一种快速鉴定蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的核酸检测方法

技术领域：

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种通过高分辨率熔解曲线快速鉴定蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的核酸检测方法。

背景技术：

蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)和苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)同属蜡样芽胞杆菌类群。其中，蜡样芽胞杆菌是我国常见的食源性条件致病菌，可产生腹泻(肠毒素)毒素和呕吐毒素。在2008至2015年期间，蜡样芽胞杆菌在我国食源性致病菌流行率中排名第三，危害性强。苏云金芽胞杆菌是一类昆虫致病菌。其在形成芽胞的同时会形成一个或多个伴胞晶体，其主要成分是杀虫晶体蛋白，因此被广泛地用作生物杀虫剂。蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌生理生化特征高度相似，可用于辨别的唯一区别是伴胞晶体的产生能力。此外，二者具有高度的遗传相似性，16S rRNA序列具有99％-100％相似性，dDDH(digital DNA-DNA hybridization)值大于物种划分阈值70％，ANI值大于物种划分阈值95％，都高于种群鉴定的标准值，极难区分。由于世界范围内没有对蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌进行有效区分的分子快速检测鉴定方法，鉴定时可能造成误判，给食品安全和产业带来极大的安全隐患。因此，亟需建立一种对蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的准确区分的方法。

目前，能够将蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌区分的方法仍然是传统生化方法，也是我国和美国FDA食品微生物安全检测的国家标准方法。依照此方法，需要培养苏云金芽胞杆菌4-5天来产生蛋白结晶体(伴胞晶体)，而其他芽胞杆菌不产生蛋白结晶体。该过程耗时，且如果游离芽胞形成不丰富，还需将培养物室温继续放置2-3天进行二次检查。此外，该方法受观察人员主观判断影响大，可能产生误判，在实际检测过程中不具有时效性与易操作性。近些年来，随着高通量测序技术的不断发展，基于基因组信息的分型与比对可实现蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的区分鉴定，但该方法需要进行DNA提取、二代测序、下游信息学分析等，耗时长、成本与操作要求高，不能满足实验室常规使用、高通量快速检测鉴定与基层检测的需要。

已有韩国研究学者发现新型靶标XRE，可用于鉴别和区分苏云金芽胞杆菌与近缘芽胞杆菌。与已有的伴胞晶体蛋白基因靶标cry2相比，XRE基因在苏云金芽胞杆菌的鉴定中具有较高的准确性。XRE的PCR结果显示蜡样芽胞杆菌或非蜡样芽胞杆菌均未扩增，利用XRE建立的实时PCR方法可鉴定苏云金芽胞杆菌，并可利用所建立的标准曲线对细胞数量进行定量。但该靶标未能同时将苏云金芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌进行检测，未能提供一种更直观并具可视化的方法。因此，亟待建立对二者进行快速准确鉴定的新型分子方法。

高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，HRM)是近年来在国外兴起的分析方法，以PCR技术为基础，通过检测目标片段单碱基差异从而进行基因变异检测与分型的分析技术。该方法不受碱基突变位点与类型局限，无需特异性探针，在PCR完成后直接运行高分辨率熔解，就可完成对样品单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)、甲基化、配型等的分析。相比较于其他分子分型诊断方法，HRM具有操作简便快速、成本低、灵敏度高、特异性好，实现了真正的闭管操作。HRM方法受到普遍关注，并已应用到各个领域，包括食品安全、环境监测、临床诊断和生物防御等领域，对细菌的鉴定及药敏试验、药物的鉴定、疾病诊断等发挥了重要作用。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种新分子靶标ispD，编码了2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate cytidylyltransferase)，作为靶标基因在区分蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌中进行应用，此应用是非疾病的和治疗目的，可在环境、食品及其生产链、临床等领域进行上述两种菌株的有效区分。所述的分子靶标ispD，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示(对应蜡样芽胞杆菌)或核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示(对应苏云金芽胞杆菌)。

