多种真菌毒素的检测试剂盒，其制备方法及检测方法和应用

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，具体讲，涉及一种多种真菌毒素的检测试剂盒，其制备方法及检测方法和应用。

背景技术

食品安全问题日益受到全球的广泛关注。特别地，其中最普遍、危害最大的是真菌毒素。真菌毒素是在一定温度和湿度条件下，由真菌产生的次级代谢产物和非蛋白小分子化合物。它们分布广泛，种类繁多，毒性强，检测困难，并且同一种污染的食物中可能存在多种毒素。伏马毒素(fumonisin B1，FB1)和玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是普遍存在于玉米、燕麦、小麦等谷类和乳制品中的两种真菌毒素。它们往往会引起人类和动物急性中毒、慢性中毒、致畸和致癌，不可避免地、广泛持续影响着人类的健康。因此，人们越来越关注食品和饲料中的真菌毒素污染。

目前常用的检测真菌毒素的方法包括色谱法、免疫检测法、电化学检测法、拉曼光谱检测法等。其中，气相色谱法(gas chromatography，GC)、薄层色谱法(thin-layerchromatography，TLC)、高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)等灵敏度高、特异性好，是分析领域公认的确证性检测方法，但是耗时、仪器昂贵，样品前处理繁琐并且依赖专业人员，难以应用到现场检测；其他方法灵敏度一般，且普遍操作较为复杂。随着纳米材料和纳米技术的迅速发展，为进一步提高真菌毒素检测传感器的灵敏度和便捷性并用于现场检测提供了巨大的可能性。

因此，建立一种快速、高效、灵敏的真菌毒素检测方法，对食品安全快速检测具有重要意义。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提供一种多种真菌毒素的检测试剂盒。

本发明的第二发明目的在于提供该多种真菌毒素的检测试剂盒的制备方法。

本发明的第三发明目的在于提供一种多种真菌毒素的检测方法。

本发明的第四发明目的在于提供上述试剂盒和方法的应用。

为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：

本发明第一方面提出一种多种真菌毒素的检测试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：

分别偶联有待测真菌毒素抗原的上转换纳米颗粒；分别偶联有待测真菌毒素抗体的磁性纳米颗粒；真菌毒素的标准品溶液；所述待测真菌毒素至少包括玉米赤霉烯酮和伏马毒素B1；所述抗体优选单克隆抗体。

本发明第二方面提出该试剂盒的制备方法：

其中，所述偶联有待测真菌毒素抗原的上转换纳米颗粒的制备方法至少包括以下步骤：

采用戊二醛法，用链霉亲和素修饰氨基化上转换纳米颗粒，得到链霉亲和素修饰的上转换纳米颗粒；

将链霉亲和素修饰的上转换纳米颗粒与生物素化的待测真菌毒素人工抗原孵育；

优选的，上转换纳米颗粒的浓度为2mg/mL，生物素化的待测真菌毒素人工抗原的浓度为1.5mg/mL；

更优选的，所述孵育的温度为37℃，孵育的时间为4～8小时。

本发明第三方面提出多种真菌毒素的检测方法，采用上述试剂盒中的试剂，至少包括以下步骤：

S1、绘制标准曲线：

将一系列浓度梯度的所述真菌毒素标准品溶液分别与所述偶联有真菌毒素抗原的上转换纳米颗粒混合，加入所述偶联有真菌毒素单抗的磁性纳米颗粒进行结合，磁分离，收集上清，检测上清中不同真菌毒素所对应的荧光信号，建立真菌毒素标准品浓度与荧光信号的标准曲线；

S2、检测待测样品：

将待测样品与所述真菌毒素标准品混合，制备得到混合待测样品；将所述混合待测样品与所述偶联有真菌毒素抗原的上转换纳米颗粒混合，加入所述偶联有真菌毒素单抗的磁性纳米颗粒进行结合，磁分离，收集上清，检测上清中不同真菌毒素所对应的荧光信号；

S3、根据标准曲线计算待测液中真菌毒素的浓度。

本发明至少具有以下有益的效果：

本发明利用上转换纳米颗粒独特的发光特性，抗体的特异性和磁纳米颗粒的分离富集效应。不仅可以同时检测两种真菌毒素，而且在免疫检测过程中避免了自体荧光的干扰，有效地提高了分析的准确性和灵敏度。因此，本发明的试剂盒和方法具有灵敏度高、特异性好等优点，对多种真菌毒素的超灵敏检测具有重要的实际意义，对于实现现场快速、超灵敏检测技术具有很好的指导意义。

