一种姜黄素复合物及其制备方法和检测方法

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种具有提高姜黄素生物利用率的姜黄素复合物及其制备方法和检测方法。

背景技术

姜黄素(curcumin,CUR)又称姜黄色素或酸性黄，是从姜黄、莪术、郁金等姜黄属植物块茎中提取的一种多酚类天然抗氧化剂，外观为橙色结晶粉末的二酮类化合物，是国内外广泛使用的天然食用色素和调味品等食品添加剂。同时具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保护心肌、抗纤维化、降血脂和抗动脉粥样硬化等多种药理活性，并被美国国立肿瘤所列为第三代抗癌化学预防药。

姜黄素目前的市售产品主要包括姜黄素胶囊和姜黄素片等，近几年国内外姜黄素的市场需求和行业价格整体呈现上涨态势。但Cur的水溶性较低(11ng/mL，25℃)，且性质不稳定(光、热、强酸强碱、以及某些金属离子存在下不稳定)，并可能受到肠粘膜细胞内I相代谢酶CYP450或肠道内尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)、以及药物外排蛋白-P糖蛋白的影响，导致其口服后的体内生物利用度较差，严重制约了其进一步的开发推广。

在基础研究领域中，针对姜黄素的口服递送，主要采用纳米技术设计药物剂型，如①纳米凝胶(J Agric Food Chem,2012,60,5373-5379)、②固体脂质纳米粒(Mol.Nutr.Food Res.2015,55,495-503)、③纳米乳(J Agric Food Chem,2012,60,5373-5379)、④纳米囊(Chem-Biol Interact,2012,195,206-214)、⑤纳米粒(J Agric FoodChem,2011,59,9280-9)、⑥胶束(Mol.Nutr.Food Res,2014,58,516-527；Colloids andSurfaces B Biointerfaces,2015,133:108-119；Int.J.Pharm.2014,477,261-272)；⑦微乳(J Agric Food Chem,2012,60,7137-7141)、和⑧脂质体(Int.J.Nanomedicine,2012,7,5995-6002；Drug Delivery,2017,24,1605-1616)，等。

基于纳米技术的制剂手段可以改善药物的吸收，但纳米产品的成本较高、且稳定性和大生产等环节目前仍有较大转化困难，并且不适用于原料进一步加工的需求。此外，目前已有的报道大多集中在固体分散、包合技术和药物联用等方面，虽可改善药物的吸收，并有一定的产业化前景。但从整体来讲，相关研究内容略显模糊笼统，缺乏明确而深入的研究确证。这一方面是由于姜黄素自身的吸收性质尚有不明确的地方，除了明确其水溶性差、不稳定和生物利用度低之外，关于其脂溶性大小、膜渗透性高低、不稳定性主要因素、肠粘膜内外排泵/代谢酶的影响大小，均无明确一致的结论。而在此背景下，许多研究仅是笼统的制备药物剂型并显示出一定的吸收改善，而对剂型发挥作用的原因、以及如何进一步优化，涉及不多，这也为今后的转化工作和实际应用带来了一定的隐患。

对此，我们结合前期的研究经验，将采用细胞和动物模型，结合现代分析技术，对药物的吸收机制和剂型的改进优化，进行细致的研究和明确的阐述。另一方面，目前研究大都用磷脂复合物、包合物、稀释剂/吸收促进剂等手段，但并非所有制剂手段均可改善吸收，要根据具体的药物性质选择适合的手段。我们在后续研究中，除了上述剂型工艺外，还将考虑结合药物胃肠道吸收机制采用一些功能性高分子辅料以提高药物稳定性和肠粘膜细胞内的摄取、或根据药物分子结构，通过分子间非共价键作用，采用一些惰性分子复配，提高药物溶解度或膜渗透性，从而提高其口服吸收。

目前，文献报道中多采用纳米制剂提高姜黄素口服吸收生物利用度，但纳米制剂组成和工艺复杂，难以实际应用推广，且成本较高。部分药物制剂所采用的一些药用辅料如吸收促进剂等，在长期服用的情况下可能会造成对人体胃肠道的副作用。而一些保健品行业领域内的口服产品，大都是软胶囊或片剂居多，没有明显的改善生物利用度的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种生产工艺简单、稳定的姜黄素复合物及其制备方法，大大提高了姜黄素的生物利用率。

