一种修饰有脂氧合酶基因的细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基因修饰细胞的方法，尤其涉及一种修饰有脂氧合酶基因细胞及其制备方法和应用。

背景技术

急性胰腺炎是多种病因导致胰酶在胰腺内被激活后，引起胰腺组织自身消化、水肿、出血甚至坏死的炎症反应。当合并有休克或脏器功能障碍，伴坏死、脓肿或假性囊肿时，称为重症胰腺炎(SAP)。

一些患重症胰腺炎(SAP)的病人，易发生全身炎症反应综合征(SIRS)，而SIRS极易引发远处器官损伤，导致产生多脏器功能障碍综合征(MODS)，成为SAP治疗的最后障碍。为改善此病症，现有技术中多利用脂氧素类药品进行配合治疗。但由于现有的脂氧素类药品均是体外合成，价格昂贵，且进入体内后作用周期短、易失效，从而限制了其临床应用。

近年来，随着生物工程技术的迅速发展，利用相关基因修饰细胞以进行基因治疗成为一种较普遍的方式，其安全性高，作用周期长，能够很好地进行临床应用。

因此，有必要提供一种基因修饰的细胞，其能够在体内合成脂氧素，在炎症早期进行干预，从而对SIRS进行有效负调控。

发明内容

为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，将脂氧合酶基因通过基因转导的方法转入宿主细胞，得到的修饰有脂氧合酶基因的细胞，具有早期提高局部LXA4水平的功能，而且还能够负调控SIRS，抑制SAP向危重程度发展，从而完成了本发明。

具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：

第一方面，本发明提供了一种修饰有脂氧合酶基因的细胞，其中，所述细胞由携带有脂氧合酶基因的重组病毒转导至宿主细胞得到。

第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的修饰有脂氧合酶基因的细胞的制备方法，其中，所述方法包括以下步骤：

步骤1，构建含有脂氧合酶基因的重组病毒表达载体；

步骤2，利用步骤1构建的重组病毒表达载体制备重组病毒；

步骤3，将重组病毒转导至经过培养的宿主细胞内，获得修饰有脂氧合酶基因的细胞。

第三方面，本发明提供了一种第二方面所述方法制备的修饰有脂氧合酶基因的细胞。

第四方面，本发明提供了一种第一方面所述的修饰有脂氧合酶基因的细胞或第二方面所述方法制备的修饰有脂氧合酶基因的细胞在制备抗炎药物方面的应用。

本发明所具有的有益效果包括：

(1)本发明所述的修饰有脂氧合酶基因的细胞的制备方法，简单安全，条件易控，成本低廉；

(2)本发明所述的修饰有脂氧合酶基因的细胞，其具有早期提高局部LXA4水平的功能，能够负调控SIRS、抑制SAP向危重程度发展；

(3)本发明所述的修饰有脂氧合酶基因的细胞，在体内合成脂氧素，作用周期长。

附图说明

图1示出本发明实验例1中修饰有12-脂氧合酶基因的293T细胞的明场效果图；

图2示出本发明实验例1中修饰有12-脂氧合酶基因的293T细胞的荧光效果图；

图3示出本发明实验例3中通过Elisa检测LXA4表达量的结果图。

具体实施方式

下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。

在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

本发明的第一方面，提供了一种修饰有脂氧合酶基因的细胞，所述细胞由携带有脂氧合酶基因的重组病毒转导至宿主细胞得到。

根据本发明一种优选的实施方式，所述宿主细胞可以为脐带血干细胞、原代培养细胞、神经干细胞、胚胎干细胞、293T细胞中的一种或多种。

在进一步优选的实施方式中，所述宿主细胞为293T细胞。

其中，原始293细胞系来自未知父母身份的流产人胚胎的肾，是由剪切的5型人腺病毒(Ad5)DNA转化的原代人胚肾细胞的永生系。293T细胞是由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，经过腺病毒E1A基因的转染，能够表达SV40大T抗原(一种能够转化多种细胞类型的强大的癌蛋白)，含有SV40复制起始点与启动子区。许多真核表达载体(如pcDNA3.1)中含有SV40病毒的复制起始位点，可以在表达SV40病毒T抗原的细胞系复制，从而提高外源基因的表达水平。因此，293T细胞广泛应用于病毒包装和表达外源基因。