附图说明

图1为本发明的检测原理图；

图2为两种上转换纳米颗粒(UCNPs)透射电镜图；

图3为两种不同发光的UCNPs与生物素标记的FB1和ZEN毒素抗原偶联后的XPS表征图；

图4偶联前的磁性纳米颗粒SEM表征图；

图5为磁性纳米颗粒偶联FB1毒素抗体后的SEM表征图；

图6为磁性纳米颗粒偶联ZEN毒素抗体后的SEM表征图；

图7为磁性纳米颗粒与FB1和ZEN毒素单克隆抗体偶联后的XPS表征图；

图8为以FB1和ZEN标准品的浓度为横坐标，各浓度对应的荧光强度为纵坐标绘制的标准曲线；

图9为基于磁分离和双色上转换的高灵敏度免疫荧光传感器用于同时检测伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮的特异性实验；

图10为偶联有待测真菌毒素抗原的上转换纳米颗粒的体积筛选试验结果；

图11为反应体系的缓冲液种类筛选试验结果；

图12为反应体系的pH筛选试验结果；

图13为反应竞争时间筛选试验结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例第一方面提出一种真菌毒素的检测试剂盒，可同时检测多种真菌毒素，包括以下组分：

分别偶联有待测真菌毒素抗原的上转换纳米颗粒；

分别偶联有待测真菌毒素抗体的磁性纳米颗粒，抗体优选单克隆抗体；

真菌毒素的标准品溶液；

待测真菌毒素至少包括玉米赤霉烯酮和伏马毒素B1，并不限于此，根据本发明的发明思路通过更换抗原和抗体就可检测多种真菌毒素。本发明的试剂盒和方法具有灵敏度高、特异性好等优点，对多种真菌毒素的超灵敏检测具有重要的实际意义，对于实现现场快速、超灵敏检测技术具有很好的指导意义。另外，FB1和ZEN两种毒素同时检测的方法鲜有报道，而FB1和ZEN在很多农作物或者饲料中是共同存在的，所以建立一种能够同时检测这两种毒素的方法，无论是在方法学本身还是实际应用的角度都有很高的价值。

可选的，上转换纳米颗粒选自直径为25～30nm的颗粒；特定尺寸的纳米颗粒能够进一步提高检测的灵敏度。优选NaYF

可选的，上转换纳米颗粒和磁性纳米颗粒保存于0.01M PBS中，pH优选为7.0。通过筛选实验发现，该条件下的试剂盒在检测时荧光强度最高，有利于提高试剂盒的灵敏度。

可选的，偶联有伏马毒素B1抗原的上转换纳米颗粒的浓度为1～3mg/mL，优选2mg/mL。

可选的，偶联有伏马毒素B1单抗的磁性纳米颗粒的浓度为1～3mg/mL，优选2mg/mL。

可选的，偶联有玉米赤霉烯酮抗原的上转换纳米颗粒的浓度为1～3mg/mL，优选2mg/mL。

可选的，偶联有玉米赤霉烯酮单抗的磁性纳米颗粒的浓度为1～3mg/mL，优选2mg/mL。

若上转换纳米颗粒的浓度过高，则浪费上转换纳米颗粒，增加检测成本，也有可能因浓度过高荧光反而猝灭；若上转换纳米颗粒的浓度过低，则荧光强度过低，则检测不到荧光信号。

若磁性纳米颗粒的浓度过高，形成免疫竞争反应时，磁性纳米颗粒上偶联的抗体会跟上转换纳米颗粒上偶联的抗原完全识别，磁分离后导致上转换纳米颗粒全部沉淀到底部，上清中检测不到荧光信号。若磁性纳米颗粒的浓度过低，达不到良好的磁分离效果。

可选的，标准品溶液为一系列浓度梯度的标准品溶液，浓度为0.05～5ng/mL。具体为0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL。

本发明第二方面涉及该试剂盒的制备方法，具体如图1中的图a所示，得到氨基化的上转换纳米颗粒，之后通过经典的戊二醛法，将氨基化的两种上转换纳米颗粒用链霉亲和素和生物素的相互作用分别与Biotin-FB1-BSA和Biotin-ZEN-BSA两种毒素人工抗原偶联，形成Biotin-FB1-BSA-UCNPs和Biotin-ZEN-BSA-UCNPs两种不同的上转换荧光探针；将磁性纳米颗粒分别与FB1单克隆抗体和ZEN单克隆抗体偶联，得到McAbs-FB1-MNPs和McAbs-ZEN-MNPs两种不同的捕获探针。

