一种急性髓细胞性白血病的外周血TCR标志物及其检测试剂盒和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种急性髓细胞性白血病的外周血TCR标志物及其检测试剂盒和应用。

背景技术

急性髓细胞性白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是髓系造血干/祖细胞恶性疾病。以骨髓与外周血中原始和幼稚髓性细胞异常增生为主要特征，临床表现为贫血、出血(血小板减少)、感染和发热、脏器浸润、皮肤浸润、代谢异常、牙龈增生等，多数病例病情急重，病情进展迅速，自然病程仅有数周至数月，预后凶险，如不及时治疗常可危及生命。本病占小儿白血病的30％。在分子生物学改变及化疗反应方面儿童急性髓细胞性白血病与成人(<50岁)相似。婴幼儿的急性髓细胞性白血病比成人易发生髓外白血病。我国急性白血病比慢性白血病多见，其中急性髓细胞性白血病最多(1.62/10万)。

目前针对急性髓细胞性白血病的诊断手段主要有血常规检测、细胞化学检查、免疫分型、染色体检测、骨髓象检测。

在血常规检测中贫血和血小板减少极其常见(占75％～95％)，半数急性髓细胞性白血病患者白细胞数增高，多在10×10

急性髓细胞性白血病的不同亚型其细胞化学染色特点不尽相同，因此急性髓细胞性白血病的细胞化学染色对该病的诊断十分重要。常用的细胞化学染色方法包括髓过氧化物酶染色(MPO)、苏丹黑B染色(SBB)、氯醋酸AS-D萘酚酯酶染色(NAS-DCE)、α-丁酸萘酚酯酶染色(α-NBE)、α-醋酸萘酚酯酶染色(α-NAE)、过碘酸-雪夫染色(糖原染色、PAS)、酸陛磷酸酶染色(ACP)、碱性磷酸酶染色(NAP)、溶菌酶等方法。必要时可做酯酶双染色和Phl(φ)小体等。该种检测不能用于急性髓细胞性白血病的早期诊断。

免疫分型是根据急性髓细胞性白血病细胞表达的相关抗原确定其系列来源，常用多参数流式细胞仪进行分析，进一步将急性髓细胞性白血病分为不同亚型。该检测因受到相关抗原量的影响灵敏度不高。

80％～90％的儿童急性髓细胞性白血病伴有染色体异常。其中约半数急性髓细胞性白血病病例只以单独核型异常出现，其余伴有附加异常。采用高分辨技术，核型异常发现率高达90％以上。急性髓细胞性白血病的染色体异常以结构畸变为主，高达39种之多，某些特殊的结构异常，如t(8；21)(q22；q22)、t(15；17)(q22；q21)和inv(16)(p13；q22)或t(16；16)(p13；q11)，与良好预后相关。该种检测唯一性不足，不能用于早期诊断。

骨髓象检测多数患者高度增生，正常造血细胞被白血病细胞取代；少数患者骨髓增生低下，但原始细胞仍在30％以上。如胞浆内发现Auer小体，更有助于排除急性淋巴细胞性白血病(ALL)而确诊为急性髓细胞性白血病该种检测根据患者情况不同结果可高可低且不能作为定性急性髓细胞性白血病的检测。

除以上检测之外，目前可用于诊断急性髓细胞性白血病的标志物非常少。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种急性髓细胞性白血病的外周血TCR标志物及其检测试剂盒和应用，能准确快速的判断待测样本中是否有较高急性髓细胞性白血病风险患者。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种急性髓细胞性白血病的外周血TCR标志物，该标志物包括序列为SEQ ID NO.1～100所示的蛋白中的至少一种，具体序列见表1。

表1标志物序列

进一步地，标志物的蛋白序列为SEQ ID NO.1～100所示的序列经取代、缺失和/或替换一个或多个碱基后，能表达相同功能的蛋白。

进一步地，标志物为外周血TCR CDR3序列。

上述标志物在制备治疗急性髓细胞性白血病的制剂中的应用。

进一步地，制剂中包括含有该标志物的T细胞受体，或能表达产生该标志物的T细胞受体的质粒、病毒载体或核酸片段。

一种用于急性髓细胞性白血病检测的试剂盒，包括能与上述标志物发生特异性结合的抗体。

一种制剂，包括能与上述标志物发生特异性结合的抗体；所述制剂可用于对急性髓细胞性白血病进行诊断、预测、检测或筛查。

一种检测急性髓细胞性白血病的蛋白质芯片，该蛋白质芯片包括基片和点样在基片上特异性抗体，该特异性抗体为能与上述标志物发生特异性结合的抗体。

本发明的原理为：人体内的B淋巴细胞和T淋巴细胞是获得性免疫系统中重要的两类细胞。B细胞通过细胞表面的B细胞受体(BCR)识别抗原，后期BCR在B细胞分化成浆细胞时，表达成抗体，分泌到细胞外。T细胞通过细胞表面的T细胞受体(TCR)识别抗原。BCR和TCR的多样性是建立获得性免疫系统的基础。BCR多样性的理论值是10