本发明的另一目的还在于提供了一种姜黄素复合物中姜黄素含量的检测方法。

本发明采用的技术方案如下：一种姜黄素复合物，包含由辅料和姜黄素研磨形成的固体复合物，其中，姜黄素与辅料的质量比为1：(0.1-10)，所述的辅料包括Soluplus、泊洛沙姆407(Kolliphor P407)或泊洛沙姆188(Kolliphor P188)。

其中，所述的Soluplus为聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物，是一种新型的两亲性非离子型药用高分子材料,为白色至微黄色自由流动粉末，几乎无味，玻璃转化温度(T

所述的Kolliphor P407的平均分子量9,800-14,600，聚氧乙烯(70％，w/w)和聚氧丙烯嵌段共聚物，粗燥的白色粉末,无味无臭，HLB值为22，对难溶性物质具有良好的增溶作用。适用于物理混合、熔融制粒、喷雾干燥、热熔挤出、溶液、液体混悬、脂质给药系统、凝胶剂、软胶囊填充等多种工艺技术。

所述的Kolliphor P188也叫泊洛沙姆188，其平均分子量7,680-9,510，聚氧乙烯(80％，w/w)和聚氧丙烯嵌段共聚物，HLB值为29。在液态口服、外用和注射制剂中用作乳化剂、增溶剂或混悬稳定剂，在固体制剂中则用作增塑剂和生物利用度促进剂。适用于物理混合、熔融制粒、喷雾干燥、热熔挤出、溶液、液体混悬、脂质给药系统、乳剂和乳膏、软膏剂、泡沫剂、凝胶剂、透皮贴剂、外用膜剂、软胶囊填充等多种工艺技术。

作为优选，所述的辅料还包括西柚粉或胡椒粉。

作为优选，所述的辅料为西柚粉和泊洛沙姆407；或者，所述的辅料为西柚粉和泊洛沙姆188。

本发明还提供了上述姜黄素复合物的制备方法，包括：由姜黄素和辅料混合置于研磨仪中研磨10～30min，使两者充分接触后制得。

作为优选，上述姜黄素复合物的制备方法，包括：先将姜黄素粉碎至粒径为10～30μm、辅料气流粉碎至粒径为20～50μm，再将姜黄素和辅料混合置于研磨仪中研磨10～30min，使两者充分接触后制得。

本发明将姜黄素粉碎成10～30μm、普朗尼克通过气流粉碎成20～50μm，两者粒径差别不大，混合后置于研磨仪低温研磨，使两者充分接触，这样可以通过普朗尼克的表面活性作用降低姜黄素表面静电，有利于保持混合物料的稳定性。即本发明通过控制粉碎后的粒径，以及通过混合研磨(降低姜黄素的表面静电，增强与普朗尼克的相互作用)，从而避免混合物料的分层，另外，普朗尼克与姜黄素的紧密结合，也有利于发挥普朗尼克提高姜黄素溶解度和溶出度的作用。

进一步优选，所述研磨的具体工艺为：研磨仪在频率为20-80Hz条件下研磨2次，每次研磨时间为0.5-3min，两次研磨的间隔时间为5-15s。

本发明还提供了一种姜黄素复合物中姜黄素含量的检测方法，包括：将所述姜黄素复合物制得供试品溶液，再利用HPLC检测方法检测得到；所述HPLC检测的条件为：色谱柱为Plastisil ODS，其尺寸为150×4.6nm，5μm；检测波长为421nm；流动相为体积比为40:12:48的乙腈、甲醇和水，等度洗脱；流动相流速为1.0mL/min；柱温为25℃；进样量为20μL。

本发明的检测方法是一种简单、可重复、稳定的用于测定姜黄提取物中的姜黄素的HPLC-UV方法，该方法可以同时检测姜黄素，去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素对应的三个峰。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)针对现有加工技术中的热处理可能对姜黄素造成的破坏以及深加工产品经常面临产品长期放置后的稳定性差，姜黄素容易结晶析出，造成溶出下降的问题，本发明提供了一种更加简单、稳定的方法，具体采用生物相容性良好的辅料与姜黄素混合研磨后进一步提高其生物利用度，处方工艺简单，姜黄素的晶型并未改变，不仅质量控制更完整、可靠，而且成本较低且便于大规模生产。

(2)针对现有技术中的姜黄素复合物大部分属于深加工产品，其后期的再加工(如粉碎，混合和后期处理等方面)受到一定限制的问题，本发明提供了一种不仅可直接面向使用人群，亦可用于进一步的剂型加工领域，大大扩宽了产品的适用面。