根据本发明一种优选的实施方式，所述脂氧合酶基因为5-脂氧合酶基因、12-脂氧合酶基因和15-脂氧合酶基因中的一种或多种。

本发明人研究发现，脂氧素是花生四烯酸的代谢产物，由脂氧合酶(Lipoxidase，LOX)作用于花生四烯酸后生成，其在体内合成主要有以下三条途径：(1)炎症物质花生四烯酸(AA)在白细胞内通过5-脂氧合酶(5-LO)途径合成白三烯后，部分被转入血小板内，由12-脂氧合酶(12-LO)催化生成LXA4(5S，6R，15S-三羟基-7,9,11,13-二十四碳烯酸)和LXB4(5S，14R，15S-三羟基-6，8，10，12-二十四碳烯酸)；(2)AA也可在单核细胞、嗜酸性粒细胞或上皮细胞内被15-脂氧合酶(15-LO)催化生成中间产物后，再由中性粒细胞中的5-LO催化生成LXA4和LXB4；(3)为阿司匹林触发的15-立体异构体-LXA4(15-epi-LXA4)合成途径，当上皮细胞中的环氧合酶-2被阿司匹林乙酰化后，具备了15-LO的功能，经此途径合成的LX15C上的羟基为R构象，即15-epi-LXA4和15-epi-LXB4。

在进一步优选的实施方式中，所述脂氧合酶基因为12-脂氧合酶基因。

由上述可知，体内自然合成LXA4过程中，需要多种细胞的参与，涉及的关键酶有5-LO、12-LO。其中5-LO已经在炎症局部的中性粒细胞内表达，单独5-LO途径与合成促炎脂类介质密切相关，如白细胞三烯类(LTA4、LTB4、LTC4和LTD4等)。一般情况下，5-LO与15-LO不能单独修饰细胞生成LXA4，需要组合使用。

因此，本发明中优选选择12-脂氧合酶基因修饰宿主细胞及通过模拟这条体内LXA4合成的途径，通过早期将该细胞靶向注入炎症部位，在有明显炎症细胞如中性粒细胞存在的情况下，可以利用促炎脂类介质如白三烯在炎症局部早期、大量合成抗炎介质LXA4，调控炎症反应。

由于抗炎介质LXA4的合成取决于炎症介质及12-脂氧合酶的表达量，与现有技术中所述的5-脂氧合酶基因和15-脂氧合酶基因需联合使用修饰宿主细胞相比，本发明中优选选择的12-脂氧合酶基因可对宿主细胞进行单基因修饰，修饰更加简单，且能够在炎症早期通过提高LXA4的水平进行炎症调控，可控性高。

本发明的第二方面，还提供了一种修饰有脂氧合酶基因的细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1，构建含有脂氧合酶基因的重组病毒表达载体。

步骤2，利用步骤1构建的重组病毒表达载体制备重组病毒。

步骤3，将重组病毒转染至经过培养的宿主细胞内，获得修饰有脂氧合酶基因的细胞。

以下进一步详细描述所述制备方法：

步骤1，构建含有脂氧合酶基因的重组病毒表达载体。

其中，步骤1包括以下子步骤：

步骤1-1，获得脂氧合酶基因。

其中，采用聚合酶链式反应(PCR)扩增出脂氧合酶基因片段，本发明中优选从NCBI上查找获得基因序列，设计引物，扩增出12-脂氧合酶基因；经电泳鉴定片段大小正确后回收目的片段。

步骤1-2，构建含有脂氧合酶基因的重组克隆质粒。

根据本发明一种优选的实施方式，以商业化的pGC-FU-3FLAG-SV40-puromycin-library载体为骨架，利用限制性内切酶Agel和Bam HI对载体进行酶切，并利用T4连接酶将经相同的限制性内切酶处理过的脂氧合酶基因进行连接，构建含有脂氧合酶基因的重组克隆质粒。