在各种疾病中，随着不同的抗原刺激，BCR和TCR的多样性或者表达水平都会发生改变。因此，利用BCR或者TCR高通量测序结果可以追踪疾病的发生、发展。人体内细胞中，衰老蛋白质降解后，其片段会被运输到细胞表面，通过组织相容性抗原II(MCHII)呈递给免疫系统中的T细胞。正常细胞呈递的抗原片段，由于免疫耐受的关系，不会引起免疫反应。一旦当正常细胞出现癌变后，突变的基因表达的异常蛋白，其片段被呈递到细胞表面后，就会引起人体免疫系统产生针对性的免疫反应。因此，分析BCR或TCR的变化，能够检测出肿瘤的发生和发展。

本发明的有益效果为：

1、本发明中，首先利用1300个非急性髓细胞性白血病的对照组样本、和45个急性髓细胞性白血病病人的TCR高通量测序数据建立了人工智能分析模型，通过和这些急性髓细胞性白血病特异性TCR序列对比，可以清楚的判断待测样本中是否有较高急性髓细胞性白血病风险者；

2、通过高通量测序分析TCR变化可以发现很早期的急性髓细胞性白血病，利用急性髓细胞性白血病特有的TCR CDR3序列分析人的免疫系统中的T细胞对急性髓细胞性白血病的反应，是一种新型的检测方法；

3、本发明通过采用高通量测序技术同时比较数量巨大的特异性TCR序列，比起单独检测一种或几种标记物，具有更高的特异性和准确性；

4、本发明中使用的高通量测序仪器成本低于大型影像学设备，且可向第三方外包，此外，采样、处理的人力成本低于同时检测多种标记物，也低于大量细胞学检测，因此，本发明大大降低了检测成本；

5、本发明只需要采取少量外周血，采样简便、安全；

6、本发明中所述TCR CDR3序列，可用于急性髓细胞性白血病的免疫治疗。

附图说明

图1为本发明中，利用基于免疫大数据分析系统发现急性髓细胞性白血病特征性TCR序列。横坐标代表某一特定氨基酸组合的CDR3序列被加入对照序列集合或急性髓细胞性白血病特征序列集合的先后顺序,纵坐标代表该序列在某一样本中重复出现次数C

图2为本发明中，利用急性髓细胞性白血病特征特征性指数对比分析急性髓细胞性白血病和其他疾病。健康人、非肿瘤病人、非急性髓细胞性白血病肿瘤患者的急性髓细胞性白血病特征性指数均与急性髓细胞性白血病患者具有显著差异，证明了急性髓细胞性白血病特征序列集的特异性。据此可以判断未知受试者是否罹患急性髓细胞性白血病。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1通过免疫图谱分析，获得急性髓细胞性白血病TCR标志物CDR3序列集

1、采样及免疫图谱分析

采集1301名对照组(包括健康人和非肿瘤疾病病人，1300人用于建立模型，1个健康人用于验证)、41名急性髓细胞性白血病患者(40人用于建立模型，1人用于验证)及1名未知健康状况受试者的外周血(每人10mL)，通过高通量测序得到受试者和对照组的TCR的抗原决定簇3(CDR3)氨基酸序列，保证每个样本的功能性TCR的CDR3序列总数综合不低于25000；

2、对每个功能性TCR的CDR3序列总数综合高于30000的样本的序列进行随机不放回抽样，使该样本的CDR3序列数量总和为30000。至此所有样本包含的功能性TCR的CDR3序列总数为25000-30000。对任一特定CDR3序列X，在单样本测序结果中重复出现次数计为C

