使用具有锌结合部分的磷酸肌醇3-激酶抑制剂的联合治疗

相关申请

本申请要求2018年9月11日提交的美国临时申请号62/729,648的权益。上述申请的全部教导通过引用并入本文。

背景技术

用于治疗癌症的治疗方案通常涉及使用两种以上药剂的联合治疗(combinationtherapy)。特别地，可以联合靶向治疗以更有效地治疗各种类型的癌症并抑制对治疗有抗性的癌细胞的发展。在癌症药物开发领域中，需要用于治疗特定类型癌症的特别有效的药物组合。

发明内容

本发明涉及使用式I的化合物或其药学上可接受的盐和PD-1信号转导抑制剂治疗癌症的联合治疗：

式中，R为氢或酰基。酰基优选为R

本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物包含：式I的化合物或其药学上可接受的盐、PD-1信号转导抑制剂以及药学上可接受的赋形剂或载体。

在本文中，式I的化合物(特别是式中R为氢并且A为2-甲氧基-5-吡啶基的式I的化合物)也称为化合物1，其具有用作治疗剂的有益性质，例如用于治疗与PI3激酶活性和/或HDAC活性有关的癌症以及其他疾病和病症。例如，化合物1在体外对分子靶标PI3K和HDAC具有有效的抑制活性并且对多种癌细胞具有有效的抗增殖活性。如在动物模型中观察到的，化合物1具有显著的口服生物利用度(oral bioavailability)。在荷异种移植瘤(xenograft tumor)的小鼠中口服给药或静脉内给药后，该化合物显示出显著的被肿瘤组织吸收和肿瘤组织中的药效学活性。在口服施用或静脉内施用之后，化合物1在小鼠异种移植瘤模型中也显示出显著的抗肿瘤活性。例如，通过使用Ames试验的基因毒性试验所显示的，该化合物还具有良好的安全性。

附图说明

如附图所示，通过以下对本发明的优选实施方式的更具体的描述，本发明的前述和其他目的、特征和优点将变得显而易见。

图1是如实施例11中所述的小鼠CT26.WT异种移植模型中肿瘤体积与时间的关系图。

图2是如实施例12中所述的小鼠A20异种移植模型中肿瘤体积与时间的关系图。

具体实施方式

本发明涉及用于癌症的联合治疗的方法和组合物，所述组合物包含式I的化合物或其药学上可接受的盐和PD-1信号转导抑制剂。在式I化合物的一个优选实施方式中，A为甲氧基、氨基或N-甲基氨基取代的苯基、吡啶基或嘧啶基。更优选地，A为下述基团之一：

在式I化合物的某些实施方式中，A为上述基团之一，并且R为氢。

在一个优选实施方式中，式I的化合物选自下述化合物1、化合物2和化合物3及其药学上可接受的盐：

本发明提供了预防或治疗有需要的受试者的癌症的方法。该方法包括向受试者施用式I的化合物或其药学上可接受的盐和PD-1信号转导抑制剂的步骤，其中，式I的化合物或其药学上可接受的盐和PD-1信号转导抑制剂以治疗上有效的组合量来施用。

PD-1信号转导抑制剂可以为抑制PD-1信号转导的任何化合物。例如，PD-1信号转导抑制剂可以抑制PD-1和/或PD-1的活化配体(例如PD-L1或PD-L2)。PD-1信号转导抑制剂可以为小分子、多核苷酸或蛋白质，例如抗体。优选地，PD-1信号转导抑制剂为单克隆抗体、更优选为人源化单克隆抗体或全人源单克隆抗体。在一个实施方式中，PD-1信号转导抑制剂为抗PD-1单克隆抗体。在另一个实施方式中，PD-1信号转导抑制剂为抗PD-L1单克隆抗体。在另一个实施方式中，PD-1信号转导抑制剂为抗PD-L2单克隆抗体。合适的PD-1信号转导抑制剂包括但不限于US 8,008,449、WO 2006/121168、WO 2009/114335、US 8,354,509、US 8,609,089、US 2010/0028330、US 2012/0114649、WO 2007/005874、WO2010/077634、US7,943,743、US 2012/0039906和WO/2011/066342中所述的那些，其全部内容通过引用并入本文。合适的PD-1信号转导抑制剂的实例包括YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C、MDX-1105和AMP-224。优选的PD-1信号转导抑制剂包括：派姆单抗(pembrolizumab)(KEYTRUDA

在本发明的方法和组合物的特别优选的实施方式中，式I的化合物为化合物1。

在本发明的特别优选的实施方式中，PD-1信号转导抑制剂为派姆单抗或尼沃鲁单抗。

在本发明方法的某些实施方式中，将式I的化合物或其药学上可接受的盐和PD-1信号转导抑制剂作为单独的成分同时施用于受试者。在某些实施方式中，将式I的化合物或其药学上可接受的盐和PD-1信号转导抑制剂通过相同或不同的施用途径同时施用于受试者。

