硒制剂在制备治疗克罗恩病药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种硒制剂在制备治疗克罗恩病药物中的应用。

背景技术

炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)主要包括克罗恩病(Crohn’sdisease,CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)，是一组慢性非特异性肠道炎症性疾病。近年来，IBD在中国的发病率呈快速增长的趋势，该病病程反复，严重影响患者生活质量，造成了沉重的社会医疗经济负担。CD和UC在流行病学、遗传学特征、临床表现及组织病理学改变等方面有明显差异。

克罗恩病的主要表现为腹痛、腹泻、体重下降、发热等，内镜下呈节段性、纵行溃疡及卵石样改变，病理学表现为透壁性炎症、非干酪样肉芽肿，而溃疡性结肠炎表现为黏液脓血便，腹痛等，内镜下呈弥漫性、倒灌性结直肠炎，病理学改变为黏膜层、黏膜下层炎症，隐窝炎症及脓肿。IBD的发病机制尚未完全明确，T细胞的功能失衡是IBD重要的致病因素之一。临床上大多数治疗药物同时用于CD和UC的治疗，常用的药物如硫唑嘌呤、甲氨蝶呤等均通过广谱抑制T细胞的活性来抑制肠道炎症，患者使用后副作用较多(包括骨髓抑制、肝毒性、感染、肿瘤等)，一旦停止治疗很快出现疾病复发。近期许多靶向T细胞特异性细胞因子的药物，如IL-17A拮抗剂、IFN-γ拮抗剂均被证实在CD的治疗中无效。系统地分析健康人、CD和UC患者肠道T细胞的免疫病理特征，揭示CD和UC中T细胞应答模式差异的机制，对于实现IBD的个体化治疗、优化靶向治疗策略具有极其关键的意义。

硒是人体必需的微量元素，严重的硒缺乏与两种地方性疾病直接相关，具体为发生在中国和俄罗斯缺硒地区的克山病(Keshan diseases)和大骨节病(KashinKashin-Beck)。越来越多的研究表明，体内硒的水平低可能是影响人类某些重大疾病发生的原因之一，如心血管疾病、阿尔兹海默症等神经退行性疾病、癌症等。硒的吸收主要在十二指肠和盲肠，在正常生理条件下，几乎所有形式的硒(包括无机硒和有机硒)都可被吸收。在人体内硒主要以硒蛋白的形式发挥生理学功能，包括抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等。硒的化合物(亚硒酸钠等无机硒、有机硒)具有多种药理学作用，临床主要用作补硒剂，用于防治缺硒引起的疾病，如克山病、大骨节病等。目前，尚无文献公开补硒制剂在炎症性肠病中的治疗作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种硒制剂在制备治疗克罗恩病药物中的应用。

申请人通过对健康人、初诊未使用药物治疗的中重度活动期CD和UC患者肠道中的免疫细胞进行单细胞转录组测序，发现：CD和UC患者中活化的T细胞亚群类型、免疫学功能及其代谢存在较大的差异,CD病人的结肠中存在一群疾病特异的Th1-like细胞，而UC病人中存在独特的Th17-like细胞。T细胞的分化及功能受到多种因素的调控，包括肠道微环境中的微生物、细胞因子、趋化因子等，而CD和UC病人中产生这两群疾病特异性亚群的原因目前仍未知。最新研究显示，代谢重编程在T细胞活化、增殖和分化过程中发挥着关键的调节作用。申请人对IBD患者结肠组织进行非靶向代谢组分析，发现IBD与健康人，CD与UC之间的肠组织的代谢谱存在着较大的差异，CD和UC分别存在多种特异性上调或下调的代谢物。值得注意的是，申请人发现含硒代谢物在CD病人的组织中特异性下调，而且CD患者血清中硒水平与疾病的严重程度呈负相关。申请人进一步研究了CD和UC之间的差异代谢物对T细胞功能的影响，体外细胞实验显示补充亚硒酸钠可以明显改变CD4