附图说明

图1为不同制备方法制得的姜黄素复合物在水中的分散照片，其中A为姜黄素原料；B为姜黄素复合物3；C为姜黄素复合物3a。

图2为姜黄素复合物的扫描电镜图。

图3为姜黄素复合物中的姜黄素溶出曲线。

图4为姜黄素复合物中姜黄素被Caco-2细胞摄取的荧光图。

图5为姜黄素原料、不同的姜黄素/普朗尼克(P407)复合物以及姜黄素市售产品的大鼠灌胃吸收动力学曲线。

图6为姜黄素原料分别与西柚粉、胡椒碱和P407混合后，大鼠灌胃给药后的姜黄素动力学曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

下列实施例所用仪器包括：电子天平(AL204，METTLER TOLEDO梅特勒-托利多上海有限公司)，自动研磨仪(JXFSTPRP24，上海净信实业发展有限公司)，六联磁力加热搅拌器(CJJ-931，江苏金坛市金城国胜实验仪器厂)，智能溶出试验仪(ZRS-8G，TDTF天大天发)，台式空气恒温震荡箱(THZ-C，江苏海门市麒麟医用仪器厂)，高效液相色谱仪(Agilent1260)，冷场发射扫描电子显微镜(SU-8010，日本日立公司)，荧光显微镜(SW-CJ-EFD，上海博讯实业有限公司)，漩涡混混合仪(XW-80A，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，离心机(AG22331，Eppendorf)，超纯水仪(ResearchUVF，上海和泰仪器有限公司)，鼓风干燥箱(DHG-9123A型，上海益恒实验仪器有限公司)。

实施例1：姜黄素复合物的制备

姜黄素原料药(95％，JIAHERB Phytochem)，Soluplus(BASF)，Kolliphor P407(BASF)，Kolliphor P188(BASF)，西柚粉(纯度80％)，胡椒粉。

1.1.1姜黄素复合物1的制备

称取姜黄素和Soluplus，按质量比1：9混合于研磨仪配套的2ml试管中，每管加入2粒小号钢珠，摇匀后放入研磨仪，频率65Hz，研磨2次每次1分钟，两次之间间隔10s，得到姜黄素复合物1。

1.1.2姜黄素复合物2的制备

称取姜黄素和Kolliphor P188，按质量比2：1混合于研磨仪配套的2ml试管中，每管加入2粒小号钢珠，摇匀后放入研磨仪，频率65Hz，研磨2次每次1分钟，两次之间间隔10s，得到姜黄素复合物2。

1.1.3姜黄素复合物3的制备

称取姜黄素和Kolliphor P407，按质量比2：1混合于研磨仪配套的2ml试管中，每管加入2粒小号钢珠，摇匀后放入研磨仪，频率65Hz，研磨2次每次1分钟，两次之间间隔10s，得到姜黄素复合物3。

先将姜黄素粉碎至粒径为10～30μm、Kolliphor P407气流粉碎至粒径为20～50μm，按质量比2：1混合于研磨仪配套的2ml试管中，每管加入2粒小号钢珠，摇匀后放入研磨仪，频率65Hz，研磨2次每次1分钟，两次之间间隔10s，得到姜黄素复合物3a。

将姜黄素原料以及上述的姜黄素复合物3和姜黄素复合物3a分别分散于水中，具体状况的照片如图1所示，由图1可知，姜黄素不溶于水，在水中分散后容易沉淀或聚集贴附于器壁上，而经过短时间混合研磨的物料，分散溶解性能有明显改善，但依然有少量聚集，粒径偏大，溶液不够均一。相比之下，将物料分别粉碎后，再进行混合研磨后，姜黄素分散良好，溶液较为均一稳定，无明显聚集或沉淀。

1.1.4姜黄素复合物4的制备

称取姜黄素、Kolliphor P407、西柚粉按质量比2:1:2混合于研磨仪配套的2ml试管中，每管加入2粒小号钢珠，摇匀后放入研磨仪，频率65Hz，研磨2次每次1分钟，两次之间间隔10s，得到姜黄素复合物4。

1.1.5姜黄素复合物5的制备

称取姜黄素、Kolliphor P407、胡椒碱按质量比10:5:4混合于研磨仪配套的2ml试管中，每管加入2粒小号钢珠，摇匀后放入研磨仪，频率65Hz，研磨2次每次1分钟，两次之间间隔10s，得到姜黄素复合物5。

姜黄素以及上述制备得到的姜黄素复合物1、姜黄素复合物2、姜黄素复合物3的扫描电镜图(3000×，标尺表示10μm)见图2，由图2可知，姜黄素与各种辅料混合研磨后，姜黄素形貌并未发生明显改变。