在某些实施方式中，将式I的化合物或其药学上可接受的盐和PD-1信号转导抑制剂作为单独的成分依次施用于受试者。在某些实施方式中，将式I的化合物和PD-1信号转导抑制剂通过相同或不同的施用途径依次施用于受试者。在一个实施方式中，在将式I的化合物或其药学上可接受的盐施用于受试者之后，将PD-1信号转导抑制剂施用于受试者。在另一个实施方式中，在将式I的化合物或其药学上可接受的盐施用于受试者之前，将PD-1信号转导抑制剂施用于受试者。

在某些实施方式中，式I的化合物或其药学上可接受的盐和PD-1信号转导抑制剂作为单独的成分施用，并且每种组合物独立地经粘膜、口服、直肠、阴道、舌下、静脉内、肌内、皮下、经颊(bucally)、鼻内、脑池内、腹膜内或耳内施用。在某些实施方式中，一种组合物或两种组合物均以栓剂或水凝胶施用。在优选实施方式中，两种组合物均口服施用。

在式I的化合物或其药学上可接受的盐和PD-1信号转导抑制剂作为单独的成分施用的某些实施方式中，它们的施用时机是使得药剂的药理活性在时间上重叠，从而发挥联合治疗效果。例如，式I的化合物或其药学上可接受的盐和PD-1信号转导抑制剂可以以超过约60分钟的时间间隔依次施用。例如，依次施用式I的化合物或其药学上可接受的盐与PD-1信号转导抑制剂之间的时间可超过60分钟、超过2小时、超过5小时、超过10小时、超过1天、超过2天、超过3天或超过1周。最佳施用时间将取决于式I的化合物或其药学上可接受的盐和PD-1信号转导抑制剂的吸收、分布、代谢和/或排出的速率。

可以先施用式I的化合物或其药学上可接受的盐，或者先施用PD-1信号转导抑制剂。例如，可在施用式I的化合物或其药学上可接受的盐的时间之后向受试者施用PD-1信号转导抑制剂。在此种情况下，希望在约50％(例如，约40％、约30％、约20％、约10％、约5％)的式I的化合物被受试者代谢或排出的时间之前施用PD-1信号转导抑制剂。在另一个实例中，向受试者施用第一剂的式I的化合物或其药学上可接受的盐，然后施用单剂的PD-1信号转导抑制剂，然后再施用另一剂的式I的化合物或其药学上可接受的盐。

在某些实施方式中，式I的化合物或其药学上可接受的盐和PD-1信号转导抑制剂以单一剂型(dosage form)施用，所述单一剂型经粘膜、口服、直肠、阴道、舌下、静脉内、肌内、皮下、经颊、鼻内施用、脑池内、腹膜内或耳内施用。优选地，口服施用该单一剂型。

可以约每周一次、每天约一次或每天一次以上施用式I的化合物。在一个实施方式中，口服施用式I的化合物或其药学上可接受的盐。在另一个实施方式中，肠胃外(例如静脉内)施用式I的化合物或其药学上可接受的盐。式I的化合物或其药学上可接受的盐可以以约1mg至约1,500mg的日剂量施用。例如，式I的化合物或其药学上可接受的盐可以以约200mg的日剂量施用。在一个实施方式中，式I的化合物或其药学上可接受的盐以约1mg/kg体重至约250mg/kg体重的剂量施用。

然而，应理解，个体患者的式I的化合物或其药学上可接受的盐和PD-1信号转导抑制剂的剂量频率和日总剂量可由本领域技术人员(例如主治医师在合理的医学判断范围内)确定。任何特定患者的具体剂量将取决于多种因素，包括：正在治疗的病症和病症的严重程度；所用特定化合物的活性；所用的具体组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；所用特定化合物的施用时间、施用途径和排出速率；治疗的持续时间；与所用特定化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域公知的类似因素。

术语“癌症”指由恶性赘生性细胞(neoplastic cell)的增殖引起的任何癌症，例如肿瘤、赘生物(neoplasm)、恶性上皮肿瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤等。例如，癌症包括但不限于间皮瘤、白血病和淋巴瘤，例如皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、非皮肤性外周T细胞淋巴瘤、与人类嗜T细胞病毒(HTLV)有关的淋巴瘤(例如成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL))、B细胞淋巴瘤(例如弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL))、急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性淋巴性白血病(CLL)、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、成人T细胞白血病淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)或肝细胞癌。其他实例包括：骨髓增生异常综合征；儿童实体瘤，例如脑肿瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、威尔姆斯瘤(Wilms’tumor)、骨肿瘤和软组织肉瘤；成人常见实体瘤，例如头颈癌(例如口腔癌、喉癌、鼻咽癌和食道癌)、泌尿生殖癌(例如前列腺癌、膀胱癌、肾癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌)、肺癌(例如小细胞癌和非小细胞癌)、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤和其他皮肤癌、胃癌、脑肿瘤、与戈林综合症(Gorlin’s syndrome)有关的肿瘤(例如髓母细胞瘤、脑膜瘤等)和肝癌。可通过本发明化合物治疗的癌症的其他示例性形式包括但不限于：骨骼癌或平滑肌癌、胃癌、小肠癌、直肠恶性肿瘤、唾液腺癌、子宫内膜癌、肾上腺癌、肛门癌、直肠癌、甲状旁腺癌和垂体癌。