本发明采用的技术方案是：

硒制剂在制备治疗克罗恩病药物中的应用。

所述的硒制剂为无机硒或有机硒。

所述无机硒为亚硒酸钠或硒酸钠，优选亚硒酸钠。

所述有机硒为硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸或富硒酵母。

所述硒制剂为亚硒酸钠时，亚硒酸钠浓度优选为0.5～1μM，此时具有良好的抑制Th1分化效果，且对细胞无明显毒性。

所述硒制剂用于制备治疗克罗恩病药物时，可以将硒制剂单独或与其它活性组份组合，与人体可接受的药用辅料制作各类剂型的药剂。所述剂型包括但不限于粉剂、胶囊剂、丸剂、缓释片、注射剂等。

只要该药剂用于治疗克罗恩病，均属于本发明的保护范围。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次公开了硒制剂治疗克罗恩病的药用作用。

通过体外细胞实验研究证实，亚硒酸钠浓度控制为0.5～1μM具有良好的抑制Th1分化效果，且对细胞无明显毒性。亚硒酸钠对小鼠T细胞过继转移诱导的肠炎症状有显著改善效果，可显著抑制小鼠结肠组织内的Th1细胞，在小范围临床试验中显示可以促进缺硒克罗恩病患者肠炎的缓解。本发明提供了亚硒酸钠的新用途，对于针对克罗恩病治疗药物的研发具有重要意义，可以为临床药物的开发和机制研究提供参考。

附图说明

图1体外补充硒抑制Th1分化的实验结果图，其中，图1A为加入亚硒酸钠组(selenite)和对照组(NT)Th1和Th17体外分化的流式图。图1B为加入不同浓度的亚硒酸钠后，体外分化的Th1较对照组下降的比例图。

图2补硒对减轻T细胞过继转移诱导的肠炎模型的实验结果图，其中，图2A为小鼠体重变化图，补硒组(selenite)小鼠的体重较对照组(NT)高，图2B为小鼠结肠长度，补硒组结肠长度较长，图2C为结肠长度统计图，图2D为缺硒状态下诱导肠炎模型的体重变化图，图2E为缺硒状态下诱导肠炎模型小鼠的结肠长度图，图2F为结肠长度统计图。缺硒状态下，补充硒较不补硒组的肠炎轻。图2G为肠炎小鼠结肠组织内的Th1细胞比例流式图，图2H为Th1细胞比例统计图。

图3缺硒克罗恩病患者补充硒治疗可以促进疾病缓解的实验结果图，其中，图3A为补硒(selenium supplements)和不补硒(control)CD患者每周随访的疾病活动度评分(HBI评分)变化图，图3B为补硒CD患者治疗前后肠镜对比图，图3C为非IBD患者(Non-IBDpatients)、CD患者不补硒(with selenite)、补硒治疗8-10周后(without selenite)结肠组织内Th1细胞的流式图，图3D为三组患者结肠Th1细胞比例统计图。

具体实施方式：

用以下实施例对本发明的工艺做进一步说明，但本发明的保护范围不受实施例的限制。

实施例1

1体外细胞实验实施方式

1.1小鼠初始CD4+T细胞的获取：

采用颈椎脱位法处死小鼠，分离其腋下、颌下淋巴结及脾脏，用注射器活塞末端研磨淋巴结及脾脏，过滤、裂解红细胞后离心，180ul RPMI+20μl anti-mouse CD4磁珠，4℃孵育15分钟；洗涤后2ml重悬；通过LS柱分选CD4+T细胞。将收集的细胞液离心后用100μl 10％FBS RPMI重悬，加入抗体FITC anti-mouse CD44,APC anti-mouse CD62L各1μl，4℃避光孵育15min。加入10％FBS RPMI2ml离心洗涤细胞，弃上清，重悬至600μl，于Arial II流式分选仪进行分选，得到CD44

1.2 T细胞分化实验：

用anti-CD3/anti-CD28包被24孔板，4℃过夜。将按上述步骤获得的初始T细胞按4×10

补充硒对Th1分化的影响如图1所示，其中，图1A为加入亚硒酸钠组(selenite)和对照组(NT)Th1和Th17体外分化的流式图。图1B为加入不同浓度的亚硒酸钠后，体外分化的Th1较对照组下降的比例图。

由图1A可知，与对照组相比(60.5％)，加入亚硒酸钠组的Th1比例为40.4％，亚硒酸钠对Th1的抑制作用呈现出浓度依赖性(图1B)，在0.1-10μM时抑制作用显著。