本发明的第二个目的提供一种区分蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的引物对，其是根据如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列(对应蜡样芽胞杆菌)设计得到，基于HRM方法利用SNP位点对两者进行有效区分，其中在蜡样芽胞杆菌中扩增产物为SEQ ID NO.3所示核苷酸序列，在苏云金芽胞杆菌中扩增产物为SEQ ID NO.4所示核苷酸序列。

所述的引物对如下所示：

5’-AACGAAGAAGAACGCCCGTA-3’；

5’-TCTTGTCTTTCGGCTCCACC-3’。

本发明的第三个目的是提供一种快速鉴定蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的核酸检测方法，包括以下步骤：

提取待测样品的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以上述引物对作为扩增引物用高分辨率熔解曲线方法通过蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌不同特征性熔解曲线从而对二者进行有效区分。

所述的用高分辨率熔解曲线方法，其PCR反应体系包括：2x HRMAnalysis PreMix、待测样品DNA、引物对、灭菌双蒸水。

所述的PCR反应体系为：2x HRMAnalysis PreMix反应缓冲液10μL，检测样品DNA50ng，10μM上、下游引物各0.6μL，灭菌双蒸水补足体积至20μL。

所述的用高分辨率熔解曲线方法，是在LightCycler96上采用两步法反应程序进行反应，其PCR反应程序为：95℃预变性2min，一个循环；95℃变性10s；60℃进行退火及延伸30min，共进行循环40个循环；高分辨率熔解曲线反应程序为：95℃变性1min，40℃复性1min，初始熔解温度65℃开始程序，以0.07℃/s的速率升温熔解至97℃，过程中以15Readings/℃实时监测荧光信号。

本发明的第四个目的是提供一种准确筛选区分蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的新分子靶标的方法，包括如下步骤：

(1)数据库中蜡样芽胞杆菌群菌株包括蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌基因组下载、去冗余和应用Prokka软件进行基因组注释；

(2)蜡样芽胞杆菌群菌株基因组分类信息真实性确证分析：平均核苷酸同源性分析(average nucleotide identity，ANI)，以已有国际现行蜡样芽胞杆菌群或近缘物种的参考菌株作为蜡样芽胞杆菌群的标准菌株，未知菌株与标准菌株全基因组相似度进行比较分析，选用与上述标准菌株相似度最高的，初步认为未知菌株是该种；

(3)蜡样芽胞杆菌群菌株基因组分类信息真实性确证分析：应用PhyloSuite软件进行核糖体蛋白多位点序列分型(rMLST)分析，提取核糖体蛋白基因并将其串联，进行最大似然树构建，以进一步确证相关菌株种属身份。

(4)筛选区分蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的新分子靶标：对获得的身份信息真实的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌应用Roary软件进行泛基因组分析，设定阈值(Identity)为95％，选取在95％阈值处可分开的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的核心基因为潜在的分子靶标。

本发明收集尽量多的公共数据库和前期研究中蜡样芽胞杆菌族群菌株基因组，对已有的菌株分类信息进行真实性确证分析，比较基因组和泛基因组方法挖掘公共数据库中蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)和苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)可区分靶标，利用本组实验菌株验证和筛选区分蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的特征性分子靶标，包括选取分子靶标ispD基因序列中不同的SNP位点设计引物，引物对的筛选，分别以蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌为模板进行HRM实验，获得对应菌株的特征性熔解曲线信息，实现对蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的准确鉴别。

本发明对ispD基因进行序列比对，以选择SNP位点设计引物并进行筛选，以实现对该SNP位点的检测，从而有效鉴定蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌。本发明基于高分辨率熔解曲线方法，无需序列特异性探针，采用HRM分析试剂盒(EvaGreen)(购自TIANGEN)，该试剂盒利用新型饱和染料，具有抗体修饰的热启动DNA聚合酶，具有高扩增效率、高扩增特异性和宽广的可信范围，进一步增加了熔解曲线的稳定性，提高扩增的特异性，整个流程操作简单，不仅具有灵敏度高、特异性好、成本低、检测速度快等优点，而且分辨率高，可区分单个碱基的变化，同时全部反应在封闭的反应管中完成，有效的避免了交叉污染。