例如，本文所述化合物可用于预防、治疗和研究的其他癌症为结肠癌、家族性腺瘤性息肉病恶性肿瘤和遗传性非息肉病性结肠直肠癌或黑色素瘤。此外，癌症包括但不限于：唇癌、喉癌、下咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺癌(甲状腺髓样癌和甲状腺乳头状癌)、肾癌、肾实质癌、宫颈癌、宫体癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、睾丸癌、泌尿器官癌、黑色素瘤、脑肿瘤(例如胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、脑膜瘤、髓母细胞瘤和周围神经外胚层瘤、胆囊癌、支气管癌、多发性骨髓瘤、基底细胞瘤(basalioma)、畸胎瘤、视网膜母细胞瘤、脉络膜黑色素瘤、精原细胞瘤、横纹肌肉瘤、颅咽管瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、尤文肉瘤(Ewing sarcoma)和浆细胞瘤。在本发明的一个方面，本发明提供了本发明的一种以上化合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

在一个实施方式中，待治疗的癌症是血液学癌症。血液学癌症包括白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。实例包括淋巴细胞性白血病，例如急性淋巴细胞性白血病，包括前体B急性成淋巴细胞性白血病、前体T急性成淋巴细胞性白血病、伯基特白血病和急性双表型白血病；慢性淋巴细胞性白血病，包括B细胞幼淋巴细胞白血病(prolymphocytic leukemia)；以及骨髓性白血病，例如急性骨髓性白血病，包括急性早幼粒细胞性白血病、急性粒细胞白血病和急性巨核细胞白血病；慢性骨髓性白血病，包括慢性单核细胞白血病；急性单核细胞白血病。其他白血病包括：毛细胞白血病；T细胞幼淋巴细胞白血病；大颗粒淋巴细胞性白血病；以及成人T细胞白血病。

淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、NK细胞淋巴瘤和前体淋巴赘生物。B细胞淋巴瘤包括伯基特淋巴瘤/白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病/小细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤(例如

T细胞和NK细胞淋巴瘤包括皮肤T细胞、T细胞幼淋巴细胞白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞性白血病、侵袭性NK细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤、与肠病相关的T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、母细胞NK细胞淋巴瘤、蕈状真菌病(Mycosis fungoides)/Sezary综合征、原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴增生性疾病，例如原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、外周T细胞淋巴瘤，除非另有说明，否则为血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。

在优选实施方式中，待治疗的癌症为非霍奇金淋巴瘤，更优选为B细胞淋巴瘤。在特别优选的实施方式中，待治疗的癌症为弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，例如ABC亚型的DLBCL、GCB亚型的DLBCL、双重打击(double hit)DLBCL或双重表达(double expresser)DLBCL(Quintanilla-Martinez，L.，Hematol.Oncol.2015，33：50-55)。在某些实施方式中，癌症是复发性或难治性DLBCL。

在一个实施方式中，本发明提供了式I的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于与PD-1信号转导抑制剂组合治疗癌症的药物中的用途。在另一个实施方式中，本发明提供了式I的化合物或其药学上可接受的盐和PD-1信号转导抑制剂在制备用于治疗癌症的药物中的用途。在一个优选实施方式中，式I的化合物为化合物1或其药学上可接受的盐，PD-1信号转导抑制剂为派姆单抗或尼沃鲁单抗。

本发明还涉及包含式I的化合物或其药学上可接受的盐和PD-1信号转导抑制剂的药物组合物。在一个实施方式中，式I的化合物为化合物1、化合物2或化合物3，PD-1信号转导抑制剂为派姆单抗或尼沃鲁单抗。

式I的化合物或其药学上可接受的盐和PD-1信号转导抑制剂可通过任何合适的方式施用，包括但不限于肠胃外、静脉内、肌内、皮下、植入、口服、舌下、颊、鼻、肺、透皮、局部、阴道、直肠和经粘膜施用等。局部施用还可涉及透皮施用的使用，例如透皮贴剂或离子电渗疗法装置。药物制剂包括固体、半固体或液体制剂(片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、栓剂、乳膏剂、软膏剂、气雾剂、粉剂、液体剂、乳剂、悬浮剂、糖浆剂、注射剂等)，该药物制剂包含式I的化合物或其药学上可接受的盐、PD-1信号转导抑制剂或两者，其适用于选定的施用方式。在一个实施方式中，药物组合物经口服施用，因此被配制成适于口服施用的形式，即，作为固体或液体制剂。合适的固体口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、球剂(pellet)、小药囊和泡腾剂、散剂等。合适的液体口服制剂包括溶液剂、悬浮剂、分散剂、乳剂、油剂等。在本发明的一个实施方式中，将组合物配制在胶囊中。根据该实施方式，除活性化合物和惰性载体或稀释剂之外，本发明的组合物还包含硬明胶胶囊。

