一种长双歧杆菌、其应用及产品

技术领域

本发明属于微生物领域，更具体地，涉及一种长双歧杆菌及其应用。

背景技术

长双歧杆菌，经过培养、过滤得到的含有多种长双歧杆菌代谢产物组分的物质，该物质含有氨基酸、脂质、多糖、腺苷、维生素、微量矿物质及维生素B群等多种活性成分，对人体温和安全，易被上皮组织，如皮肤、肠道粘膜、结膜吸收利用。这种利用生物技术获得的活性物，可帮助上皮组织对抗有害病原菌，维持微生态平衡，例如皮肤表面微生态平衡；能滋润、营养受损的上皮组织，调节其免疫力，帮助抵御外界环境和氧化压力等对皮肤造成的伤害；同时能维持水分含量，修复上皮组织的屏障功能。

然而长双歧杆菌属于严格厌氧菌，在发酵过程中菌株的生长速率较低，生产周期长，生产效率低下。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种长双歧杆菌、其应用及产品，其目的在于发现一种生长迅速的长双歧杆菌，其不但生长速度快、生长密度高，同时发酵产物同样具有良好的促进上皮组织修护的效果，由此解决现有的双歧杆菌发酵过程中生长速率第，生产周期长的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种长双歧杆菌，其其分类命名为Bifidobacterium longum 5b5d1，于2021年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2021390。

按照本发明的另一个方面，提供了所述长双歧杆菌的应用，其其应用于制备促上皮组织修复药物、食品或日用化妆品。

优选地，所述长双歧杆菌的应用，其应用于制备促复层扁平上皮组织修复药物、食品或日用化妆品。

优选地，所述长双歧杆菌的应用，其应用于制备促表皮修复药物或日用化妆品。

优选地，所述长双歧杆菌的应用，其发酵液应用于制备促上皮组织修复药物、食品或日用化妆品。

优选地，所述长双歧杆菌的应用，其所述发酵液按照如下方法制备：

将如权利要求1所述的长双歧杆菌的活化菌种按照1％-3％的接种量接种至发酵培养基中，培养14至25小时。

优选地，所述长双歧杆菌的应用，其所述发酵培养按照如下方法制备：

每5g豆粕、5g玉米、5g麸皮、2g葡萄糖、5g NaCl、以及0.5g MgSO4，采用去离子水定容至1L。

优选地，所述长双歧杆菌的应用，其所述发酵培养基以干重计含有1-3％海茴香、和/或1-3％积雪草。

按照本发明的另一个方面，提供了一种具有皮肤修复作用的化妆品，其含有如权利要求1所述长双歧杆菌的发酵液。

优选地，所述具有皮肤修复作用的化妆品，其含有质量份数在5％以上的如权利要求1所述长双歧杆菌的发酵液。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

本发明通过开放性的高通量菌种筛选，获得一株生长速率快、生长密度高的长双歧杆菌5b5d1，可减少发酵时间，缩短生产周期，同时还可提高发酵产物得率，经济利益巨大。

其发酵产物，被证实具备上皮组织修护效果，能应用包括皮肤修护制剂在内的药品、食品、化妆品的制备。

附图说明

图1是实施例1本发明提供的长双歧杆菌和长双歧杆菌R175生长曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供的长双歧杆菌，其分类命名为Bifidobacterium longum 5b5d1，于2021年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2021390。实验室培养显示，在25小时的培养周期中，长双歧杆菌5b5d1与标准株长双歧杆菌R175相比，5b5d1提前2小时进入对数生长期、提前4小时进入稳定期，稳定期的菌液密度增加了12.9％，显示长双歧杆菌5b5d1具有生长速度快、生长密度高的特点。

实验显示本发明提供的长双歧杆菌5b5d1，其发酵产物无细胞毒性，且能提高透明质酸含量，减少血管内皮生长因子引起的验证和过敏反应，增加β-内啡肽从而舒缓上皮组织敏感，综合促进上皮组织修复。角质化多层上皮组织的人群实验显示，本发明提供的长双歧杆菌发酵液具有比较明显的屏障修复功能。

本发明提供的长双歧杆菌发酵液，按照以下方法制备：

(1)菌种活化

取出保存于-80℃冰箱的长双歧杆菌甘油冻存管，置于室温融化后在无菌环境下使用接种环挑取菌种，划线接种于MRS固体平板上，37℃培养48小时，观察平板上菌落形态确认为长双歧杆菌且无污染后，挑取平板上的单菌接种至MRS液体培养基中，37℃培养24小时备用。