3、通过分析TCR CDR3数据，确定急性髓细胞性白血病TCR标志物CDR3序列：

a)将1300名用于建立模型的对照组样本的所有CDR3序列归总去重，设为对照序列集；

b)将40名用于建立模型的急性髓细胞性白血病样本的所有CDR3序列归总去重，再去除所有与对照序列集中包含序列重复的序列，设为急性髓细胞性白血病特征序列集。作图如附图1A所示，其中横坐标代表某一特定氨基酸组合的CDR3序列被加入对照序列集合或急性髓细胞性白血病特征序列集合的先后顺序，纵坐标代表该序列在某一样本中重复出现次数C

c)按照同样作图方法，将1名健康人、1名急性髓细胞性白血病患者和1名健康状况未知受试者的免疫图谱，参照对照序列集合和急性髓细胞性白血病特征序列集合进行作图，见附图1B-D。从图中可见，急性髓细胞性白血病患者的免疫图谱中，含有较多种类且较高重复出现次数的急性髓细胞性白血病特征序列(图1B)；健康人的免疫图谱中，只有极少量急性髓细胞性白血病特征序列(图1C)；而未知健康状况受试者，有高于健康人的急性髓细胞性白血病特征序列，说明此人有较高风险罹患急性髓细胞性白血病(图1D)。

d)将急性髓细胞性白血病特征序列集中，将所有出现在两个及以上参与建模急性髓细胞性白血病样本里的CDR3序列，按“所有参与建模急性髓细胞性白血病样本里该序列单样本中重复出现次数C

实施例2验证急性髓细胞性白血病TCR标志物CDR3序列集的特异性

1、采样及免疫图谱分析

采集435名非急性髓细胞性白血病的肿瘤患者、2名未知健康状况受试者的外周血(每人10mL)，通过高通量测序得到受试者和对照组的TCR的抗原决定簇3(CDR3)氨基酸序列，保证每个样本的功能性TCR的CDR3序列总数综合不低于25000；对每个功能性TCR的CDR3序列总数综合高于30000的样本的序列进行随机不放回抽样，使该样本的CDR3序列数量总和为30000。至此所有样本包含的功能性TCR的CDR3序列总数为25000-30000。

2、从实施例1的对照组中随机挑选100名健康人及43名非肿瘤疾病病人。

3、根据来自实施例1的100名健康人、43名非肿瘤疾病病人、40名急性髓细胞性白血病患者，以及实施例2新获取的435名非急性髓细胞性白血病肿瘤患者、2名未知健康状况受试者的免疫图谱，分析其急性髓细胞性白血病特征性指数。

其中急性髓细胞性白血病特征性指数定义为：某个样本中，属于急性髓细胞性白血病特征序列集的所有CDR3序列在该样本内重复出现次数C

表2不同样本组的急性髓细胞性白血病特征性指数

4、分析各组的急性髓细胞性白血病特征指数(表3)，2位未知健康状况受试者(检测样本)的急性髓细胞性白血病特征指数显著高于“其它肿瘤”组的平均值+2×SD(67.8+2×258.3＝584.4)，此2人具有较高风险罹患急性髓细胞性白血病。与临床体检结果对照后，这2人确为早期急性髓细胞性白血病患者。此实施例证明了利用急性髓细胞性白血病特征序列集及急性髓细胞性白血病特征性指数，预测受试者罹患急性髓细胞性白血病风险的可行性。

表3急性髓细胞性白血病特征性指数分析

综上所述，本发明所述急性髓细胞性白血病TCR标志物CDR3序列，确实具有显著的急性髓细胞性白血病特异性，不仅可以用于急性髓细胞性白血病预测受试者罹患急性髓细胞性白血病风险，未来还可用于急性髓细胞性白血病的生物免疫治疗。

