一种胡椒碱类衍生物荜苃宁的应用

技术领域

本发明属于医药技术及保健品领域，具体涉及一种胡椒碱类衍生物荜苃宁的应用。

背景技术

支气管哮喘（简称哮喘，Asthma）是一种以气道慢性炎症、气道黏液高分泌和气道高反应性为特征的呼吸系统疾病，临床症状主要表现为喘息、气急、呼吸困难、胸闷和咳嗽等。

哮喘是一种全球性的常见病、多发病，目前全球哮喘患者人数已3.58亿人，每年死亡人数高达25万，中国的哮喘患病人数为4570万人，且该病的各个年龄的发病率和死亡率呈上升趋势，严重危害人们的身心健康，影响人们正常的学习和生活。该病在临床诊断中分为急性发作期、慢性维持期和临床缓解期，患者需要长期反复用药，并且不可完全治愈。其治疗的目标是良好控制患者的症状，保持正常的活动，尽可能的减少相关的死亡、恶化和药物相关不良反应的风险。

哮喘中的过敏性哮喘是患病人数最多的表型，临床上超过70%的患者属于这个类型。并且哮喘的发病原因较为复杂，由多种免疫细胞参与，其中2型固有淋巴样细胞（TypeⅡ innate lymphoid cells，ILC2s）在哮喘患者的外周血中大量表达，在疾病的发生发展中具有重要的作用。ILC2s起源于骨髓共同淋巴样细胞前体，当机体受到过敏源刺激时，气道上皮细胞受到损伤分泌白介素-25（Interleukin-25，IL-25）、白介素-33（Interleukin-33，IL-33）和胸腺基质淋巴生产素（Thymic stromal lymphopoietin，TSLP），与ILC2s 的表面受体 （ST2、IL-17RB和TSLPR）结合后，激活 ILC2s分泌IL-4（Interleukin-4，IL-4）、IL-5（Interleukin-5，IL-5）和IL-13（Interleukin-13，IL-13）等2型细胞因子。其中，IL-5促进嗜酸性粒细胞的分化、成熟、趋化和募集，释放炎性组胺、白三烯和趋化因子等炎性介质。IL-4诱发T细胞增殖，IL-13可引起杯状细胞增多和黏液的高分泌，且IL-4和IL-13还共同激活B细胞合成IgE。从而诱导气道炎症，促进气道黏液高分泌，导致肺组织损伤、气道狭窄和呼吸困难等，引起哮喘疾病的发作。

临床治疗哮喘的药物主要有抗炎药物吸入性糖皮质激素，扩张支气管类药物β2受体激动剂，炎症介质白三烯的调节剂，阻断M

荜苃宁（Piperlonguminine）是从胡椒科植物荜茇（Piper longum L.）中分离得到的的一种胡椒碱类化合物，结构式如下：

发明内容

本发明的目的在于提供胡椒碱类化合物荜苃宁在预防或治疗支气管哮喘药物中的应用。

本发明通过以下方法实现的，

1、支气管哮喘为过敏性哮喘、重症哮喘、难治性哮喘、激素抵抗性哮喘、咳嗽变异性哮喘、胸闷变异性哮喘和隐匿性哮喘。

2、所述药物为含有荜苃宁的制剂。

3、所述制剂由荜苃宁单独制成或由荜苃宁和药学上可接受的载体制成。

4、所述制剂为片剂、胶囊、丸剂、口服液、颗粒剂、混悬剂、注射剂、气雾剂、缓释制剂、舌下片。

5、所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，选自填充剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂、助悬剂、润湿剂、色素、香精、溶剂、表面活性剂或矫味剂中的一种或几种。

6、所述制剂通过以下方式给药：口服、喷雾吸入、直肠给药、鼻腔给药、非肠道给药如皮下、静脉、肌肉注射或输入。

7、荜苃宁拟临床用量为：50-250 mg/d。

8、本发明提供的荜苃宁的新用途具有以下优点：

（1）本发明提供的荜苃宁的新用途，即用于支气管哮喘的防治，为哮喘患者带来新的药物选择；

（2）实验结果显示，荜苃宁能够明显改善卵清蛋白致敏哮喘小鼠肺组织的病理变化及减少黏液的生成，抑制血清和肺泡灌洗液中相关炎性因子的生成，说明本发明的荜苃宁可用于制备预防或治疗支气管哮喘药物。