在进一步优选的实施方式中，将构建的重组克隆质粒进行转化、筛选及培养后提取质粒DNA。

在本发明中，将上述构建的重组克隆质粒转化至大肠杆菌E.coli DH-5α感受态细胞中，挑选转化后的阳性单菌落进行PCR鉴定，然后提取质粒。

在更进一步优选的实施方式中，对上述提取的质粒DNA进行酶切和测序鉴定，以保证基因序列正确。

其中，所述酶切选择的内切酶为Agel和Bam HI，将PCR鉴定证实的单克隆送测序机构测序，将测序结果与已知的脂氧合酶基因标准序列进行比对，以保证获得的脂氧合酶基因正确。

步骤1-3，将脂氧合酶基因接入病毒载体，获得含有脂氧合酶基因的重组病毒表达载体。

根据本发明一种优选的实施方式，所述脂氧合酶基因接入的病毒载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体和腺病毒载体中的一种或多种。

在进一步优选的实施方式中，所述脂氧合酶基因接入的病毒载体为慢病毒载体。

其中，所述慢病毒载体是指在人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)基础上改造而成的，能利用逆转录酶和整合酶将目的RNA转变为DNA并整合到宿主细胞的染色体中，从而使目的基因在宿主细胞中长期而稳定的表达。

慢病毒与逆转录病毒相比，对分裂细胞(无核膜)和非分裂细胞(有核膜)均具有转导能力，慢病毒的整合前复合体能通过ATP依赖的核孔复合体进入细胞核，从而能稳定且高效的转导各种哺乳动物细胞系和原代细胞。

在更进一步优选的实施方式中，所述慢病毒载体为Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin。

根据本发明一种优选的实施方式，分别对慢病毒载体Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin和步骤1-2中构建的重组克隆质粒进行双酶切，所述限制性内切酶为Agel和Bam HI。

在进一步优选的实施方式中，对酶切得到的脂氧合酶基因片段和慢病毒载体片段进行回收和纯化，再利用连接酶进行连接。

在更进一步优选的实施方式中，将连接产物进行转化、筛选及培养后提取质粒DNA，并对提取的质粒DNA进行酶切鉴定。

在本发明中，将连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH-5α感受态细胞中，摇菌培养及涂板后，挑选转化后的阳性单菌落进行PCR鉴定，然后提取质粒，利用Agel和Bam HI两种内切酶进行酶切，并电泳鉴定。

步骤2，利用步骤1中构建的重组病毒表达载体制备重组病毒。

其中，步骤2包括以下子步骤：

步骤2-1，利用重组表达载体包装重组病毒。

根据本发明一种优选的实施方式，在进行包装前，培养包装细胞，所述包装细胞为293T细胞。

在进一步优选的实施方式中，所述包装细胞在含胎牛血清FBS的DMEM培养基中培养，所述胎牛血清FBS的含量为10％(体积分数)。

其中，所述DEME培养基是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，广泛应用于疫苗生产和各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养。

优选地，所述包装细胞为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞。

在更进一步优选的实施方式中，所述包装细胞的培养在37℃、5％CO

根据本发明一种优选的实施方式，所述病毒包装选用的是第二代病毒包装系统，包括目的质粒、包装质粒和包膜质粒。

其中，所述第二代病毒包装系统包装出的病毒滴度高，所述滴度指的是病毒悬液的浓度，即稀释度的倒数，是指pfu的数值。

在进一步优选的实施方式中，所述包装质粒为pHelper 1.0载体，所述包膜质粒为pHelper 2.0载体。

在本发明中，所述目的质粒为步骤1中制备的含有脂氧合酶基因的重组病毒表达载体，其优选为GV慢病毒载体，含有HIV的基本元件5'LTR和3'LTR，以及其他辅助元件。pHelper 1.0载体含有HIV病毒的gag基因(编码病毒主要的结构蛋白)；pol基因(编码病毒特异性的酶)；rev基因(编码调节gag和pol基因表达的调节因子)。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。