本发明提出一种氨基修饰UCNPs的制备方法，采用溶剂热法合成NaYF

①将1mmol RECl

②将混合溶液持续搅拌20～40分钟，然后冷却；加入含有2.5mmol NaOH和4mmolNH

③将溶液加热至115～120℃至甲醇的充分蒸发，溶液升温至310～320℃保持1.5h，并保持通入氮气或氩气；

④冷却，用去离子水和乙醇重复洗涤沉淀物3次，得到OA-UCNPs；

⑤将300mg的PEI溶解在5mL的超纯水中，然后注入含有10mg OA-UCNPs的环己烷溶液，常温下剧烈磁力搅拌18～36h；

⑥反应结束后，用超纯水和乙醇多次清洗PEI-UCNPs，以去除多余的PEI；所得产物在表面上具有氨基修饰，分散在超纯水中使用。

本发明实施例制备的得到的氨基修饰UCNPs具有粒径均一、发光强度高的技术优势。

其中：偶联有待测真菌毒素抗原的上转换纳米颗粒的制备方法至少包括以下步骤：

采用的戊二醛法，用链霉亲和素修饰氨基化上转换纳米颗粒，得到链霉亲和素修饰的上转换纳米颗粒；

将链霉亲和素修饰的上转换纳米颗粒与生物素化的待测真菌毒素人工抗原孵育；

优选的，上转换纳米颗粒的浓度为1～3mg/mL，优选2mg/mL，生物素化的待测真菌毒素人工抗原的浓度为1～3mg/mL，优选1.5mg/mL。

更优选的，孵育的温度为37℃，孵育的时间为4～8小时。

其中，上转换纳米颗粒优选为NaYF

按照上述类似方法，本发明可检测多种真菌毒素，例如可采用3种不同发光的UCNPs：NaYF

本发明三方面涉及采用该试剂盒的检测方法，原理如图1中的图b所示，将一定量的FB1和ZEN与固定浓度的Biotin-FB1-BSA-UCNPs和Biotin-ZEN-BSA-UCNPs两种上转换荧光探针混合，此时两种毒素与毒素人工抗原不会有识别反应。当把McAbs-FB1-MNPs和McAbs-ZEN-MNPs两种不同的捕获探针加入到上述混合溶液后，根据竞争免疫分析的原理，毒素小分子与毒素人工抗原会竞争性的与毒素单克隆抗体发生免疫识别，使得部分磁性捕获探针与毒素标准品结合，另一部分捕获探针与毒素人工抗原结合，最后形成两种磁珠-上转换颗粒的复合物。完成上述过程后，利用外界磁场对溶液进行分离，上清溶液中剩余的为Biotin-FB1-BSA-UCNPs和Biotin-ZEN-BSA-UCNPs，通过980nm激光器光激发磁分离得到的上清溶液，观察上转换颗粒产生的荧光强度变化情况。以UCNPs在480nm处发射峰作为FB1浓度监测信号，以UCNPs在550nm处发射峰作为ZEN浓度监测信号，UCNPs荧光信号的强度与加入的FB1和ZEN的浓度成正相关关系，可以对其进行定量检测，制作标准曲线。对待测样品进行同样方法测定，将测得的荧光信号代入标准曲线，得到其中FB1和ZEN的浓度。本发明利用上转换纳米颗粒独特的发光特性，抗体的特异性和磁纳米颗粒的分离富集效应。不仅可以同时检测两种真菌毒素，而且在免疫检测过程中避免了自体荧光的干扰，有效地提高了分析的准确性和灵敏度。

基于上述原理，磁性纳米颗粒与单克隆抗体可以单独提供，按照本发明实施例的方法偶联后使用，也可以共同以磁性纳米颗粒-单克隆抗体偶联物的形式提供。磁性纳米颗粒为环氧基修饰与单克隆抗体的氨基进行反应实现偶联。

具体的，至少包括以下步骤：

S1、绘制标准曲线：

将一系列浓度梯度的真菌毒素标准品溶液分别与偶联有真菌毒素抗原的上转换纳米颗粒混合，加入偶联有真菌毒素单抗的磁性纳米颗粒进行结合，磁分离，收集上清，检测上清中不同真菌毒素所对应的荧光信号，建立真菌毒素标准品浓度与荧光信号的标准曲线；