通常用作载体或稀释剂的任何惰性赋形剂可以用于本发明的制剂中，例如树胶、淀粉、糖、纤维素材料、丙烯酸酯或它们的混合物。优选的稀释剂是微晶纤维素。该组合物还可包含崩解剂(disintegrating agent)(例如交联羧甲基纤维素钠)和润滑剂(例如硬脂酸镁)，并且还可包含一种以上选自下组的添加剂：粘合剂、缓冲剂、蛋白酶抑制剂、表面活性剂、增溶剂、增塑剂、乳化剂、稳定剂、增粘剂、甜味剂、成膜剂或它们的任意组合。此外，本发明的组合物可以为控释制剂或速释制剂的形式。

对于液体制剂，药学上可接受的载体可以为水性或非水性溶液、悬浮液、乳剂或油。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐溶液和缓冲介质。油的实例是石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、橄榄油、葵花籽油和鱼肝油。溶液或悬浮液还可包含以下成分：注射用无菌稀释剂(例如水)、盐溶液、固定油(fixed oil)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及调节张力(tonicity)的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱(例如盐酸或氢氧化钠)调节pH。

此外，组合物还可包含粘合剂(例如阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、卡波姆(carbomer)、乙基纤维素、瓜尔胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮)、崩解剂(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸、二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、瓜尔胶、羧基乙酸淀粉钠、Primogel)、各种pH和离子强度的缓冲液(如tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、防止吸附到表面上的添加剂(如白蛋白或明胶)、洗涤剂(例如Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆酸盐)、蛋白酶抑制剂、表面活性剂(例如月桂基硫酸钠)、渗透促进剂、增溶剂(例如甘油、聚乙二醇、聚乙二醇)、助流剂(例如、胶体二氧化硅)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠、丁基羟基茴香醚)、稳定剂(例如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、增粘剂(例如卡波姆、胶体二氧化硅、乙基纤维素、瓜尔胶)、甜味剂(例如蔗糖、阿斯巴甜、柠檬酸)、调味剂(例如薄荷、水杨酸甲酯或橙色调味剂)、防腐剂(例如硫柳汞、苄醇、对羟基苯甲酸酯)、润滑剂(例如硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠)、助流剂(例如胶体二氧化硅)、增塑剂(例如邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯)、乳化剂(例如卡波姆、羟丙基纤维素)、月桂基硫酸钠)、聚合物涂料(例如泊洛沙姆或泊洛沙明)、涂料和成膜剂(例如乙基纤维素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)和/或助剂。

在一个实施方式中，活性化合物与载体一起制备，所述载体将保护化合物免于从体内快速消除，例如控释制剂，包括植入物和微囊递送系统。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。此类制剂的制备方法对本领域技术人员而言是显而易见的。该材料也可购自西安杨森制药有限公司(ALZA Corporation)和Nova Pharmaceuticals，Inc.。脂质体悬浮液也可以用作药学上可接受的载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法(例如，如美国专利号4,522,811中所述)来制备。

为了易于施用和剂量一致，配制单位剂型的口服组合物是特别有利的。如本文所用，“单位剂型”指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位均包含预定量的活性化合物，经计算该预定量的活性化合物可以与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果。本发明的单位剂型的规格取决于并直接依赖于：活性化合物的独特特性和要实现的特定治疗效果，以及将此种活性化合物配混用于个体治疗的领域中固有的局限性。

用于口服施用的本发明制剂可包含一种以上渗透增强剂，包括长链脂肪酸或其盐，例如癸酸和癸酸钠。

在一个优选实施方式中，可以将化合物配制成用于静脉内注射的水溶液。在一个实施方式中，可以适当地使用增溶剂。特别优选的增溶剂包括环糊精和改性环糊精，例如磺酸取代的β-环糊精衍生物或其盐，包括磺丁基衍生化β-环糊精，例如由CyDex,Inc.以商品名

药物组合物可以与用药说明书一起包含在容器、包装或分液器中。

每日施用可以连续重复几天至几年的时间。口服治疗可能会持续一周至患者一生。优选地，施用可连续进行5天，之后可对患者进行评估以确定是否需要进一步施用。施用可以为连续或间断的，例如连续数天治疗、然后休息期。本发明的化合物可在治疗的第一天静脉内施用，在第二天和此后的所有连续天口服施用。