其中，所述目的质粒上的目的基因在包装细胞的细胞质中转录为RNA，被包装到病毒颗粒中；控制gag/pol表达的顺式作用序列在目的质粒上，gag编码病毒的衣壳蛋白，pol编码病毒中的逆转录酶和整合酶，在病毒转导细胞后，逆转录酶在细胞质中使目的RNA逆转录为DNA，整合酶在细胞核中使目的DNA整合入受体细胞基因组而稳定表达；VSV-G在病毒与宿主细胞融合时发挥作用。

在更进一步优选的实施方式中，所述目的质粒、包装质粒和包膜质粒的重量比为20：(10～20)：(5～15)，优选为20：(12～17)：(7～12)，更优选为20：15：10。

优选地，所述目的质粒为20μg，所述pHelper 1.0载体质粒为15μg、pHelper 2.0载体质粒为10μg。

本发明人经过大量研究试验得出，当上述三种质粒的重量比为20：(10～20)：(5～15)，优选为20：(12～17)：(7～12)，更优选为20：15：10时，病毒包装效率最高。

根据本发明一种优选的实施方式，将目的质粒、包装质粒和包膜质粒置于培养有包装细胞的DEME培养液中，并使用质粒转染试剂盒进行转染。

优选地，所述质粒转染试剂盒为ExpiFectamine 293转染试剂盒。

优选地，对包装后的重组病毒进行滴度检测，所述检测包括以下步骤：

(1)测定前一天，使用293T贴壁细胞铺板，96孔板，每孔4板，每孔4×10

(2)根据病毒的预期滴度，准备7～10个无菌的EP管，每管中加入90μl的无血清DMEM培养基；

(3)取待测定的重组病毒原液10μl加入到第一个EP管中，混匀后，取10μl加入到第二个EP管中(所得病毒原液浓度为第一个EP管中的1/10)，继续相同的操作直到最后一管；

(4)选取所需的细胞孔，弃去90μl培养基，加入90μl稀释好的病毒溶液，培养箱培养；

(5)24h后，加入完全培养基100μl，小心操作，不要吹起细胞；

(6)4天后，显微镜下观察荧光表达情况，荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。

其中，病毒滴度的计算公式为病毒滴度＝活细胞数/病毒原液量，其中活细胞数为显微镜下观察到的荧光细胞数。

步骤2-2，将步骤2-1中包装的重组病毒进行浓缩、纯化，得到重组病毒。

在本发明中，要达到人体基因治疗的要求，重组病毒必须去除产品中的蛋白杂质、DNA杂质、内毒素等来确保产品的质量、有效性及安全性。因此，需要对包装的重组病毒进行浓缩、纯化。

所述包装的重组病毒按照以下步骤进行浓缩、纯化：

步骤2-2-1，收集转染后48h的细胞上清液，并离心，去除细胞碎片。

其中，转染可记为第0h。

根据本发明一种优选的实施方式，所述离心在4℃下进行，转速为3500～4500g，时间为8～12min。

优选地，所述转速为4000g，时间为10min。

步骤2-2-2，取上清液过滤，并进行超速离心。

根据本发明一种优选的实施方式，所述过滤采用0.45μm过滤器进行。

在进一步优选的实施方式中，将过滤后的上清液置于离心管中，进行超速离心，所述离心的转速为22000～28000rpm，离心时间为1.5～2.5h，离心温度为4℃。

优选地，所述离心的转速为25000rpm，离心时间为2.0h。

其中，所述离心机优选为Beckman超速离心机。

步骤2-2-3，弃上清，对沉淀进行重悬，然后离心。

其中，离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液轻轻反复吹打重悬，所述病毒保存液可以为PBS或细胞培养基。需要注意的是，此步骤会导致病毒存在一定程度的损失，应尽可能地避免病毒长时间暴露在室温中。