附图说明

图1为基于rMLST对蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的系统发育树分析；

图2为基于ispD基因全序列对蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的系统发育树分析；

图3为基于ispD基因扩增子序列对蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的系统发育树分析；

图4为基于ispD基因扩增子鉴别蜡样芽胞杆菌ATCC 14579和苏云金芽胞杆菌ATCC10792的HRM熔解曲线结果，其中A、B分别为归一化熔解峰图和熔解曲线；

图5为增加蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的HRM鉴别结果，其中A、B分别为归一化熔解峰图和熔解曲线；

图6为基于HRM方法区分蜡样芽胞杆菌及苏云金芽胞杆菌的特异性鉴定，其中A、B分别为不同标准菌株得归一化熔解峰图和熔解曲线；

图7、8为基于HRM方法鉴定蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的灵敏度检测，其中图7和8的A、B分别为归一化熔解峰图和熔解曲线，图7的C、D分别为蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌基因组DNA浓度与荧光强度的相关性分析，图8的C、D分别为单位体积内蜡样芽胞杆菌数和单位体积内苏云金芽胞杆菌与荧光强度的相关性分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例及其附图对本发明进行详细描述。

实施例1：

1.以GenBank蜡样芽胞杆菌群或近缘物种基因组和现有蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌为基础，进行基因组下载、去掉冗余不符合分析要求的基因组数据(contigs≥200)，修改基因组名称，应用Prokka软件进行基因组注释；蜡样芽胞杆菌群菌株基因组分类信息真实性确证分析：平均核苷酸同源性分析(ANI)，以已有国际现行蜡样芽胞杆菌群或近缘物种的25个参考菌株(表1)作为蜡样芽胞杆菌群的标准菌株，未知菌株与标准菌株全基因组相似度进行比较分析，选用与上述标准菌株相似度最高的，初步认为未知菌株是该种；应用PhyloSuite软件进行核糖体蛋白多位点序列分型(rMLST)分析，提取53个核糖体蛋白基因(表2)并将其串联，进行最大似然树构建。进化关系和ANI分析结果一致的菌株即为确证身份清晰的蜡样芽胞杆菌或苏云金芽胞杆菌(图1)。如图1所示，不同颜色代表不同的芽胞杆菌，基于rMLST方法可以将蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌菌株进行有效区分。筛选区分蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的新分子靶标：对获得的身份信息真实的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌应用Roary软件进行泛基因组分析，设定阈值(Identity)为95％，选取在95％阈值处可分开的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的核心基因为潜在的分子靶标ispD，核苷酸序列如下所示，SEQ ID No:1为蜡样芽胞杆菌(如蜡样芽胞杆菌ATCC 14579)的ispD核苷酸序列，SEQ ID No:2为苏云金芽胞杆菌(如苏云金芽胞杆菌ATCC 10792)的ispD核苷酸序列。

SEQ ID No:1

atgtatacattaattattccggcagcgggccaaggaaaacgaatgggtgctggtaaaaataagttatttttacttatagatgaagtaccaattattgtgcacacattgcgtgcttttgaaaaagataaagcgtgcaaaagtattattatggcaattaacgaagaagaacgcccgtattttgaagagttaatgcagaagtaccagattgaaaagcacgtacaattcattcagggtggagccgaaagacaagatagcgtctataacgcacttcagtatgcgagtggtgtcgaatatgttcttgtgcatgacggggcgcgcccgttcgtaacgaataaagtgattcgcgatgtattaactgcagcagaaaaatatggagcttccatttgtgcagtgccagtaaaagatactgttaagaaagtagagcagggtgttgttgtagaaacggtagagcgatctcaacttaacgctgtacaaacaccacaaggattctctgtttctcttttgctagaagctcatagaagcgcaaagcaaagttgttttcttggcacagatgatgcaagtcttgtagaacgtgttgggaagcaagtaggtgtagtagaggggagttactataatattaaagtgacgactccggaagatctattaattgctgaaagtttcctacgtgttcaaaagaaataa

