一种稳定高效生产L-异亮氨酸的发酵方法及发酵稳定剂

技术领域：

本发明涉及L-异亮氨酸发酵技术领域，特别是涉及一种稳定高效生产L-异亮氨酸的发酵方法及发酵稳定剂。

背景技术：

L-异亮氨酸又称“L-异白氨酸”，属于支链氨基酸(branched chain amino acid，BCAA)，具有多种生理功能，是合成人体激素、酶类的原料，具有促进蛋白质生成和抑制其分解的效果，在食品和医药行业具有广泛的应用及商业价值。

目前，国内已有多家企业通过发酵法进行L-异亮氨酸的生产，多家高校实验室也在开展关于L-异亮氨酸发酵工艺研究的课题。在现有L-异亮氨酸发酵工艺中，常以玉米浆、水解液或豆饼粉等作为主要氮源。如专利CN201910980511中公开发酵培养基中有10g/L玉米浆；专利CN201910134832中公开发酵培养基中含有豆粕水解液。因为，以上氮源营养丰富、价格相对低廉且原料易得，因此在发酵领域内有广泛的应用，但其一直具有质量稳定性差的缺点。以玉米浆为例，玉米浆是用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的浓缩液，含有丰富的氨基酸、还原糖、有机酸、磷、微量元素和生长因子，但受原料产地、季节、浸泡工艺等方面差异的影响，玉米浆的营养组成会有较大的波动，从而导致产酸水平的较大波动。往往此时，技术人员采用增加主要氮源用量，或添加其他更稳定氮源的方式进行改善，结果一方面增加了辅料成本，另一方面可能由于料液营养物质浓度的增加，对发酵前期菌体生长产生不利影响，甚至给后期提取带来困难。

如果能明确玉米浆、水解液或豆饼粉等氮源中，真正与L-异亮氨酸合成代谢重要相关的物质，从而有针对性的进行补充，就能起到事半功倍的效果，但目前还没有相关研究和报道。

发明内容：

为解决以上技术问题，本发明的第一个目的在于提供一种简单易行，投资少，稳定高效生产L-异亮氨酸的发酵方法。

本发明的第二个目的在于提供一种用于稳定高效生产L-异亮氨酸的发酵稳定剂。

本发明的第一个目的由如下技术方案实施：一种稳定高效生产L-异亮氨酸的发酵方法，当由于主要氮源的质量波动导致产量下降时，在发酵22-42h间，每隔1h向1L发酵液中一次性补加0.8-1.2mL的发酵稳定剂，每升所述发酵稳定剂中含有2-4g钴胺素、1-3g吡哆醇、1-3g氯化胆碱、2-4g叶酸，其余为去离子水。

进一步的，主要氮源为玉米浆、玉米浆水解液和豆饼粉中的任意一种或一种以上的组合。

本发明的第二个目的由如下技术方案实施：一种用于稳定高效生产L-异亮氨酸的发酵稳定剂，每升发酵稳定剂中含有2-4g钴胺素、1-3g吡哆醇、1-3g氯化胆碱、2-4g叶酸，其余为去离子水。

本发明主要针对以玉米浆、水解液或豆饼粉等作为主要氮源的L-异亮氨酸发酵生产，当由于主要氮源的质量波动导致产量下降时，通过增补适量主要氮源中本身含有的，与L-异亮氨酸合成代谢重要相关的营养物质，包括钴胺素、吡哆醇、氯化胆碱、叶酸，从而抵抗主要氮源质量波动的不利影响，从而弥补氮源质量波动背后，实际缺少的与L-异亮氨酸合成代谢重要相关的关键营养物，并合理优化设计钴胺素、吡哆醇、氯化胆碱、叶酸之间的配比，进而提高产量，达到稳定生产的目的。

本发明的优点：

(1)本发明方法通过在发酵22-42h间，每隔1h向1L发酵液中一次性补加0.8-1.2mL的发酵稳定剂，每升所述发酵稳定剂中含有2-4g钴胺素、1-3g吡哆醇、1-3g氯化胆碱、2-4g叶酸，从而弥补氮源质量波动背后，实际缺少的与L-异亮氨酸合成代谢重要相关的关键营养物，进而提高产量，达到稳定生产的目的，产酸水平的稳定性得到提高；50L罐水平发酵产酸稳定达到48.0g/L以上。