S2、检测待测样品：

将待测样品与真菌毒素标准品混合，制备得到混合待测样品；将混合待测样品与偶联有真菌毒素抗原的上转换纳米颗粒混合，加入偶联有真菌毒素单抗的磁性纳米颗粒进行结合，磁分离，收集上清，检测上清中不同真菌毒素所对应的荧光信号；

S3、根据标准曲线计算待测液中真菌毒素的浓度。

具体的，在S1中，取真菌毒素标准品溶液各50μL，加入160μL的偶联有FB1抗原的上转换纳米颗粒和180μL的偶联有ZEN抗原的上转换纳米颗粒Biotin-ZEN-BSA-UCNPs；加入偶联有FB1单抗的磁性纳米颗粒10μL、偶联有ZEN单抗的磁性纳米颗粒10μL进行竞争；

竞争的条件优选室温条件下震荡反应30分钟～2小时，优选1小时。

具体的，在S2中，将待测样品与标准品真菌毒素的标准品溶液混合，制备得到混合待测样品，使标准品真菌毒素的终浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL和2ng/mL，取混合待测样品溶液各50μL，加入160μL的偶联有FB1抗原的上转换纳米颗粒和180μL的偶联有ZEN抗原的上转换纳米颗粒Biotin-ZEN-BSA-UCNPs；加入偶联有FB1单抗的磁性纳米颗粒10μL、偶联有ZEN单抗的磁性纳米颗粒10μL进行竞争；

竞争的条件优选室温条件下震荡反应30分钟～2小时，优选1小时。

具体的，上述震荡为低速震荡，具体为650转/分钟。

具体的，检测方法还包括对待测样本进行提取的步骤，优选采用甲醇的水溶液对待测样本进行提取。

本发明还涉及上述试剂盒或检测方法在检测食品和饲料中的真菌毒素中的应用。其中食品包括固态食品和液态食品，固态食品包括各种粮食作物等，液态食品包括牛奶等。

实施例中，生物素标记的FB1和ZEN毒素人工抗原、FB1标准品和ZEN标准品均购自山东绿都生物科技有限公司，稀土金属等化学试剂购自Sigma公司，M270环氧基磁珠试剂盒购自赛默飞公司。F97pro荧光分光光度计购自上海棱光公司。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

基于磁分离和双色上转换的高灵敏度免疫荧光传感器用于同时检测伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮的方法建立。

1)氨基修饰UCNPs的制备：

采用溶剂热法合成NaYF

①1mmol RECl

②混合溶液持续搅拌30分钟，然后自然冷却至室温。将含有2.5mmol NaOH和4mmolNH

③将溶液加热至120℃，并保持足够长的时间，以确保甲醇的充分蒸发。溶液升温至320℃保持1.5h，并定时通入氮气或氩气。

④关闭加热开关，使溶液自然冷却至室温。用去离子水和乙醇重复洗涤沉淀物3次，得到OA-UCNPs。

⑤将300mg的PEI溶解在5mL的超纯水中，然后注入含有10mg OA-UCNPs的环己烷溶液，常温下剧烈磁力搅拌24h。

⑥反应结束后，用超纯水和乙醇多次清洗PEI-UCNPs，以去除多余的PEI。所得产物在表面上具有氨基修饰，分散在超纯水中使用。所得UCNPs的透射电镜图如图2所示。

2)上转换纳米颗粒偶联毒素人工抗原：

在与生物素标记的完全抗原偶联之前，按照经典的戊二醛法，用链霉亲和素修饰氨基化UCNPs。

①将氨基化UCNPs超声处理20分钟，准确量取5mL 2mg/mL氨基功能化的UCNPs，加入1.25mL 25％戊二醛，混合溶液室温下在恒温振荡器上轻轻摇动2h。

②通过离心(14,000rpm，10min，4℃)分离所得物，并用PBS洗涤3次以除去多余的戊二醛。

③将上述所得产物重新分散在5mL 0.01M PBS中，随后加入100μL1.0mg/mL链霉亲和素混合，室温下在反应12h(650rpm)。反应结束离心洗涤，重新分散在5mL 0.01M PBS中。

