靶向amyloid-beta结构的肽配基及应用

技术领域

本发明涉及一种靶向amyloid-beta结构的肽配基及应用，属于肽配基设计、药物筛选开发领域。

背景技术

随着近些年来科技的不断发展，计算机应用在生物学领域中愈发重要，而基于计算机模拟的分子对接虚拟筛选技术更是近年来亲和肽的理性设计和筛选的研究热点。该方法借力于计算机的快速运算来实现肽配基小分子在靶蛋白分子活性位点上的连续对接，这些肽配基多来源于已经准备好的虚拟肽库，然后经过和靶蛋白的虚拟对接，找到能够和靶蛋白结合的小分子肽配基，通过计算机软件计算出肽配基与靶蛋白结合的方式并打分，我们依据打分结果挑选出与靶蛋白结合较好的配体，合成后用过体外实验筛选和验证。

我国阿尔海默症(Alzheimer disease，AD)患病人数己超过900万，已经发生前期轻度认知障碍患者已超过2300万，预计到2050年患病人口将超过2000万，是世界上AD患病人口最多、增长速度最快的国家，给患者自身及家庭、社会和医疗将带来沉重负担。在60岁以上的老年人群中，年龄每增加5岁，患AD的危险约增加1.85倍。因此，由AD导致的经济负担和社会问题会日益严重，也已成为全人类共同面临的巨大挑战之一。靶向amyloid-beta结构(β-淀粉样蛋白)的过度聚集和Tau蛋白的过度磷酸化被我们认为是AD发生的两大主要假说。许多学者认为APP裂解后形成的Aβ沉积所形成的老年斑是AD发病的主要原因，因此，防止Aβ的聚集是治疗AD的一种有前景的方法。已有的研究证明，可溶性Aβ寡聚体毒性最大，主要通过影响细胞膜离子通道，产生氧化应激，激活神经胶质细胞引发炎症反应等途径。Aβ在人体中有多种存在形式，主要以Aβ

发明内容

本发明借助于计算机辅助设计，在靶向amyloid-beta晶体结构的基础上，通过分子对接虚拟筛选技术，搜寻虚拟肽配基数据库中与靶标蛋白结合模式与亲和力最佳的肽配基P2702，其序列为RERWCC。固相合成RERWCC，利用Aβ

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种靶向amyloid-beta结构的肽配基P2702，所述的肽配基P2702的序列为RERWCC。

所述的肽配基P2702，包括以所述的肽配基P2702为核心，对该肽配基P2702所进行的相应修饰；修饰材料包括纳米材料、荧光材料、酶类及生物素。

所述的肽配基P2702在抑制靶向amyloid-beta结构毒性中的应用。

所述的肽配基P2702在检测靶向amyloid-beta结构中的应用。

所述的肽配基P2702在制备靶向amyloid-beta结构的靶向药物中的应用。

本发明的有益效果：

1、本发明基于靶向amyloid-beta晶体结构(PDB ID:6SHS)，通过分子对接虚拟筛选技术，获得一条与靶向amyloid-beta结构特异性结合的肽配基P2702，其序列为RERWCC。固相合成肽配基，并与靶向amyloid-beta结构进行亲和力鉴定，P2702序列与Aβ

2、本发明P2702肽配基序列在一定程度上对PC12细胞没有毒性，且对Aβ

附图说明

图1为P2702序列与Aβ

图2为P2702序列抑制Aβ

其中，Aβ表示，仅含有Aβ

图3为P2702序列与Aβ

其中，纵坐标代表传感器所检测到的信号值；横坐标代表样品在传感器中相互作用的时间。

图4为P2702序列自身对PC12细胞活力的影响。

其中，横坐标表示肽配基浓度，纵坐标表示细胞活力。

图5为不同浓度的P2702序列与Aβ

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1分子对接及虚拟肽库的筛选

1、Aβ

借助计算机辅助设计软件对Aβ

2、虚拟肽配基库的设计

本发明采用逐个氨基酸残基延长的方式，首先将评分最高的几种氨基酸库逐个与靶标蛋白的结构实施对接，依据对接情况选择最佳的氨基酸残基为核心，再依次增加相应的氨基酸数量直至达到最佳的对接结果为止。虚拟肽配基库生成的肽序列以3-12位氨基酸残基为宜。