SEQ ID No:2

atgtatacattaattattccggcagccggccaaggaaagcggatgggtgctggcaaaaataagttgttcttacttataaatgaagtaccgattatcgttcatacattacgtgcttttgaaagagataaagcgtgcaaaagtattgttatggcaattaacgaagaggaacgcccgtattttgaagaattaatgcagaagtatccgattgaaaaacaggtacaatttattcagggtggagccgaaagacaagatagtgtatataacgcgattcagcatgcgagtgatgttgaatacgttcttgtacatgacggagcgcgcccattcgtaacgaataaagtgattcaagatgtattaacagcagcagaaaaatatggagcttccatttgtgcagtgccagtaaaggatacagttaagaaggtagagcaaggtgttgttgtcgaaacggtagaacgatctcagcttaaggctgtacaaacaccgcaagggttctctgtttctcttttgctagaagctcatagaagtgcaaaacagagctgttttcttggtacagatgatgcaagtctcgtggaacgtattggaaagcaagtaggtgtagtagaagggagttactataatattaaagtgacgactccagaggatttactaattgctgaaagtttccttcatgttctgaaaaaatag

SEQ ID No:3

aacgaagaagaacgcccgtattttgaagagttaatgcagaagtaccagattgaaaagcacgtacaattcattcagggtggagccgaaagacaaga

SEQ ID No:4

aacgaagaggaacgcccgtattttgaagaattaatgcagaagtatccgattgaaaaacaggtacaatttattcagggtggagccgaaagacaaga

表1国际现行蜡样芽胞杆菌群或近缘物种的25个参考菌株

表2 53个核糖体蛋白基因

2.参考GenBank上提供及现有测序完成的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的基因序列，通过比对全基因组序列，挖掘到差异基因ispD，并基于基因序列比对得到的SNP位点设计引物。

具体引物如下：

F：5’-AACGAAGAAGAACGCCCGTA-3’；

R：5’-TCTTGTCTTTCGGCTCCACC-3’。

用此引物对进行扩增，其中在蜡样芽胞杆菌中扩增产物为SEQ ID NO.3所示核苷酸序列，在苏云金芽胞杆菌中扩增产物为SEQ ID NO.4所示核苷酸序列。

3.采用细菌DNA试剂盒(美基生物)按照说明书操作从1mL蜡样芽胞杆菌ATCC14579培养液及1mL苏云金芽胞杆菌ATCC 10792培养液中分别提取基因组DNA，用ThermoScientific

4.为了初步探究所设计引物对蜡样芽胞杆菌及苏云金芽胞杆菌的鉴别效果，基于ispD基因及其扩增子进行系统发育树分析(图2和图3)，根据邻接法进行系统发育树分析，从图2和图3得到差异基因ispD可以将蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌菌株进行有效区分。利用以上所设计的引物(步骤2中的)进行菌株PCR扩增，具体为：

以无菌水配制浓度为10μM的ispD基因正向引物溶液及反向引物溶液，ispD基因正向引物的序列：AACGAAGAAGAACGCCCGTA；ispD基因反向引物的序列：TCTTGTCTTTCGGCTCCACC；

在八联管的每个反应孔中依次加入2x HRMAnalysis PreMix 10μL和ispD基因正向引物溶液0.6μL、ispD基因反向引物溶液0.6μL，然后在不同的反应孔中分别加入基因组DNA50ng，以及作为阴性对照的无菌水，将每个反应孔以无菌水补足至20μL；在LightCycler96上采用两步法反应程序进行反应，PCR反应条件为95℃预变性2min，一个循环；95℃变性10s，60℃进行退火及延伸30min，共进行循环40个循环；HRM反应条件：95℃变性1min，40℃复性1min，初始熔解温度65℃开始程序，以0.07℃/s的速率升温熔解至97℃，过程中以15Readings/℃实时监测荧光信号。