经充分溶解后，再次进行高速离心，转速为8000～12000rpm，优选为10000rpm，离心时间为4～6min，优选为5min。

步骤3，将重组病毒转染至经过培养的宿主细胞内，获得修饰有脂氧合酶基因的细胞。

其中，步骤3包括以下子步骤：

步骤3-1，对宿主细胞进行培养。

在本发明中，所述宿主细胞可以为脐带血干细胞、原代培养细胞、神经干细胞、胚胎干细胞、293T细胞中的一种或多种，优选为293T细胞。

根据本发明一种优选的实施方式，所述培养为将宿主细胞加入培养基进行培养，其中，所述培养基为DMEM培养基，优选为高糖型DMEM培养基(含4.5g/L葡萄糖)，其含有10％FBS和1％青链霉素。

在进一步优选的实施方式中，所述培养在37℃，CO

在更进一步优选的实施方式中，所述培养周期为48～72h。

优选地，在培养48h后，采用普通光学显微镜对培养后的宿主细胞进行镜检检测，若培养后的宿主细胞增多，且贴壁牢靠，则符合要求。

步骤3-2，将步骤2中得到的重组病毒转导至培养后的宿主细胞内，获得脂氧合酶基因修饰的293T细胞。

其中，所述步骤3-2包括以下子步骤：

步骤3-2-1，制备宿主细胞悬液，并接种至培养板中。

其中，采用90％DMEM+10％胎牛血清制备宿主细胞悬浮液，所述宿主细胞悬浮液的密度为3×10

在本发明中，所述细胞培养板优选为6孔板，单孔底面积为10cm

步骤3-2-2，24h后更换培养基，加入重组病毒进行转导，培养8～10h后，更换培养基，继续培养。

其中，在接种细胞后24h更换新培养基，并加入感染增强液，所述感染增强液为HitransGP，优选加入量为40μl/孔。

根据细胞MOI值及病毒滴度，加入相应体积的重组病毒，其中，加入的重组病毒体积＝(MOI×细胞数目)/病毒滴度。

所述MOI指的是转导时病毒与细胞数量的比值，在本发明中，所述MOI优选为10～50。

将上述转导体系置于37℃培养8～10h，更换为常规培养基，继续培养，所述常规培养基为DMEM培养基，具体成分为90％DMEM+10％胎牛血清(体积分数)。

步骤3-2-3，继续培养，保持细胞活性，转导后72h，检测转导效率。

在转导后培养的过程中，可通过更换培养基保持细胞活性，在转导后约72h，检测转导效率，优选采用qRT-PCR进行检测。其中，可以根据实际转导情况，校正MOI。

本发明的第三方面，提供了一种第二方面所述方法制备的修饰有脂氧合酶基因的细胞。

本发明的第四方面，提供了一种第一方面所述的修饰有脂氧合酶基因的细胞或第二方面所述方法制备的修饰有脂氧合酶基因的细胞在制备抗炎药物方面的应用。

实施例

以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

(1)构建含有脂氧合酶基因的重组病毒表达载体：

采用PCR从NCBI上查找获得基因序列，设计引物，扩增得到12-脂氧合酶基因片段；经电泳鉴定片段大小为2034bp，回收目的片段；

将12-脂氧合酶基因片段与Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin载体同时利用限制性内切酶Agel和Bam HI进行酶切处理，然后将处理后的片段进行电泳回收后，利用T4连接酶进行连接，构建重组克隆质粒；将重组克隆质粒转化至大肠杆菌E.coli DH-5α感受态细胞中，挑选转化后的阳性单菌落进行PCR鉴定，然后提取质粒，对重组克隆质粒进行双酶切及电泳检测，确保12-脂氧合酶基因序列正确；

利用限制性内切酶Agel和Bam HI分别对慢病毒载体Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin和重组克隆质粒进行双酶切，然后将酶切后的片段进行电泳回收后，利用T4连接酶进行连接，构建重组慢病毒表达载体；将构建的重组慢病毒表达载体进行菌落PCR鉴定，同时经Agel和Bam HI双酶切鉴定，并进行电泳检测。

(2)制备重组病毒：

在37℃、5％CO

将20μg重组慢病毒表达载体质粒、15μg pHelper 1.0载体质粒和10μg pHelper2.0载体质粒混合，置于293T细胞的DMEM培养基中，然后采用转染试剂盒ExpiFectamine293转染试剂盒，按其步骤进行转染；