序列表

<110> 成都益安博生物技术有限公司

<120> 一种急性髓细胞性白血病的外周血TCR标志物及其检测试剂盒和应用

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

Ala Ser Ser Ser Pro Gly Gly Val Pro Ser Gly Ala Asn Val Leu Thr

1 5 10 15

<210> 62

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

Ala Thr Ser Asp Pro Gly Leu Pro Tyr Gly Tyr Thr

1 5 10

<210> 63

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

Ala Thr Ser Gly Ala Gly Gly Gln Gly Gly Glu Gln Tyr

1 5 10

<210> 64

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

Ser Ala Arg Gly Arg Leu Ala Thr Leu Arg Asp Thr Gln Tyr

1 5 10

<210> 65

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

Ala Thr Arg Val Arg Thr Gly His Asn Gln Pro Gln His

1 5 10

<210> 66

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

Ser Ala Lys Val Asn Ser Tyr Glu Gln Tyr

1 5 10

<210> 67

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

Ala Ile Ser Pro Val Val Gly Gly Ser Tyr Glu Gln Tyr

1 5 10

<210> 68

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

Ala Ser Ser Pro Ser Lys Pro Thr Pro Glu Thr Gln Tyr

1 5 10

<210> 69

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

Ala Ser Ser Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Ser Gly Tyr Thr

1 5 10

<210> 70

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

Gln Gln Leu Val Ser Gly Arg Ala Arg Asp Pro Val

1 5 10

<210> 71

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

Ala Ser Ser Asp Ser Phe Gly Ala Ala Asp Thr Gln Tyr

1 5 10

<210> 72

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

Ala Ile Ser Thr Ser Ala Ser Asn Gln Pro Gln His

1 5 10

<210> 73

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

Ala Ile Ser Gly Thr Gly Ile Thr Ile Tyr

1 5 10

<210> 74

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

Ala Ile Ser Glu Ser Asn Ser Arg Asp Thr Gln Tyr

1 5 10

<210> 75

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

Ala Ser Ser His Met Thr Gly Asp Tyr Thr Tyr Asn Glu Gln Phe

1 5 10 15

<210> 76

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

Ser Ala Ile Gln Gly Val Ala Gly Ser Pro Leu His

1 5 10

<210> 77

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

Ala Ser Ser Asp Arg Phe Gly Lys Ile Gly Glu Gln Phe

1 5 10

<210> 78

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

Ser Ala Arg Asp Arg Trp Ala Ser Gly Phe Ser Thr Asp Thr Gln Tyr

1 5 10 15

<210> 79

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

Ser Val Pro Gly Pro Phe Asn Gln Pro Gln His

1 5 10

<210> 80

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

Ser Thr Arg Thr Gly Pro Leu Asn Glu Gln Phe

1 5 10

<210> 81

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

Ala Ser Ser Pro Glu Leu Gly Gly Asn Glu Lys Leu Phe

1 5 10

<210> 82

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

Ser Ala Pro Ala Arg Ala Asp Thr Glu Ala Phe

1 5 10

<210> 83

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

Ser Ala Ala Gly Leu Glu Gly Glu Thr Gln Tyr

1 5 10

<210> 84

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

Ser Ala Gly Gln Val Ala Gly Val Gly Glu Gln Tyr

1 5 10

<210> 85

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

Ala Ser Ser Pro Pro Ile Gly Trp Arg Glu Tyr Asn Glu Gln Phe

1 5 10 15

<210> 86

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

Ala Ser Ser Tyr Trp Gly Gly Glu Asn Asn Glu Gln Phe

1 5 10

<210> 87

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

Ser Val Ser Asp Val Thr Gln Tyr

1 5

<210> 88

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

Ala Trp Ser Val Gln Thr Thr Lys Ala Phe

1 5 10

<210> 89

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

Ala Ser Ser Pro Ser Pro Thr Gly Ala Thr Asp Thr Gln Tyr

1 5 10

<210> 90

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

Ala Ser Asn Glu Gly Gln Gly Ala Gly Glu Gln Tyr

1 5 10

<210> 91

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

Ser Ala Arg Ala Val Thr Gly Ala Asp Gln Pro Gln His

1 5 10

<210> 92

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

Ala Ser Ser Leu Leu Leu Ser Gly Arg Lys Asn Glu Gln Phe

1 5 10

<210> 93

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

Ala Ser Arg Lys Ser Gly Asp Arg Thr Asp Thr Gln Tyr

1 5 10

<210> 94

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 94

Ala Ser Thr Asn Arg Gly Ser Asn Thr Glu Ala Phe

1 5 10

<210> 95

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 95

Ala Ser Ser Pro Pro Gly Gly Val Gly Ser Asn Gln Pro Gln His

1 5 10 15

<210> 96

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 96

Ala Ser Ser Glu Gly Leu Phe Phe Gln Ser Ser Tyr Asn Glu Gln Phe

1 5 10 15

<210> 97

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 97

Ala Ser Ser Ala Gly Leu Gly Val Gln Tyr

1 5 10

<210> 98

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 98

Ser Ala Glu Glu Gly Gly Ile Ser Ile Tyr Asn Ser Pro Leu His

1 5 10 15

<210> 99

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 99

Ser Ala Arg Ser Gly Ala Ser Gly Arg Phe Ser Tyr Glu Gln Tyr

1 5 10 15

<210> 100

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 100

Ala Trp Ser Lys Ser Gly Ala Asn Glu Gln Phe

1 5 10