附图说明

图1为荜苃宁的化学结构式；

图2为荜苃宁对哮喘模型小鼠肺组织病理学影响（HE染色）；

图3为荜苃宁对哮喘模型小鼠肺组织黏液分泌影响（PAS染色）；

图4为荜茇宁对哮喘模型小鼠血清中总IgE水平的影响；

图5为荜茇宁对哮喘模型小鼠血清中OVA-特异性IgE水平的影响；

图6为荜茇宁对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中Eotaxin水平的影响；

图7为荜茇宁对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中IL-25水平的影响；

图8为荜茇宁对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中IL-33水平的影响；

图9为荜茇宁对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中TSLP水平的影响；

图10为荜茇宁对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中IL-4水平的影响；

图11为荜茇宁对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中IL-5水平的影响；

图12为荜茇宁对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中IL-13水平的影响；

图13为荜茇宁对哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中MUC5AC水平的影响。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方法作进一步详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述内容，实施例中如无特殊说明，使用试剂为常规市售试剂，或按常规方法制得的试剂。

1、荜茇宁在制备预防或治疗支气管哮喘药物中的应用。

2、本发明的化合物荜茇宁，化学结构式为：

3、支气管哮喘为过敏性哮喘、重症哮喘、难治性哮喘、激素抵抗性哮喘、咳嗽变异性哮喘、胸闷变异性哮喘和隐匿性哮喘。

4、所述药物为含有荜茇宁的制剂。

5、所述制剂由荜茇宁单独制成或由荜茇宁和药学上可接受的载体制成。

6、所述制剂为片剂、胶囊、丸剂、口服液、颗粒剂、混悬剂、注射剂、气雾剂、缓释制剂、舌下片。

7、所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，选自填充剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂、助悬剂、润湿剂、色素、香精、溶剂、表面活性剂或矫味剂中的一种或几种。

8、所述制剂通过以下方式给药：口服、喷雾吸入、直肠给药、鼻腔给药或非肠道给药（如皮下、静脉、肌肉注射或输入）。

9、荜茇宁拟临床用量为：50-250 mg/d。

10、本发明所用荜茇宁主要从胡椒科植物荜茇（Piper longum L.）中分离得到。

实施例1

荜茇宁对小鼠哮喘的治疗作用

1、试剂：地塞米松（批号：D1756）和卵清蛋白（批号:SLBH7924 V）购于美国 Sigma公司；纳米级 Al(OH) 3粉末（批号：38701）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Eotaxin（批号：2213080441）、IL-4（批号：A20480141）、IL-5（批号：A20580821）IL-13（批号：A21381132）、IgE（批号：A27581115）、IL-33（批号：A23380314）、TSLP（批号：A26580933）检测试剂盒均购于杭州联科生物技术股份有限公司；IL-25（批号：M181225-007a）ELISA 检测试剂盒购于深圳欣博盛生物科技有限公司；OVA-IgE（批号：544983)检测试剂盒购于Cayman ；MUC5AC（批号：ZKVBMELGV3）检测试剂盒购于伊莱瑞特。

2、仪器：超声雾化器（INQUA NEB plus，德国百瑞公司）；多功能酶标仪（Spectramax plus 384，倍捷科技）；正置光学显微镜（Nikon Eclipse E100，日本尼康）；台式高速冷冻离心机（HR/T16M，湖南赫西仪器装备有限公司）；-80℃超低温冰箱（8920，赛默飞世尔）；电子分析天平（AR224CN，奥豪斯仪器有限公司）。

3、实验方法：

[1] 实验动物与分组：清洁级雌性BALB/c小鼠40只，体重18-22 g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供。小鼠适应性喂养一周后，随机分为正常组、模型组、地塞米松组、荜茇宁高剂量组、荜茇宁低剂量组，每组8只。

[2] 哮喘模型制备与给药：模型组小鼠与药物组小鼠分别于实验1，8，15天腹腔注射0.2 ml OVA致敏液（含OVA 0.2 mg，Al(OH)

[3] 标本采集

①血清的收集：各组小鼠末次雾化24 h后，腹腔注射1 %的戊巴比妥钠进行麻醉，剂量为0.01 mL/g。摘眼球取血，室温静置1 h后，3000 rpm，4 ℃离心10 min，取上清，-80℃保存。