包含活性成分的药物组合物的制备方法在本领域中是公知的，例如，通过混合、制粒或片剂形成方法。活性治疗成分通常与药学上可接受且与活性成分相容的赋形剂混合。对于口服施用，将活性剂与为此目的常规添加的添加剂(例如赋形剂、稳定剂或惰性稀释剂)混合，通过常规方法转化为适合施用的形式，例如如上所述的片剂、包衣片剂、硬或软明胶胶囊、水溶液、酒精溶液或油性溶液等。

向施用患者的化合物的量小于将引起患者毒性的量。在某些实施方式中，向患者施用的化合物的量小于导致患者血浆中化合物浓度等于或超过该化合物毒性水平的量。优选地，患者血浆中化合物的浓度维持在约10nM。在一个实施方式中，患者血浆中化合物的浓度维持在约25nM。在一个实施方式中，患者血浆中化合物的浓度维持在约50nM。在一个实施方式中，患者血浆中化合物的浓度维持在约100nM。在一个实施方式中，患者血浆中化合物的浓度维持在约500nM。在一个实施方式中，患者血浆中化合物的浓度维持在约1000nM。在一个实施方式中，患者血浆中化合物的浓度维持在约2500nM。在一个实施方式中，患者血浆中化合物的浓度维持在约5000nM。在实施本发明时，应向施用患者的化合物的最佳的量将取决于所用的特定化合物和所治疗的癌症类型。

定义

以下列出了用于描述本发明的各种术语的定义。除非在特定情况下另有限制，无论是单独使用或作为较大的组的一部分使用，这些定义适用于在整个说明书和权利要求书中使用的术语。

术语“酰基”指氢、烷基、部分饱和或完全饱和的环烷基、部分饱和或完全饱和的杂环、芳基，以及杂芳基取代的羰基。例如，酰基包括基团，例如(C

术语“烷基”包括具有1至约20个碳原子或优选1至约12个碳原子的直链或支链基团。更优选地，烷基是具有1至约10个碳原子的“低级烷基”。最优选地，烷基是具有1至约8个碳原子的低级烷基。此种基团的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。

术语“烯基”包括具有至少一个碳-碳双键的直链或支链基团，其具有2至约20个碳原子或优选地2至约12个碳原子。更优选地，烯基是具有2至约10个碳原子、更优选约2至约8个碳原子的“低级烯基”基团。烯基基团的实例包括：乙烯基、烯丙基、丙烯基、丁烯基和4-甲基丁烯基。术语“烯基”和“低级烯基”包括具有“顺式”和“反式”取向或“E”和“Z”取向的基团。

术语“炔基”包括具有至少一个碳-碳三键的直链或支链基团，其具有2至约20个碳原子或优选地2至约12个碳原子。更优选地，炔基是具有2至约10个碳原子、更优选约2至约8个碳原子的“低级炔基”基团。炔基的实例包括：炔丙基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔、2-丁炔基和1-戊炔基。

单独或组合使用的术语“芳基”指含有1个、2个或3个环的碳环芳族体系，其中，此类环可以悬垂(pendent)方式连接在一起或可以稠合。术语“芳基”包括芳族基团，例如苯基、萘基、四氢萘基、茚满和联苯。

术语“杂芳基”包括不饱和杂环基。杂芳基的实例包括：含有1至4个氮原子的不饱和的3元至6元、优选5元或6元的杂环单环基团，例如，吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三唑基(例如4H-1,2,4-三唑基、1H-1,2,3-三唑基、2H-1,2,3-三唑基等)、四唑基(例如1H-四唑基、2H-四唑基等)；含有1至5个氮原子的不饱和稠合杂环基，例如吲哚基、异吲哚基、吲哚嗪基(indolizinyl)、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基、吲唑基、苯并三唑基、四唑并哒嗪基(例如，四唑并[1,5-b]哒嗪基等)等；含有氧原子的不饱和3元至6元、优选5元或6元的杂环单环基团，例如吡喃基、呋喃基等；含有硫原子的不饱和3元至6元杂环单环基，例如噻吩基等；含有1至2个氧原子和1至3个氮原子的不饱和3元至6元、优选5元或6元的杂环基，例如恶唑基、异恶唑基、恶二唑基(例如1,2,4-恶二唑基、1,3,4-恶二唑基、1,2,5-恶二唑基等)等；含有1至2个氧原子和1至3个氮原子的不饱和稠合杂环基(例如苯并恶唑基、苯并恶二唑基等)；包含1至2个硫原子和1至3个氮原子的不饱和3元至6元、优选5元或6元的杂环单环基，例如噻唑基、噻二唑基(例如1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基等)等；含有1至2个硫原子和1至3个氮原子的不饱和稠合杂环基(例如苯并噻唑基、苯并噻二唑基等)等。