(2)本发明方法简单易行，投资少，但效果显著，且不需增加任何额外设备或人力投入，适合大规模工业生产。

具体实施方式：

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数也视为在本专利的范围内。

对比实验例1：

将培养好的谷氨酸棒状杆菌种子液按10％的接种量接入50L发酵罐中，初定容18L。种子所用培养基组成为：蔗糖30g/L、玉米浆60g/L、硫酸镁1.0g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、消泡剂0.2mL/L、生物素1.5mg/L、VB1 2.5mg/L，其余为水。发酵所用培养基组成为：葡萄糖50g/L、玉米浆40g/L、硫酸铵15g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、硫酸镁1.0g/L、消泡剂0.2mL/L、缬氨酸2.0g/L、蛋氨酸1.0g/L、生物素0.1mg/L、VB1 0.2mg/L，其余为水。发酵条件为：罐压0.06-0.08Mpa，通气量10-20L/min，搅拌300-600rpm，温度30-33℃，pH6.8-7.2，溶氧30-50％。

本对比实验例重复3次，每次使用不同批玉米浆，发酵结束，利用HPLC测定发酵液中的异亮氨酸含量，产酸水平见下表1。

对比实验例2：发酵22-42h间，每隔1h向1L发酵液中一次性补加1.0mL的发酵稳定剂，发酵稳定剂中含有3g/L钴胺素、2g/L吡哆醇，其余为去离子水。

将培养好的谷氨酸棒状杆菌种子液按10％的接种量接入50L发酵罐中，初定容18L。种子、发酵所用培养基组成及发酵培养条件均与对比实验例1相同。

本对比实验例重复3次，每次使用不同批玉米浆，发酵结束，利用HPLC测定发酵液中的L-异亮氨酸含量，产酸水平见下表1。

对比实验例3：发酵22-42h间，每隔1h向1L发酵液中一次性补加1.0mL的发酵稳定剂，发酵稳定剂中含有2g/L氯化胆碱、3g/L叶酸，其余为去离子水。

将培养好的谷氨酸棒状杆菌种子液按10％的接种量接入50L发酵罐中，初定容18L。种子、发酵所用培养基组成及发酵培养条件均与对比实验例1相同。

本对比实验例重复3次，每次使用不同批玉米浆，发酵结束，利用HPLC测定发酵液中的L-异亮氨酸含量，产酸水平见下表1。

对比实验例4：发酵22-42h间，每隔1h向1L发酵液中一次性补加1.0mL的发酵稳定剂，发酵稳定剂中含有2g/L吡哆醇、2g/L氯化胆碱、3g/L叶酸，其余为去离子水。

将培养好的谷氨酸棒状杆菌种子液按10％的接种量接入50L发酵罐中，初定容18L。种子、发酵所用培养基组成及发酵培养条件均与对比实验例1相同。

本对比实验例重复3次，每次使用不同批玉米浆，发酵结束，利用HPLC测定发酵液中的L-异亮氨酸含量，产酸水平见下表1。

对比实验例5：发酵22-42h间，每隔1h向1L发酵液中一次性补加1.0mL的发酵稳定剂，发酵稳定剂中含有3g/L钴胺素、2g/L吡哆醇、2g/L氯化胆碱，其余为去离子水。

将培养好的谷氨酸棒状杆菌种子液按10％的接种量接入50L发酵罐中，初定容18L。种子、发酵所用培养基组成及发酵培养条件均与对比实验例1相同。

本对比实验例重复3次，每次使用不同批玉米浆，发酵结束，利用HPLC测定发酵液中的L-异亮氨酸含量，产酸水平见下表1。

对比实验例6：发酵22-42h间，每隔1h向1L发酵液中一次性补加1.0mL的发酵稳定剂，发酵稳定剂中含有5g/L钴胺素、0.5g/L吡哆醇、2g/L氯化胆碱、3g/L叶酸，其余为去离子水。

将培养好的谷氨酸棒状杆菌种子液按10％的接种量接入50L发酵罐中，初定容18L。种子、发酵所用培养基组成及发酵培养条件均与对比实验例1相同。

本对比实验例重复3次，每次使用不同批玉米浆，发酵结束，利用HPLC测定发酵液中的L-异亮氨酸含量，产酸水平见下表1。

对比实验例7：发酵22-42h间，每隔1h向1L发酵液中一次性补加1.0mL的发酵稳定剂，发酵稳定剂中含有3g/L钴胺素、4.5g/L吡哆醇、4.5g/L氯化胆碱、3g/L叶酸，其余为去离子水。

将培养好的谷氨酸棒状杆菌种子液按10％的接种量接入50L发酵罐中，初定容18L。种子、发酵所用培养基组成及发酵培养条件均与对比实验例1相同。

本对比实验例重复3次，每次使用不同批玉米浆，发酵结束，利用HPLC测定发酵液中的L-异亮氨酸含量，产酸水平见下表1。

实施例1：一种稳定高效生产L-异亮氨酸的发酵方法，发酵22-42h间，每隔1h向1L发酵液中一次性补加0.8mL的发酵稳定剂，发酵稳定剂中含有2g/L钴胺素、1g/L吡哆醇、1g/L氯化胆碱、2g/L叶酸，其余为去离子水；