对制备后的重组病毒进行滴度检测，按照以下步骤进行；

1)测定前一天，使用293T贴壁细胞铺板，96孔板，每孔4板，每孔4×10

2)根据病毒的预期滴度1×10

3)取待测定的重组病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中，继续相同的操作直到最后一管；

4)选取所需的细胞孔，弃去90μl培养基，加入90μl稀释好的病毒溶液，培养箱培养；

5)24h后，加入完全培养基100μl，小心操作，不要吹起细胞；

6)4天后，显微镜下观察荧光表达情况，荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。

其中，病毒滴度的计算公式为病毒滴度＝活细胞数/病毒原液量，其中活细胞数为显微镜下观察到的荧光细胞。

检测重组病毒的病毒滴度为10

收集转染后48h(转染即可为0h计起)的293T细胞上清液，于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；以0.45μm过滤器过滤上清液，并置于40ml超速离心管中，放入至Beckman超速离心机内,设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入PBS轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清。

(3)获得修饰有12-脂氧合酶基因的293T细胞：

将293T细胞加入高糖型(4.5g/L的葡萄糖)DMEM培养基(含10％胎牛血清+1％青链霉素)中进行培养，培养条件为37℃，CO

经过48h的培养后，采用普通光学显微镜对培养后的293T细胞进行镜检检测，若培养后的宿主细胞增多，且贴壁牢靠，则符合要求。

将步骤(2)中得到的重组病毒按照以下步骤转导至293T细胞中：

采用DMEM培养基制备293T细胞的悬浮液，使其浓度为4×10

接种细胞后24h，更换新的培养基，使得每个孔中的体积为1ml，每个孔加入40μl感染增强液HitransGP；

根据MOI值及病毒滴度，加入1.6μl重组病毒，其中，加入的重组病毒体积＝(MOI×细胞数目)/病毒滴度；

将上述体系置于37℃培养9h，更换为常规培养基DMEM培养基，具体成分为90％DMEM+10％胎牛血清。

转导后72h，检测转导效率。

对比例

本对比例所用方法与实施例1相似，区别在于，步骤(1)中的表达载体不含12-脂氧合酶基因，为空载体。

实验例

分别采用尼康Nikon ECLIPSE Ti-s的普通光镜和荧光显微镜对实施例1中制备的修饰有12-脂氧合酶基因的293T细胞内12-脂氧合酶的表达进行检测，结果如图1和图2所示。

由图1和图2可知，293T细胞被12-脂氧合酶基因修饰后，荧光效果明显，说明12-脂氧合酶基因已成功转染293T细胞。

采用Applied Biosystems 7500fast PCR仪，通过逆转录定量PCR(qRT-PCR)反应鉴定实施例1和对比例1中制备的修饰有12-脂氧合酶基因的293T细胞内12-脂氧合酶的过表达水平，其中，采用的PCR程序为：

95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 30s，60℃ 15s。

反应体系为：cDNA 3μl；正向引物2μl；反向引物2μl；荧光染料(SYBR Green)3μl，共10μl。

正向引物序列为GCTTCAGGCTCAACTGGAGA，反向引物序列为GGCAGCCAGGTATTGCTTCT。

PCR扩增结果如表1所示：

表1

由表1可知，实施例1中最终获取的修饰后的293T细胞内12-脂氧合酶基因表达丰度有明显的提高。

将实施例1和对比例1(空载体-293T细胞)中制备的12-脂氧合酶基因修饰的293T细胞在37℃，5％CO

由图3可知，实施例1制备的293T细胞的检测结果中脂氧素(LXA4)的浓度有明显表达增高，其表达量是对比例1的5倍，说明修饰有12-脂氧合酶基因的293T细胞能够在炎症早期、高浓度地获得脂氧素干预。

综上可知，本发明所述的修饰有12-脂氧合酶基因的293T细胞，具有早期提高局部脂氧素A4水平的功能，能够负调控炎症反应和系统性过度炎症反应，抑制重症急性胰腺炎等炎症疾病向危重程度发。且为单基因修饰，制备简单，成本低廉。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。