术语“取代的”指用指定取代基的基团取代给定结构中的一个以上氢基，所述取代基包括但不限于：卤素、烷基、烯基、炔基、芳基、杂环基、硫醇、烷硫基、芳硫基、烷基硫代烷基、芳基硫代烷基、烷基磺酰基、烷基磺酰基烷基、芳基磺酰基烷基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、卤代烷基、氨基、三氟甲基、氰基、硝基、烷基氨基、芳基氨基、烷基氨基烷基、芳基氨基烷基、氨基烷基氨基、羟基、烷氧基烷基、羧基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基羰基烷基、酰基、芳烷氧基羰基、羧酸、磺酸、磺酰基、膦酸、芳基、杂芳基、杂环和脂族基。应理解，取代基可以进一步被取代。

在赘生物、肿瘤生长或肿瘤细胞生长的情况下，术语“抑制”可通过原发性或继发性肿瘤的出现延迟、原发性或继发性肿瘤的发展减慢、原发性或继发性肿瘤的发生减少、疾病继发效应的严重程度减慢或减少、肿瘤生长停滞和肿瘤消退等来评估。在本文中，在极端情况下，完全抑制称为预防或化学预防。

如本文所用，术语“转移”指癌细胞从原始肿瘤部位通过血液和淋巴血管迁移而在其他组织中产生癌症。转移也是用于在远处生长的继发性癌症的术语。

如本文所用，术语“赘生物”指由过度的细胞分裂引起的组织异常块。赘生物可以为良性的(非癌性)或恶性的(癌性)，也可以称为肿瘤。术语“赘生物”是导致肿瘤形成的病理过程。

如本文所用，术语“癌前期(pre-cancerous)”指非恶性病症，但是如果不及时治疗可能会变成恶性病症。

术语“增殖”指经历有丝分裂的细胞。

术语“治疗”指任何过程、作用、应用、疗法等，其中，哺乳动物(包括人类)为了直接或间接地改善哺乳动物的状况而接受医疗救助。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指在合理的医学判断范围内适合与人和低等动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应等的那些盐，且与合理的收益/风险比相称。药学上可接受的盐是本领域公知的。例如，S.M.Berge等在J.PharmaceuticalSciences1977，66：1-19中详细描述了药学上可接受的盐。这些盐可在本发明化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，或者通过使游离碱官能团与合适的有机酸或无机酸反应而分开制备。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例包括但不限于与无机酸或有机酸或通过使用本领域中使用的其他方法(例如离子交换)形成的氨基盐，无机酸例如为盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸，有机酸例如为乙酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、乳糖酸或丙二酸。其他药学上可接受的盐包括但不限于：己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属或碱土金属盐包括：钠、锂、钾、钙、镁等。其他药学上可接受的盐在适当时包括无毒的铵、季铵和使用抗衡离子(例如卤化物、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、具有1-6个碳原子的烷基磺酸根、磺酸根和芳基磺酸根)形成的胺阳离子。已经发现某些盐，例如钠盐、钾盐和胆碱盐以及酸式盐(例如硫酸盐和甲磺酸盐)可改善式I的化合物在药学上可接受的水性介质中的溶解度。在一个实施方式中，化合物1的药学上可接受的盐是胆碱盐。优选的化合物1的盐包括钠盐和钾盐。其他优选的盐包括硫酸盐和甲磺酸盐。化合物1的特别优选的盐是甲磺酸盐和苯磺酸盐。化合物2的特别优选的盐是盐酸盐。

如本文所用，“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，例如无菌无热原水。合适的载体描述于最新版的Remington's Pharmaceutical Sciences(本领域的标准参考)，其内容通过引用并入本文。此种载体或稀释剂的优选实例包括但不限于水、盐溶液、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可使用脂质体和无水载体，例如固定油。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。除非迄今为止任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑将其用于组合物中。补充活性化合物也可以掺入组合物中。

如本文所用，术语“癌前期”指非恶性病症，但是如果不及时治疗可能会变成恶性病症。

如本文所用，术语“受试者”指动物。优选地，动物是哺乳动物。更优选地，哺乳动物是人。受试者还指例如狗、猫、马、牛、猪、豚鼠、鱼、鸟等。

本发明的化合物可通过附加适当的官能团来进行修饰，以增强选择性生物学特性。此种修饰在本领域中是已知的，可包括增加对给定生物系统(例如血液、淋巴系统、中枢神经系统)的生物渗透性、增加口服利用率、增加溶解度以允许通过注射施用、改变代谢作用和改变排泄率的那些修饰。

本发明的药物组合物包含与一种以上药学上可接受的载体或赋形剂配制在一起的治疗有效量的式I的化合物(例如化合物1)或其药学上可接受的盐和PD-1信号转导抑制剂。

优选地，药学上可接受的载体或赋形剂是任何类型的无毒惰性的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包囊材料或制剂助剂。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例为：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；环糊精，例如α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液，以及其他无毒的相容润滑剂，例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂(coating agent)、甜味剂、增味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中，根据配方设计师的判断。