3、对接结果的评断

分别计算肽配基与蛋白结合的自由能，氢链，范得华力等力学参数进行综合评定，以此来判定筛选结果，并筛选得到P2702，其序列为RERWCC，其与Aβ

实施例2 P2702序列与Aβ

1、首先是Aβ

2、将获得的P2702序列溶解于PBS缓冲液(含100mM PB，10mM NaCl，pH 7.4)中。实验时将Aβ

3、将混合后的样品在37℃培养箱中共同孵育24小时，取20μL样品。用ThT染液(含25μM ThT，25mM PB)稀释20倍后，在激发波长440nm，发射波长480nm下测定ThT荧光强度。将仅含有Aβ

结果表明，P2702序列对于合成的Aβ

实施例3 P2702序列与Aβ

1、确定合适的pH作为偶联条件。在把Aβ

2、配体偶联。使用氨基直接偶联法固定Aβ

3、亲和力的测定。选择Run Kinetics/AffinityAssay点击Kinetics/Affinity设定相关实验参数，选择Flow Cell为1，2和芯片种类为CM5。Startup的solution为HBS-EP缓冲液，结合时间120s，解离时间120s，再生溶液为0.25％的十二烷基硫酸钠(SDS)，稳定时间30s。填写样品名称为P2702，将样品溶解于HBS-EP缓冲液，稀释成浓度50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.56μM、0.78μM的多肽溶液，并设置一个零浓度和一个最低浓度重复的样品，按照要求放置样品，检查缓冲液，保存文件，点击Run开始实验。配体偶联和亲和力的测定均使用Biacore X100 Control Software完成。

4、数据处理。实验结束后，使用Evaluation软件对结果进行分析，使用Flow Cell2扣除Flow Cell 1的背景信号为实验结果。使用1:1binding拟合方式进行拟合(见图3)。图中从上到下各曲线对应的溶液浓度逐渐降低。

结果表明，随着P2702浓度的升高，结合量也越大，且响应时间快，P2702序列对于合成的Aβ

实施例4 P2702肽配基的毒性鉴定

1、肽配基样品准备。将P2702肽配基溶解于DMEM完全培养基(含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，高糖培养基中含4.5g/L葡萄糖，含L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠)中，制成不同浓度(3.125、6.25、12.5、25、50、100、200μM)的肽配基溶液，用于下一步实验。

2、细胞铺板。挑选处于生长对数期的PC12细胞，PBS清洗两遍，加入1-2mL胰蛋白酶，于37℃消化1min，轻拍培养瓶侧面，在倒置显微镜下观察细胞状态，当细胞间隙变大、变圆时加入DMEM完全培养基终止消化，将细胞轻轻吹打下来转移至离心管中，以1000r/min的速度离心5分钟，弃上清，加入新的DMEM完全培养基，细胞计数板计数，稀释成密度为5×10

3、CCK-8法检测细胞活力。待细胞贴壁后，加入不同浓度的肽配基溶液，每个浓度5个复孔，为给药组，只加入培养基溶液的为对照组，以加入100μL培养基和10μL CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白组。于37℃培养24h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，在细胞培养箱中继续培养2小时，在450nm处测定吸光度。细胞活力＝(给药组-空白组)/(对照组-空白组)×100％(见图4)。

结果表明，在实验浓度下，随肽配基浓度的变化，细胞活力也有所变化，但与对照组相比，均没有统计学差异，P2702序列在一定程度上对PC12细胞没有毒性。

实施例5 P2702肽配基抑制Aβ

1、样品准备。将前期制得的Aβ

2、细胞铺板。挑选处于生长对数期的PC12细胞，PBS清洗两遍，加入1-2mL胰蛋白酶，于37℃消化1min，轻拍培养瓶侧面，在倒置显微镜下观察细胞状态，当细胞间隙变大、变圆时加入DMEM完全培养基终止消化，将细胞轻轻吹打下来转移至离心管中，1000r/min离心5分钟，弃上清，加入新的DMEM完全培养基，细胞计数板计数，稀释成密度为5×10

3、CCK-8法检测细胞活力。待细胞贴壁后，分别加入只含Aβ

结果表明，Aβ1-42对PC12细胞活力有较大影响，P2702和Aβ1-42共孵育后，细胞活力有所增加，在Aβ：肽配基浓度比为1:4时，达到最高，P2702序列对Aβ

序列表

<110> 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室

<120> 靶向amyloid-beta结构的肽配基及应用

<130> amyloid-beta

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Arg Glu Arg Trp Cys Cys

1 5