将培养好的谷氨酸棒状杆菌种子液按10％的接种量接入50L发酵罐中，初定容18L。种子、发酵所用培养基组成及发酵培养条件均与对比实验例1相同。

本实施例重复3次，每次使用不同批玉米浆，发酵结束，利用HPLC测定发酵液中的L-异亮氨酸含量，产酸水平见下表1。

实施例2：一种稳定高效生产L-异亮氨酸的发酵方法，发酵22-42h间，每隔1h向1L发酵液中一次性补加0.8mL的发酵稳定剂，发酵稳定剂中含有3g/L钴胺素、2g/L吡哆醇、2g/L氯化胆碱、3g/L叶酸，其余为去离子水；

将培养好的谷氨酸棒状杆菌种子液按10％的接种量接入50L发酵罐中，初定容18L。种子、发酵所用培养基组成及发酵培养条件均与对比实验例1相同。

本实施例重复3次，每次使用不同批玉米浆，发酵结束，利用HPLC测定发酵液中的L-异亮氨酸含量，产酸水平见下表1。

实施例3：一种稳定高效生产L-异亮氨酸的发酵方法，发酵22-42h间，每隔1h向1L发酵液中一次性补加1.0mL的发酵稳定剂，发酵稳定剂中含有3g/L钴胺素、2g/L吡哆醇、2g/L氯化胆碱、3g/L叶酸，其余为去离子水；

将培养好的谷氨酸棒状杆菌种子液按10％的接种量接入50L发酵罐中，初定容18L。种子、发酵所用培养基组成及发酵培养条件均与对比实验例1相同。

本实施例重复3次，每次使用不同批玉米浆，发酵结束，利用HPLC测定发酵液中的L-异亮氨酸含量，产酸水平见下表1。

实施例4：一种稳定高效生产L-异亮氨酸的发酵方法，发酵22-42h间，每隔1h向1L发酵液中一次性补加1.2mL的发酵稳定剂，发酵稳定剂中含有4g/L钴胺素、3g/L吡哆醇、3g/L氯化胆碱、4g/L叶酸，其余为去离子水；

将培养好的谷氨酸棒状杆菌种子液按10％的接种量接入50L发酵罐中，初定容18L。种子、发酵所用培养基组成及发酵培养条件均与对比实验例1相同。

本实施例重复3次，每次使用不同批玉米浆，发酵结束，利用HPLC测定发酵液中的L-异亮氨酸含量，产酸水平见下表1。

表1对比实验例1-7与实施例1-4产酸指标对比

由表1可知，通过在发酵22-42h间，每隔1h向1L发酵液中一次性补加0.8-1.2mL的发酵稳定剂，每升所述发酵稳定剂中含有2-4g钴胺素、1-3g吡哆醇、1-3g氯化胆碱、2-4g叶酸，实现了有针对性的补充营养，最终显著缩短了同一工艺、不同玉米浆批次间的产酸差距，同时也提高了产酸水平、降低了发酵成本，将50L罐水平发酵产酸稳定到48.0g/L以上，且当发酵22-42h间，每隔1h向1L发酵液中一次性补加1.0mL的发酵稳定剂，发酵稳定剂中含有3g/L钴胺素、2g/L吡哆醇、2g/L氯化胆碱、3g/L叶酸时，该效果最为显著。同时，由表1可以看出当发酵稳定剂中的各组分及配比设计合理才能达到提高产量，稳定生产的目的。

术语解释：

1.发酵工艺：指利用微生物菌种来积累目标产物的全过程，包括培养基配方和配置，菌种复壮、扩培、培养过程的控制，含温度、pH、溶氧等关键参数控制，以及营养补充，培养结束控制等。

2.现有发酵工艺：指公开报道或广泛公知的发酵工艺。

3.HPLC测定：高效液相色谱检测方法，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。所用的固定相为大于100um的吸附剂(硅胶、氧化铝等)。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。而高效液相色谱检测方法所用的固定相粒度小(5um-10um)、传质快、柱效高。

4.本发明采用安捷伦公司的高效液相色谱仪(Agilent Technologies 1200)进行发酵液中积累的L-异亮氨酸含量检测，具体方法如下：

4.1色谱柱：ZORBAX Eclipse-AAA柱(3.5μm，4.6×75mm)。

4.2流动相A：称取6.24g NaH

4.3流动相B：乙腈:甲醇:水＝45:45:10(V/V/V)。

4.4流速：2ml/min。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。