②小鼠肺泡灌洗液的收集：小鼠血清收集完成后，固定小鼠，使用酒精棉球消毒后开胸，暴露胸腔，行气管插管术，用动脉夹夹闭右主支气管，并用PBS灌洗左肺2次，每次0.3ml，反复抽吸3 次，合并2次灌洗液（每次回收率应≥80%），800×g，4 ℃离心10 min，-80 ℃保存。

③肺组织的收集：小鼠肺泡灌洗液收集完成后，取右肺中叶，经PBS冲洗后放入4%的多聚甲醛中固定24 h，用石蜡包埋。

[4] 肺组织病理学检测

①肺组织病理学检测（HE染色）：无菌取出肺组织，石蜡切片并用二甲苯脱蜡至水，依次进行苏木素和伊红染色，二甲苯处理后，用中性树脂封片。正置光学显微镜下观察小鼠肺组织的炎细胞浸润、支气管结构完整、气道上皮脱落及气管基底膜有无明显增厚的病；

②肺气道杯状细胞的观察（PAS染色）：无菌取出肺组织，石蜡切片并用二甲苯脱蜡至水，依次用1%高碘酸钠水溶液氧化、Schiff液染色、苏木精染核、1%盐酸乙醇分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。观察小鼠气道的杯状细胞增生及黏液分泌情况。

[5] 相关细胞因子的检测（ELISA法）

于-80℃取出冰冻的肺泡灌洗液及血清，恢复至室温。准备所有的试剂和标准品，按照ELISA试剂盒所示方法配制标准品，分别设置空白孔、标准品孔及样品孔空白孔加入100μl标准品稀释液，标准品孔加入2倍比稀释的标准品溶液，样本孔加入l00ul稀释的样本，每孔再加入50 μl稀释的检测抗体，在15分钟内完成加样过程，室温孵育1.5小时，洗涤6次，每孔加入100μl稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，室温孵育30分钟，洗涤6次，每孔加入100 μl显色底物，避光，室温孵育5 -30分钟，每孔加入100 μl终止液，30分钟内，于在450 nm波长检测OD值。以OD值为横坐标坐，以标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线，根据样品的OD值确定肺泡灌洗液中eotaxin、IL-4、IL-5、IL-13、IL-25、IL-33、TSLP、MUC5AC及血清中总IgE和OVA-IgE的水平。

[6] 统计学处理

各组数据采用均值±标准差（x±s）表示，采用SPSS 21.0软件统计分析处理数据，组间比较采用方差分析（One Way-ANOVA），多组间两两比较采用LSD-t检验，检验结果以P＜0.05为差异有统计学意义。

4、实验结果

NC为正常组，MOD为模型组，DEX为地塞米松组，GBN-L为荜茇宁低剂量组（15 mg/kg），GBN-H荜茇宁高剂量组（30 mg/kg）。正常组小鼠肺组织结构完整，粘膜上皮完整，气管平滑肌和基底膜无明显增厚，气管及肺泡周围炎性细胞浸润较少、无杯状细胞增生及黏液分泌现象；模型组组小鼠气管、肺泡及肺间质周围有大量炎性细胞浸润，上皮增生，基底膜增厚明显，气管周围有大量炎性细胞浸润、杯状细胞增生和粘液分泌。荜茇宁高低剂量组同模型组相比，炎性细胞浸润和基底膜增厚均得到不同程度缓解（图2），杯状细胞增生和黏液分泌情况明显的减轻（图3），说明荜茇宁能明显减轻哮喘气道炎症程度，改善气道黏液高分泌。对相关细胞因子水平检测发现，荜茇宁能明显抑制血清中总IgE（图4）和OVA-特异性IgE（图5）的产生，显著降低哮喘小鼠肺泡灌洗液中Eotaxin（图6）、IL-25（图7）、IL-33（图8）、TSLP（图9）、IL-4（图10）、IL-5（图11）、IL-13（图12）、MUC5AC（图13）的水平，表明荜茇宁对哮喘有效。其中

由此可见，荜茇宁具有较强的拮抗哮喘的活性，可用于制备防治哮喘的药物。

本发明所述的小鼠哮喘模型实验中，荜茇宁低剂量为15 mg/kg，高剂量为30 mg/kg。换算为人（以成人体重60kg计算）剂量为90-180 mg。考虑到人的体重及其他生理病理情况，推荐剂量为50-250 mg/d。

本发明所涉及的实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。