(2)益生菌发酵

菌种活化得到的菌液按照1％-3％的接种量接种至发酵培养基中，优选发酵培养基中加入发酵营养料，置于37℃摇床120rpm培养20小时以上；

按照如下方法制备：

每5g豆粕、5g玉米、5g麸皮、2g葡萄糖、5g NaCl、以及0.5g MgSO4，采用去离子水定容至1L。

发酵营养料(以干重计)：1-3％海茴香、和/或1-3％积雪草。

(3)发酵完成后过滤除菌，滤液即为所述长双歧杆菌发酵液。

本发明提供的长双歧杆菌发酵液可单独使用，以5％的添加量添加到乳液基质中，应用于人体皮肤表面，进行人群实验显示具有镇静皮肤、促进皮肤修护的作用。

以下为实施例：

实施例1

实验室收集得到哺乳期健康女性的乳汁样本，经无菌无氧水梯度稀释后，选择适宜梯度的稀释液涂布于MRS固体培养基，37℃厌氧培养48小时。挑取典型菌落划线于MRS固体培养基2-3次，培养得到纯菌落。经16S rDNA分子鉴定为一株长双歧杆菌，命名为长双歧杆菌5b5d1(Bifidobacterium longum 5b5d1)，该菌株已于2021年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC。

实施例2长双歧杆菌生长曲线对比

实验材料：

1、菌种：实施例1分离得到的长双歧杆菌5b5d1、长双歧杆菌(R175),从含有长双歧杆菌R175的杜邦原料分离，经16S rDNA分子鉴定为Bifidobacterium longum，命名为长双歧杆菌R175。

2、菌种培养基：MRS培养基。

生长曲线绘制步骤：

S1、菌种活化

取出保存于-80℃冰箱的长双歧杆菌甘油冻存管，置于室温融化后在无菌环境下使用接种环挑取菌种，划线接种于MRS固体平板上，37℃培养48小时，观察平板上菌落形态确认为长双歧杆菌且无污染后，挑取平板上的单菌接种至MRS液体培养基中，37℃培养24小时备用。

S2、活化好的菌液按照2％的接种量，接种至装有MRS培养基的96孔板中，每个孔200μL置入酶标仪中培养，每隔1小时检测一次OD600处吸光值，连续检测24小时。

结果如图1所示，在25小时的培养周期内，长双歧杆菌5b5d1培养5小时后进入对数生长期，13小时后进入稳定期，进入稳定期菌液的OD值稳定在0.95，而标准株长双歧杆菌R175在培养7小时后进入对数生长期，17小时后进入稳定期，进入稳定期菌液的OD值稳定在0.85。表明长双歧杆菌5b5d1的生长速度、生长密度都优于长双歧杆菌R175。

实施例2长双歧杆菌发酵液的制备

Bifidobacterium longum 5b5d1发酵液的制备：

(1)菌种活化

取出保存于-80℃冰箱的长双歧杆菌甘油冻存管，置于室温融化后在无菌环境下使用接种环挑取菌种，划线接种于MRS固体平板上，37℃培养48小时，观察平板上菌落形态确认为长双歧杆菌且无污染后，挑取平板上的单菌接种至MRS液体培养基中，37℃培养24小时备用。

(2)益生菌发酵

菌种活化得到的菌液按照1％-3％的接种量接种至发酵培养基中，优选发酵培养基中加入发酵营养料，置于37℃摇床120rpm培养20小时；

所述发酵培养按照如下方法制备：

每5g豆粕、5g玉米、5g麸皮、2g葡萄糖、5g NaCl、以及0.5g MgSO4，采用去离子水定容至1L。

发酵营养料：1-3％海茴香、和/或1-3％积雪草，具体如下表：

实施例3发酵液细胞功能评价

1、实施例2中制备的发酵液细胞毒性评价：

以3×10

实验空白组：无细胞的孔中分别加入100μL含有5％实施例2制备的长双歧杆菌发酵液A、B、C、D的DMEM(无血清)培养基

实验组：有细胞的孔中分别加入100μL含有5％实施例2制备的长双歧杆菌发酵液A、B、C、D的DMEM(无血清)培养基

对照空白组：无细胞的孔中加入100μL DMEM(无血清)培养基

对照组：有细胞的孔中加入100μL DMEM(无血清)培养基

37℃，5％CO2条件下培养24小时，吸除上清，加入100μL含有5mg/mL MTT溶液的培养基，37℃温育4小时，除去MTT溶液，加入100μL DMSO避光低速震荡10分钟，使用酶标仪上于490nm处测定吸光值。每组实验设置6个平行，结果以均值±标准差表示。