④将50μL，浓度为1.5mg/mL的生物素化的ZEN-BSA(或FB1-BSA)与5mL上述链霉亲和素标记的UCNPs分散体混合，37℃孵育6h。

⑤最后将所得产物离心，洗涤并分散在5mL含0.1％BSA的PBS缓冲液中。

两种不同发光的UCNPs与生物素标记的毒素抗原偶联后的XPS表征图如图3所示。

由图3可知，在167.81eV和167.44eV的结合能属于S2p，出现了S元素，说明两种生物素标记的抗原偶联成功。

3)磁性纳米颗粒与单克隆抗体的偶联(采用M270环氧基磁珠试剂盒进行制备)：

①准确称取M270磁珠粉末5mg放入离心管内，用1mL C1溶液洗涤磁珠并震荡；

②将离心管放在磁力架上1min，让磁珠聚集在管壁上，弃上清液。

③加入50μL FB1(或ZEN)毒素抗体(浓度1.5mg/mL)，再加入200μL C1溶液(总量为250μL)，再加入250μL C2溶液，缓慢振荡混合；

④在37℃的垂直混悬仪中孵化一夜(18小时)。确保管中液体混合良好。

⑤将离心管放在磁力架上1min，让磁珠聚集在管壁上，收集上清液(未结合的毒素抗体)；

⑥加入800μL HB，振荡混匀，磁力架分离1min，弃上清液；

⑦加入800μL LB，振荡混匀，磁力架分离1min，弃上清液；

⑧快速SB洗脱：加入800μL SB，混匀3min，磁力架分离1min，弃上清，重复1次；

⑨长时SB洗脱：加入800μL SB，混匀15min，磁力架分离1min，弃上清，重复2次；

⑩加入500μL SB(每毫克磁珠100μL)，置于4℃储存。最终磁珠偶联抗体后磁珠的浓度为10mg/mL。

图4为偶联前的磁性纳米颗粒SEM表征图：图5为磁性纳米颗粒偶联FB1毒素抗体后的SEM表征图：图6为磁性纳米颗粒偶联ZEN毒素抗体后的SEM表征图；

如图4～图6所示，未偶联毒素单克隆抗体前，磁性纳米颗粒粒径均一，分散性良好；与毒素单克隆抗体孵育后，出现粘连，表面出现附着物，由此证明抗体偶联成功。

由图7可知，毒素抗体与磁性纳米颗粒偶联成功。抗原抗体属于蛋白质，它们含有硫(S)、磷(P)等元素，而与其偶联的材料里面不含S、P。偶联后进行XPS元素分析，在163.18eV和163.29eV的结合能属于S2p，出现了S元素，说明抗体偶联成功，且偶联效果良好，探针稳定。

4)首先加入50μL的FB1和ZEN标准品溶液，与160μL的Biotin-FB1-BSA-UCNPs(浓度2mg/mL)和180μL的Biotin-ZEN-BSA-UCNPs(浓度2mg/mL)两种不同的上转换荧光探针混合。

5)随后将anti-FB1-MNPs和anti-ZEN-MNPs两种不同的磁性复合物各10μL加入到上述混合溶液，将浓度分别稀释为2mg/mL，在室温条件下震荡反应1h。

6)利用外界磁场对溶液进行分离，收集上清，然后用F97pro荧光分光光度计(激发波长980nm，狭缝宽度10nm，电压900V)在室温下检测荧光信号，发射波长分别为480nm和550nm。

7)检测不同浓度的FB1和ZEN标准品浓度(0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL)，并得到了荧光图谱。利用软件计算得到其标准曲线分别为F

实施例2

基于磁分离和双色上转换的高灵敏度免疫荧光传感器用于同时检测玉米粉中伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮的方法。

1)称取20g粉碎的玉米粉样品，加入提前配好的70％甲醇溶液50mL，之后放入磁力搅拌器上高速搅拌2min后，用定量滤纸过滤，量取10mL滤液，用双蒸水将其稀释10倍(为避免对荧光检测的影响，需保证滤液没有颜色)，用0.45μm滤膜过滤。

2)以三种不同浓度向玉米粉样品的滤液中添加FB1和ZEN标准品，使FB1和ZEN的终浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL和2ng/mL，得到三种不同浓度的待测玉米粉样品。

3)在含有160μL的Biotin-FB1-BSA-UCNPs(浓度为2mg/mL)和180μL的Biotin-ZEN-BSA-UCNPs(浓度为2mg/mL)两种不同的上转换荧光探针中，加入三种不同浓度的待测玉米粉样品。