本发明的药物组合物可以口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻、颊、阴道或经植入型药盒(implanted reservoir)施用，优选通过口服施用或通过注射施用。本发明的药物组合物可以包含任何常规的无毒的药学上可接受的载体、佐剂或载体。在一些情况下，可以用药学上可接受的酸、碱或缓冲剂来调节制剂的pH，以增强配制的化合物或其递送形式的稳定性。如本文所用，术语肠胃外包括：皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。

口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂和酏剂(elixir)。除活性化合物以外，液体剂型还可包含本领域常用的惰性稀释剂(例如水或其他溶剂)、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及它们的混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包含佐剂，例如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。

可根据已知技术使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制可注射制剂，例如无菌的可注射水性或油质悬浮液。无菌注射制剂还可以为在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液、悬浮液或乳剂，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的载体和溶剂为水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，在注射剂的制备中使用脂肪酸(例如油酸)。

可注射制剂可以被灭菌，例如，通过细菌截留过滤器(bacterial-retainingfilter)过滤，或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂，该无菌固体组合物可在使用前溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。

为了延长药物的作用，通常需要减慢皮下或肌内注射药物的吸收。这可通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又取决于晶体尺寸和晶形。或者，通过将药物溶解或悬浮在油载体中来实现肠胃外施用的药物形式的延迟吸收。通过在可生物降解的聚合物(例如聚乳酸-聚乙交酯)中形成药物的微胶囊基质来制备可注射的药性持久的(depot)形式。根据药物与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质，可以控制药物的释放速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还可通过将药物截留在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备药性持久的可注射制剂。

用于直肠或阴道施用的组合物优选为栓剂，所述栓剂可通过将本发明的化合物与合适的无刺激性的赋形剂或载体(例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡)混合而制备，所述栓剂在环境温度下为固体，但在体温下为液体。因此在直肠或阴道腔中融化并释放出活性化合物。

口服固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，将活性化合物与至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体(例如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或以下成分进行混合：a)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；c)保湿剂，例如甘油；d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)缓溶剂(solution retarding agent)，例如石蜡；f)吸收促进剂，例如季铵化合物；g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸收剂，例如高岭土和膨润土；i)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠，以及它们的混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。

相似类型的固体组合物也可以用作软填充和硬填充的明胶胶囊中的填充剂，其使用赋形剂(例如乳糖或奶糖和高分子量聚乙二醇等)。

片剂、糖衣丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和外壳(例如肠溶包衣和药物配制领域公知的其他包衣)制备。它们可以可选地包含乳浊剂，还可以具有组合物，它们仅或优选在肠道的某些部分中可选地以延迟的方式释放一种以上活性成分。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。

用于本发明化合物的局部或透皮施用的剂型包括软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、散剂、溶液剂、喷雾剂、吸入剂或贴剂。将活性成分在无菌条件下与药学上可接受的载体和可能需要的任何所需的防腐剂或缓冲剂混合。眼科制剂、滴耳剂、眼药膏、粉剂和溶液剂也考虑在本发明的范围内。

除本发明的活性化合物以外，软膏、糊剂、乳膏和凝胶剂还可包含赋形剂，例如动植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸酸、滑石粉和氧化锌或它们的混合物。

除本发明的化合物以外，粉末和喷雾剂还可包含赋形剂，例如乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂还可以包含常规抛射剂(propellant)，例如氯氟烃。

透皮贴剂具有提供化合物向身体的受控递送的附加优点。此种剂型可通过将化合物溶解或分配在适当的介质中来制备。吸收促进剂也可用于增加化合物穿过皮肤的通量。可通过提供速率控制膜或通过将化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制速率。

对于肺部递送，本发明的治疗组合物被配制并通过直接施用(例如吸入呼吸系统)以固体或液体颗粒形式施用给患者。为实施本发明而制备的活性化合物的固体或液体颗粒形式包括可吸入尺寸的颗粒：即，尺寸足够小以在吸入时穿过口腔和喉并进入肺的支气管和肺泡中的颗粒。雾化的治疗剂(特别是雾化的抗生素)的递送在本领域中是已知的(例如，参见Van Devanter等的美国专利号5,767,068、Smith等的美国专利号5,508,269和Montgomery的WO 98/43650，其全部内容通过引用并入本文)。在美国专利号6,014,969(其内容通过引用并入本文)中也有关于肺部递送抗生素的讨论。

式I的化合物和PD-1信号转导抑制剂的组合的“治疗有效量”指每种化合物的量组合时以适用于任何医学治疗的合理的受益/风险比给被治疗的受试者赋予治疗效果。治疗效果可以为客观的(即可通过某种测试或标记物进行测量)或主观的(即受试者给出效果迹象或感觉到效果)。有效剂量也将根据施用途径以及与其他药物共同使用的可能性而变化。然而，应理解，本发明的化合物和组合物的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括正在治疗的疾病和疾病的严重程度；所用特定化合物的活性；使用的具体组成；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；所用特定化合物的施用时间、施用途径和排出速率；治疗的持续时间；与所用特定化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域公知的因素。在优选实施方式中，式I的化合物或其药学上可接受的盐与PD-1信号转导抑制剂的组合的治疗有效量在待治疗的癌症类型中显示出协同作用。