实施例2

2动物肠炎模型实施方式

2.1实验分组

分组方式一：①对照组(正常饮食饮水)；②补硒组(饮水中添加亚硒酸钠0.8ppm)。

分组方式二：对Rag1

2.2实验过程

利用磁珠分选结合流式细胞仪分选野生型小鼠的CD4

所得结果如图2所示，图2A为小鼠体重变化图，补硒组(selenite)小鼠的体重较对照组(NT)高，图2B为小鼠结肠长度，补硒组结肠长度较长，图2C为结肠长度统计图，图2D为缺硒状态下诱导肠炎模型的体重变化图，图2E为缺硒状态下诱导肠炎模型小鼠的结肠长度图，图2F为结肠长度统计图。

补硒组(selenite)小鼠的体重较对照组(NT)高(图2A)，小鼠结肠长度较对照组长(图2B、2C)，说明补充硒可以减轻T细胞过继转移诱导的肠道炎症。小鼠在饲喂缺硒饲料4周后，再次诱导T细胞过继转移的肠炎模型，补充硒组的体重(selenium deficient，normaldiet after transfer)较缺硒组(selenium deficient diet)下降少(图2D)，结肠长度更长(图2E、2F)，对结肠固有层的Th1细胞进行检测，补充硒可减少体内Th1细胞的分化。以上结果证明，在缺硒的状态下，补充硒可以降低小鼠肠道中的Th1细胞，改善小鼠的肠道炎症。

实施例3

3临床研究实施方式：

1研究人群：

入选标准

①年龄18-60岁；

②结合病史、体格检查、辅助检查等确诊克罗恩病患者。

③同意检测外周血硒水平，且硒浓度低于84μg/L

④同意参与本研究，并签署本研究知情同意书

排除标准：

①合并者患有任何不稳定或者未控制的心血管、肺、肝、肾、胃肠道、泌尿血液学、凝血功能、免疫、内分泌/代谢或其他医学疾病，且研究者认为会干扰研究结果或危害受试者的安全性。

②哺乳期女性受试者或血清妊娠试验结果阳性。

3.2给药/治疗/观察方案：

血清硒浓度低于84μg/L患者将被随机分至补充硒制剂组或对照组：补硒组每天口服硒制剂(亚硒酸钠片，上海天赐福，200-360μg/天，每日最大安全剂量为400μg)，疗程为8-12周。

对照组无补硒干预。两组患者的除了硒制剂的使用外，其余常规临床治疗方案由医生结合患者病情制定。入组后开始补充硒制剂治疗前进行疾病活动度评估，包括疾病活动度评分(CDAI、HBI评分、内镜评分)，炎症指标检测(血沉、C反应蛋白、白细胞计数、粪钙卫蛋白等)。每周电话随访症状评分(HBI评分)，8-12周后复查硒水平并再次评估疾病活动情况。在患者复查时留取肠镜组织3块。利用流式分选平台富集组织内T细胞亚群，进一步分析T细胞亚群的变化。比较相同临床药物治疗患者，补硒组和对照组疾病活动度(CDAI、HBI评分、内镜评分、炎症指标等)变化情况，以及补硒前后肠组织中T细胞亚群的比例变化。

所得结果如图3所示，图3A为补硒(selenium supplements)和不补硒(control)CD患者每周随访的疾病活动度评分(HBI评分)变化图，图3B为补硒CD患者治疗前后肠镜对比图，图3C为非IBD患者(Non-IBD patients)、CD患者不补硒(with selenite)、补硒治疗8-10周后(without selenite)结肠组织内Th1细胞的流式图，图3D为三组患者结肠Th1细胞比例统计图。

图3A结果发现补充硒组的患者症状评分下降更快，8周时评分较不补硒组更低，图3B可见患者补硒后第8-10周后肠道病变显著改善。图3C为非IBD患者(Non-IBD patients)、补硒(with selenite)治疗8-10周或未补硒(without selenite)患者结肠组织内Th1细胞的流式图，发现补充硒治疗后患者结肠内Th1比例较未补硒组患者下降。以上结果提示我们缺硒克罗恩病患者补充硒治疗可以促进疾病缓解。