4)随后分别取10μL的anti-ZEN-MNPs和anti-FB1-MNPs加入上述混合溶液中，稀释至浓度均为2mg/mL，在室温下缓慢振荡反应60分钟，反应结束后磁分离，收集上清，然后用F97pro荧光分光光度计(激发波长980nm，狭缝宽度10nm，电压900V)在室温下检测荧光信号，发射波长为480nm和550nm。

5)通过标准曲线计算检测的浓度与实际添加浓度比较，实验结果如表1所示：

表1

*n＝3,每种添加浓度均由三个平行实验得出。

根据表1数据可知，FB1和ZEN回收率的范围分别为97.9％～113.7％，89.5％～110.3％，RSD范围分别为1.2％～3.7％和1.0％～4.3％。结果表明该检测方法可以应用到实际玉米粉样品检测，并且前处理简单。

实施例3

基于磁分离和双色上转换的高灵敏度免疫荧光传感器用于同时检测牛奶中伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮的方法。

1)取1mL脱脂牛奶稀释成9mL，然后加入三种不同浓度的FB1和ZEN标准品，使FB1和ZEN的终浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL和2ng/mL，得到三种浓度的待测样品；

2)在含有160μL的Biotin-FB1-BSA-UCNPs(浓度为2mg/mL)和180μL的Biotin-ZEN-BSA-UCNPs(浓度为2mg/mL)两种不同的上转换荧光探针中，加入三种不同浓度的待测玉米粉样品。

3)随后分别取10μL的anti-ZEN-MNPs和anti-FB1-MNPs加入上述混合溶液中，稀释至浓度均为2mg/mL，在室温下缓慢振荡反应60分钟，反应结束后磁分离，收集上清，然后用F97pro荧光分光光度计(激发波长980nm，狭缝宽度10nm，电压900V)在室温下检测荧光信号，发射波长为480nm和550nm。

4)通过标准曲线计算检测的浓度与实际添加浓度比较，得到实验数据如表2所示：

表2

*n＝3,每种添加浓度均由三个平行实验得出。

由表2数据可知，FB1和ZEN回收率的范围分别为94.6％～113.8％，86.0％～105.1％，RSD范围分别为1.7％～3.0％和1.6％～2.7％。结果表明该检测方法可以应用到实际牛奶样品检测，并且前处理简单。

实施例4

基于磁分离和双色上转换的高灵敏度免疫荧光传感器用于同时检测玉米粉中伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮的方法特异性实验。

1)在含有160μL的Biotin-FB1-BSA-UCNPs(浓度为2mg/mL)和180μL的Biotin-ZEN-BSA-UCNPs(浓度为2mg/mL)两种不同的上转换荧光探针中，加入一定浓度的待测标准品(100μL)。

2)随后分别取10μL的anti-ZEN-MNPs和anti-FB1-MNPs加入上述混合溶液中，稀释至浓度均为2mg/mL，在室温下缓慢振荡反应60分钟，反应结束后磁分离，收集上清。

3)然后用F97pro荧光分光光度计(激发波长980nm，狭缝宽度10nm，电压900V)在室温下检测荧光信号，发射波长为480nm和550nm。

为了验证本发明检测方法的特异性，选取T-2(trichothecenes，TS)、OTA(Ochratoxin A，赭曲霉毒素A)、AFB1(aflatoxin B1，黄曲霉毒素B1)、AFM1(aflatoxin M1，黄曲霉毒素M1)和AFM2(aflatoxin M2，黄曲霉毒素M2)进行检测。由图9可知，本发明检测方法的特异性良好，待测物为FB1和ZEN时的荧光强度显著高于其他真菌毒素的荧光强度。

实验例1

加入10μL的McAbs-FB1-MNPs(浓度为2mg/mL)，之后分别加入不同体积的Biotin-FB1-BSA-UCNPs(体积分别为140、160、180、200和220μL)(均加入PBS保证反应体系总体积一致)，在室温下缓慢振荡反应1h，反应结束后磁分离，收集上清，然后用F97pro荧光分光光度计测量荧光，找到荧光强度保持稳定时探针的体积，确定最佳Biotin-FB1-BSA-UCNPs体积为160μL。