实施例2：HPLC含量检测实验

试剂：甲醇(一级色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司)，乙腈(HPLC级，MerckLichrosolv)，冰醋酸(HPLC级，阿拉丁)，

材料：姜黄素原料药(95％，JIAHERB Phytochem)，姜黄素标准品(鼎瑞化工(上海)有限公司)，Soluplus(BASF)，Kolliphor P407(BASF)，Kolliphor P188(BASF)。

HPLC检测条件为：参考色谱柱条件Plastisil ODS，150*4.6nm，5μm；检测波长为421nm；流动相为乙腈：甲醇：水(0.3％高效液相色谱级冰醋酸)＝40:12:48等度洗脱；流速为1.0mL/min；柱温：25℃；进样量为20μL。

对照品制备方法为：精密称取姜黄素对照加甲醇溶解配制成浓度为1mg/mL的母液，依次用甲醇稀释成500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL，62.5μg/mL，31.25μg/mL，15.625μg/mL，7.812μg/mL，3.906μg/mL，1.953μg/mL，0.977μg/mL，0.488μg/mL，0.244μg/mL，0.122μg/mL。按上述摸索出的色谱条件进样，分别记录其出峰时间和峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

供试品制备方法为：分别称取等质量辅料Soluplus，Kolliphor P407，KolliphorP188和姜黄素原料药于研磨仪配套的2ml试管中，每管加入2粒小号钢珠，摇匀后放入研磨仪，频率60Hz，研磨2分钟。取70mg研磨后的粉末于10ml离心管，加入7ml超纯水并于恒温震荡箱37℃，100rpm震荡72小时，移取上层液体13000rpm高速离心，取上清液进高效液相色谱仪分析，检测得到的姜黄素含量结果见下表1。

表1.姜黄素在不同混合物中的溶解度

实施例3：体外溶出实验检测

同实施例2。

HPLC检测条件和对照品制备方法同实施例2。

供试品制备方法为：分别称取等质量辅料Soluplus，Kolliphor P407，KolliphorP188和姜黄素原料药于研磨仪配套的2ml试管中，每管加入2粒小号钢珠，摇匀后放入研磨仪，频率60Hz，研磨2分钟。溶出介质为0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液900mL，转速75rpm。取Soluplus，KolliphorP407，Kolliphor P188和姜黄素共研磨混合物各20mg，姜黄素原料药(姜黄素对照组)10mg进行实验，于5min，10min，20min，40min，1h，1.5h，2h，3h，4h，6h，8h用取样针在同一位置取样3ml，立刻补充同温等量溶出介质(0.5％SDS)，取出的样品经0.22μm微孔滤膜过滤后进高效液相色谱仪分析。

检测结果为：研磨后的姜黄素原料药(姜黄素对照组)、Soluplus、KolliphorP407、Kolliphor P188和姜黄素共研磨混合物溶出实验结果如图3所示。由图3可知，在前5个取样点(5min，10min，20min，40min，1h)时，Soluplus、Kolliphor P407、Kolliphor P188组中由于辅料的存在使姜黄素的溶出明显加快，其中Kolliphor P188组在10min时姜黄素溶出已经达到80％以上，20min时溶出达到90％以上。

实施例4：细胞实验

仪器：培养箱，共聚焦皿，共聚焦显微镜。

耗材：Caco-2细胞，HT-29细胞和Raji-B细胞，DMEM高糖培养液，R1640培养液，EDTA-胰酶，PBS。

Caco-2细胞在DMEM高糖培养液(含10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素混合溶液、1％非必需氨基酸)中进行培养，置于37℃、5％CO

1.3.1实验分组

姜黄素组，Kolliphor P407组，Kolliphor P188组。

1.3.2试验方法

取对数生长期的Caco-2细胞以4×104个细胞/mL的密度接种在共聚焦皿中。第一周培养基每隔一天更换一次，第二周开始每天更换培养基。在37℃，5％CO

1.3.3实验结果

实验结果如图4的共聚焦显微镜照片(60×)所示，由图4可知，与姜黄素对照组相比，Kolliphor P188组绿色荧光明显增强，表明KolliphorP188具有较好的促进姜黄素摄取的作用。