细胞相对存活率＝(实验组-实验空白组)/(对照组-对照空白组)

结果如下表所示：

根据ISO 10993-5:2009描述的毒性评价标准，细胞存活率高于70％时可定义为无细胞毒性；以上结果证实，实施例2中制备的发酵液和未接种长双歧杆菌的营养液皆无细胞毒性，可直接应用于皮肤表面。

2、实施例2中制备的发酵液对细胞透明质酸、VEGF、β-EP含量影响透明质酸含量影响实验

以3×10

实验组：每孔中分别加入100μL含有5％实施例2制备的长双歧杆菌发酵液A、B、C、D的DMEM(无血清)培养基；

对照组：每孔中加入DMEM(无血清)培养基100μL；

37℃，5％CO2条件下培养48小时，收集培养基上清，使用ELISA试剂盒检测透明质酸含量。每组实验设置6个平行，使用GraphPad 8.0.2进行统计学分析，结果以均值±标准差表示。

实验结果如下表：

注：“*”表示与对照组比较，P<0.05。

透明质酸可以改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性等功效。由表-可知，经实施例2制备的长双歧杆菌发酵液A、B、C、D处理的HSF细胞与未经处理的HSF细胞所产生的透明质酸相比较，其中实验组A、B、C、D组的透明质酸含量均有提高，A、B、C三组与对照组差异显著，D组与对照组无差异。表明海茴香与积雪草混合液可刺激HSF细胞产生透明质酸，长双歧杆菌与其混合发酵所得产物刺激HSF细胞产生透明质酸含量显著增加。VEGF(血管内皮生长因子)/β-EP(β-内啡肽)含量影响实验：

以5×10

实验组：每孔中分别加入100μL含有5％实施例2制备的长双歧杆菌发酵液A、B、C、D的DMEM(无血清)培养基；

对照组：每孔中加入DMEM(无血清)培养基100μL；

37℃，5％CO2条件下培养48小时，收集培养基上清，使用ELISA试剂盒检测VEGF(血管内皮生长因子)/β-EP(β-内啡肽)含量。每组实验设置6个平行，使用GraphPad 8.0.2进行统计学分析，结果以均值±标准差表示。

注：“*”表示与对照组比较，P<0.05。

减少VEGF可改善皮肤泛红，增加β-EP可镇静肌肤舒缓敏感。由上表可知，经实施例2制备的长双歧杆菌发酵液A、B、C、D处理的HaCat细胞与未经处理的HaCat细胞所产生的VEGF、β-EP相比较，其中实验组A、B、C、D组的VEGF含量均有减少，β-EP含量均有增加；VEGF含量A、B两组与对照组差异显著，C、D组与对照组无差异，β-EP含量A、B、C三组与对照组差异显著，D组与对照组无差异。表明海茴香与积雪草混合液可抑制HaCat细胞产生VEGF、刺激HaCat细胞产生β-EP，但效果微弱；长双歧杆菌与其混合发酵所得产物抑制HaCat细胞产生VEGF、刺激HaCat细胞产生β-EP效果显著，具有良好的减轻肌肤泛红、镇静肌肤舒缓敏感的功效。

实施例4人群实验

将实施例2制备的发酵液A按照5％加入到乳液基料中，与不加发酵液的乳液基料，应用于人体皮肤表面进行双盲测试。选择年龄19-45岁有肌肤敏感问题的受试者16人，共分为2组，每组样品受试者8人。受试者每天早晚洁面后，将乳液均匀涂抹于面部，连续使用2周，在试验期间受试者不使用其他护肤品及药物，并保持正常的作息及饮食。在试验的开始前和结束后分别对受试者皮肤进行评价。乳液基料由湖北嫦娥药业有限公司提供。

评价方式以问卷形式进行，主要包括受试者使用过程中对产品肤感、刺激性及功效评价。

结果如下表所示：

从上述实验结果可以看出，本发明提供的含有实施例2制备的长双歧杆菌发酵液A的精华液能够有效改善肌肤泛红、干燥等问题，同时修复肌肤屏障，降低皮肤敏感度，且成分天然，无刺激性，肌肤无负担，受试者满意度高。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。