加入10μL的McAbs-ZEN-MNPs(浓度为2mg/mL)，之后分别加入不同体积的Biotin-ZEN-BSA-UCNPs(体积分别为140、160、180、200和220μL)(均加入PBS保证反应体系总体积一致)，在室温下缓慢振荡反应1h，反应结束后磁分离，收集上清，然后用F97pro荧光分光光度计测量荧光，找到荧光强度保持稳定时探针的体积，确定最佳Biotin-ZEN-BSA-UCNPs体积为180μL。

实验结果如图10所示。

实验例2

根据本发明，反应体系的缓冲液种类优选包括如下步骤：

将180μL的Biotin-ZEN-BSA-UCNPs以及160μL的Biotin-FB1-BSA-UCNPs分别分散至五种不同的缓冲液(0.01M PBS、0.01M Tris-Hcl、HEPES、B-R以及Hybrid buffer)，调整浓度均为2mg/mL，加入50μL的ZEN和FB1标准品溶液一起混合。之后，随后分别取10μL的McAbs-FB1-MNPs和McAbs-ZEN-MNPs加入上述混合溶液中，在室温下缓慢振荡反应1h，反应结束后磁分离，收集上清，然后用F97pro荧光分光光度计测量荧光，比较不同缓冲液中的荧光强度，实验结果如图11所示。

根据图11可知，最佳缓冲液为0.01M PBS。

实验例3

反应体系的pH优选包括如下步骤：

将180μL的Biotin-ZEN-BSA-UCNPs(浓度为2mg/mL)以及160μL的Biotin-FB1-BSA-UCNPs(浓度为2mg/mL)分别分散至五种不同的pH中(6.6、7.0、7.4、7.8、8.2)，加入50μL的ZEN和FB1标准品溶液一起混合。随后分别取10μL的McAbs-FB1-MNPs和McAbs-ZEN-MNPs加入上述混合溶液中，在室温下缓慢振荡反应1h，反应结束后磁分离，收集上清，然后用F97pro荧光分光光度计测量荧光，比较不同pH中的荧光强度，试验结果如图12所示。

根据图12可知，最佳pH为7.0。

实验例4

反应竞争时间优选包括如下步骤：

基于以上三个最佳条件，将50μL的ZEN和FB1标准品溶液与180μL的Biotin-ZEN-BSA-UCNPs(浓度为2mg/mL)以及160μL的Biotin-FB1-BSA-UCNPs(浓度为2mg/mL)一起混合。之后取10μL的McAbs-FB1-MNPs和McAbs-ZEN-MNPs加入上述混合溶液中，在室温下缓慢振荡分别反应20、40、60、80、100min，反应结束后磁分离，收集上清，然后用F97pro荧光分光光度计测量荧光，比较不同时间下的荧光强度，实验结果如图13所示。

根据图13可知，确定最佳反应竞争时间为60min。

实验例5

检测限测定：

不加入目标物(即真菌毒素)的情况下测量10个空白值，运用LOD＝3*空白值标准差/标准曲线斜率，计算得出。

实验步骤：

在实施例1、2、3、4优选条件下，将50μL 0.01M PBS与180μL的Biotin-ZEN-BSA-UCNPs以及160μL的Biotin-FB1-BSA-UCNPs一起混合。之后取10μL的McAbs-FB1-MNPs和McAbs-ZEN-MNPs加入上述混合溶液中，之后，分别取10μL的anti-ZEN-MNPs和anti-FB1-MNPs加入上述混合溶液中，在室温下缓慢振荡反应1h，反应结束后磁分离，收集上清，用980nm半导体激光器激发测量480nm及550nm处的荧光强度。得到的实验数据如表3所示：

表3

实验例6

购买商品化的FB1和ZEN的酶联免疫试剂盒(武汉力博瑞生物科技有限公司，FB1酶联免疫试剂盒货号：MM-95094O1，ZEN酶联免疫试剂盒货号：MM-32862O1)，进行方法学比对，数据如表4、表5所示：

表4

*n＝3,每种添加浓度均由三个平行实验得出。

表5

*n＝3,每种添加浓度均由三个平行实验得出。

由以上对比可知，本发明建立的同时检测两种毒素的方法与传统ELISA方法相比，检测结果一致，并且本发明在多组分同时检测的角度上占有明显优势；另外，本发明成功应用于玉米粉和牛奶样品中FB1和ZEN的检测，准确性和稳定性较好，为实现多靶标的高灵敏检测提供了一种新的思路。

本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。