流动相B为：乙腈；

梯度洗脱程序为：

质谱条件设置为：离子源：ES，正离子模式；毛细管电压：3.0kv；喷嘴电压：0v；干燥气温度：300℃；干燥气流速：8L/min；雾化气压力：40psi；鞘流气温度：350℃；鞘流气流速：11L/min；检测器增益电压：300v。

敌草快标准溶液的配制：

(1)敌草快标准储备液(1000μg/mL)：准确称量敌草快的标准品10.0mg(精确到0.01mg)，用50％甲醇水溶液分别定容至10mL，配成浓度分别为1000μg/mL的储备液。(该溶液于-18℃以下条件下储存，有效期12个月。)

(2)标准中间液(10μg/mL)：准确移取敌草快标准储备液100μL，用50％甲醇水分别定容至10mL，配成浓度分别为10μg/mL的中间标准溶液。(该溶液于-18℃以下℃条件下储存，有效期3个月。)

(3)I级标准工作液(1μg/mL)：准确量取敌草快标准中间液100μL，用2％甲酸的50％甲醇水溶液定容至1mL，配成浓度为1μg/mL的I级标准混合工作溶液。(该溶液于0-4℃条件下储存，有效期1个周。)

(4)II级标准工作液(0.1μg/mL)：准确量取100μL敌草快I级标准混合工作液，用2％甲酸的50％甲醇水溶液定容至1mL，配成浓度为0.1μg/mL的II级标准工作溶液。(现用现配。)

(5)标准工作曲线：用10mmol/L乙酸铵溶液稀释II级标准工作液配制5点工作曲线(现用现配)，具体见下表：

结果的计算和表达：

按如下公式计算样品中目标物残留量，计算结果需扣除空白值。

式中：

X----样品中待测组分残留量，μg/kg；

C----待测组分标准工作液的浓度，μg/L；

A----样液中待测组分的峰面积；

V----样液最终定容体积，mL；

As----标准品溶液中待测组分的峰面积；

W----称样量，g。

对部分基质进行加标回收试验验证，经试验结果表明，方法一硫酸回流法对脱水蒜粒、葡萄干、枸杞、辣椒粉、坚果、紫薯粉、茶叶、蛋白粉、糖浆等高糖高蛋白含量的样品在10ug/kg～100ug/kg添加范围内的添加回收率范围为60％～110％；方法二酸提取净化法对新鲜蔬菜、水果、浓缩果汁、奶粉类等样品在10ug/kg～100ug/kg添加范围内的添加回收率范围为60％～110％；方法三直接提取法对食用油、葡萄酒、澄清果汁类样品在10ug/kg～100ug/kg添加范围内的添加回收率范围为80％～120％。

上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。