采用灵敏度较高的流式细胞仪测定姜黄素荧光值进行定量计算药物的细胞摄取率。

1.4.1实验分组

空白组，姜黄素组，Kolliphor P407组，Kolliphor P188组，维拉帕米组，叠氮化钠组，酮康唑组。

1.4.2实验方法

采用三细胞模型：取对数生长期的Caco-2细胞和HT-29细胞分别以7×104个细胞/mL和3×104个细胞/mL的密度接种在6孔板中。第一周培养基每隔一天更换一次，第二周开始每天更换培养基培养14天，最后3天取对数生长期的Raji-B细胞以1×104个细胞/mL的密度接种其中。14天后，除去培养液，加入抑制剂半小时后，再加含药制剂(姜黄素组浓度为20μg/mL，维拉帕米浓度为300μg/mL，叠氮化钠浓度为1mg/mL，酮康唑浓度为10μg/mL)无血清培养液培养4小时。避光条件下除去含药培养液，用PBS洗涤三次，0.25％EDTA-胰酶消化后，加入含血清培养液终止消化，1200rpm离心5min，PBS洗涤2次后重悬，过筛。利用姜黄素能够自发荧光的特性，于流式细胞仪中定量测定姜黄素的细胞摄取率(488nm激发，蓝光，FL1，530±15nm，FITC/GFP)。

1.4.3实验结果

维拉帕米是p蛋白抑制剂，维拉帕米处理过的组别与姜黄素对照组相比，细胞对姜黄素的摄取量提高2倍，证明姜黄素的吸收受p糖蛋白外排的影响。叠氮化钠是常用的能量依赖性转运抑制剂(主动转运抑制剂、胞吞作用抑制剂等)，叠氮化钠组的细胞对姜黄素的摄取量提高一倍以上，证明姜黄素可能通过主动运输入胞。酮康唑是常用的CYP3A4特异性抑制剂，酮康唑组细胞对姜黄素的摄取量增大五倍以上，证明游离姜黄素的吸收差的原因之一是其受Ⅰ相代谢酶CYP3A4影响。与姜黄素研磨对照组相比，Kolliphor P407和Kolliphor P188组细胞对姜黄素的摄取有所增加，其中Kolliphor P188组摄取量提高近两倍，见下表2。

表2.姜黄素细胞摄入量的初步筛选

实施例5：动物实验

SD(Sprague-Dawley)大鼠，雄性，200g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。

灌胃给药：利用实施例1制备的姜黄素复合物2和姜黄素复合物3灌胃给药，在此命名为姜黄素复合物2组(P188组)和姜黄素复合物3组(P407组)；还包括姜黄素原料组、市售姜黄素品牌原料药Longvida组以及Indena组，灌胃给药剂量为50mg/kg。

血样取点时间：15min,30min,45min,1h,2h,3h,4h,5h

取血及血样处理方法：对大鼠进行眼眶取血并用肝素化的1.5mLEP管(制备方法：取适量肝素钠溶于超纯水中配成浓度为1％的肝素钠溶液，取0.1mL于1.5mL EP管内并使之均匀浸润内壁，放入烘箱烘干备用)采集血样，每管采血0.5mL。2000rpm离心5min，取上层血浆150μL加入100μL尼群地平乙酸乙酯溶液(250μg/mL)，再加入1ml乙酸乙酯，涡旋混匀2min，12000rpm离心5min吸取上清液，吹干乙酸乙酯后用100μL甲醇复溶，涡旋30s，进样高效液相色谱仪测定(进样量20μL)。标曲溶液同法处理。

具体的实验结果如图5和下表3和表4所示，由结果可知，市售产品并未体现出显著改善，姜黄素复合物3生物生物利用度明显优于市售，说明已改善生物利用率的姜黄素原料。

表3不同姜黄素制剂的大鼠灌胃给药后的体内动力学参数(AUC)

表4不同姜黄素制剂的大鼠灌胃给药后的体内动力学参数(相对生物利用度)

实施例6：动物实验

SD(Sprague-Dawley)大鼠，雄性，200g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。

灌胃给药：利用实施例1制备的姜黄素复合物4、姜黄素复合物5灌胃给药，分别命名为西柚粉组和胡椒粉组；另外，将姜黄素复合物3溶于乙醇，旋蒸除去乙醇得到的制剂命名为口服407溶解组，灌胃给药剂量为50mg/kg。

同实施例5。

具体的实验结果如图6和下表5所示，由结果可知，姜黄素复合物4和姜黄素复合物5可以发挥抑制代谢的作用，与姜黄素搭配使用，进一步提高了姜黄素的生物利用率。

表5姜黄素分别与西柚粉、胡椒碱和P407混合后的大鼠灌胃给药后的体内动力学参数(AUC)