应用LightCycler96软件分析高分辨率熔解曲线结果，从结果看来基于基因ispD的熔解曲线可以达到对蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌很好的区分效果，如图4所示，同时与系统发育树分析的结果一致，从理论上验证了基于HRM利用该引物对鉴别蜡样芽胞杆菌及苏云金芽胞杆菌的可行性。

5.基于ispD基因增加蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的菌株数(表3)以进行检测，在八联管的每个反应孔中依次加入2x HRM Analysis PreMix 10μL和ispD基因正向引物溶液0.6μL、ispD基因反向引物溶液0.6μL，然后在不同的反应孔中分别加入待检测样品基因组DNA50ng，以及作为阴性对照的无菌水，将每个反应孔以无菌水补足至20μL；在LightCycler96上采用两步法反应程序进行反应，PCR反应条件为95℃预变性2min，一个循环；95℃变性10s，60℃进行退火及延伸30min，共进行循环40个循环；HRM反应条件：95℃变性1min，40℃复性1min，初始熔解温度65℃开始程序，以0.07℃/s的速率升温熔解至97℃，过程中以15Readings/℃实时监测荧光信号。应用LightCycler96软件分析HRM结果，如图5所示，蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌得到不同的特征性熔解曲线可对二者进行有效区分。

表3高分辨率熔解曲线验证实验菌株信息

6.准确鉴定蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌后，基于ispD基因以其他标准菌株菌按照步骤5的HRM方法进行特异性检测，表4介绍了实验所采用的标准菌株，证明可有效实现对蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的鉴定(图6)，特异性好。同时以不同的模板量进行灵敏度检测并建立标准曲线，当基因组DNA浓度范围在10

表4高分辨率熔解曲线实验标准菌株信息

序列表

<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120> 一种快速鉴定蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的核酸检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 681

<212> DNA

<213> 蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)

<400> 1

atgtatacat taattattcc ggcagcgggc caaggaaaac gaatgggtgc tggtaaaaat 60

aagttatttt tacttataga tgaagtacca attattgtgc acacattgcg tgcttttgaa 120

aaagataaag cgtgcaaaag tattattatg gcaattaacg aagaagaacg cccgtatttt 180

gaagagttaa tgcagaagta ccagattgaa aagcacgtac aattcattca gggtggagcc 240

gaaagacaag atagcgtcta taacgcactt cagtatgcga gtggtgtcga atatgttctt 300

gtgcatgacg gggcgcgccc gttcgtaacg aataaagtga ttcgcgatgt attaactgca 360

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gagcagggtg ttgttgtaga aacggtagag cgatctcaac ttaacgctgt acaaacacca 480

caaggattct ctgtttctct tttgctagaa gctcatagaa gcgcaaagca aagttgtttt 540

cttggcacag atgatgcaag tcttgtagaa cgtgttggga agcaagtagg tgtagtagag 600

gggagttact ataatattaa agtgacgact ccggaagatc tattaattgc tgaaagtttc 660

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<210> 2

<211> 681

<212> DNA

<213> 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)

<400> 2

atgtatacat taattattcc ggcagccggc caaggaaagc ggatgggtgc tggcaaaaat 60

aagttgttct tacttataaa tgaagtaccg attatcgttc atacattacg tgcttttgaa 120

agagataaag cgtgcaaaag tattgttatg gcaattaacg aagaggaacg cccgtatttt 180

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cttcatgttc tgaaaaaata g 681

<210> 3

<211> 95

<212> DNA

<213> 蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)

<400> 3

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<210> 4

<211> 95

<212> DNA

<213> 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)

<400> 4

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