在本发明的联合治疗中，以单剂量或分剂量施用于人或其他动物的每种化合物的日总剂量可以为例如0.01mg/kg体重至50mg/kg体重或更通常为0.1mg/kg体重至25mg/kg体重的量。单剂量组合物可以包含此种量或其约数(submultiple)以组成每日剂量。通常，本发明的治疗方案包括每天以单剂量或多剂量向需要此种治疗的患者施用约10mg至约1000mg的本发明的化合物。

例如，本发明的联合治疗中的每种化合物可以通过注射、静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌内或皮下施用；或者，口服、经颊、经鼻、经粘膜、局部、以眼用制剂或通过吸入施用；每4至120小时或根据特定药物需要施用，剂量范围为约0.1mg/kg体重至约500mg/kg体重或1mg/剂至1000mg/剂。本文的方法预期施用有效量的化合物或化合物组合物以达到期望或规定的效果。通常，本发明的药物组合物将每天施用约1次至约6次，或者作为连续输注施用。此种施用可以用作慢性或急性治疗。可与药物赋形剂或载体结合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主和特定的施用方式而变化。典型的制剂将包含约5％至约95％的活性化合物(w/w)。或者，此类制剂可包含约20％至约80％的活性化合物。

可能需要比上述剂量更低或更高的剂量。任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、施用时间、排出率、药物组合，疾病、病症或症状的严重程度和病程，患者对疾病、病症或症状的倾向以及治疗医师的判断。

在患者病情改善后，如有必要，可以施用维持剂量的本发明化合物、组合物或组合。随后，可根据症状将施用剂量或施用频率或两者降低至当症状减轻至所需水平时保持改善的状况的水平。然而，一旦疾病症状复发，患者可能需要长期间歇治疗。

实施例

结合以下实施例将更好地理解本发明的化合物和方法，这些实施例仅用于举例说明，并不限制本发明的范围。对所公开的实施方式进行各种改变和修改对本领域技术人员将是显而易见的，在不脱离本发明的精神和所附权利要求的范围的情况下，可以进行包括但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、制剂和/或方法有关的那些改变和修改。

化合物1及其甲磺酸盐、钠盐、钾盐和胆碱盐的合成如下图所示。

可通过使106分别与R-2-1或R-2-2反应来制备中间体107-1或107-2。R-2-1和R-2-2的合成方案如下所示：

或通过另一种方法：

可通过使107-1或107-2与R-3-1或R-3-2的偶联反应来制备中间体108-1和108-2，其中，R-3-1和R-3-2可以根据以下方案进行制备：

实施例1：N-羟基-2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)嘧啶-5-羧酰胺(化合物1)的制备

步骤a：(Z)-2-(乙氧基甲基)-3-甲氧基丙烯酸乙酯(化合物202)

将钠(40.9g，1.78mol)小心地分批添加到乙醇(750mL)中，在所有钠金属消失后，浓缩溶液得到NaOEt粉末。在搅拌下，加入己烷(1.0L)，将混合物用冰水浴冷却。在0-5℃下逐滴加入201(130g，0.89mol)和甲酸乙酯(131g，1.78mol)的混合物。将反应混合物在室温搅拌过夜。在冰水浴冷却下滴加硫酸二甲酯(224g，1.78mol)。将所得混合物在50℃下加热2小时。向混合物中加入三乙基氯化铵(122g)和氢氧化钠(20g)。然后将混合物在室温搅拌4小时，过滤。滤液用水洗涤，用Na

步骤b：2-氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-羧酸乙酯(化合物203)

将化合物202(140g，0.745mol)、尿素(40.0g，0.697mol)和浓盐酸(34mL)在乙醇(500mL)中的混合物加热回流过夜。蒸发约50％反应体积后，将得到的悬浮液过滤，用少量乙醇洗涤，干燥，得到化合物203(47g，37％)，为白色固体。LCMS：171[M+1]

步骤c：2-氧代-1,2-二氢嘧啶-5-羧酸乙酯(化合物204)

向化合物203(47g，280mmol)在乙酸(500mL)中的溶液中添加溴(49.0g，307mmol)。将该混合物加热回流2小时，冷却至室温，进一步冷却至0-5℃，过滤，得到标题化合物204(38g，54％)，为黄色固体。LCMS：169[M+1]

步骤d：2-氯嘧啶-5-羧酸乙酯(化合物R-2-1)

将化合物204(38.0g，153mmol)和三氯化磷(300mL)和N,N-二甲基苯胺(3mL)的混合物回流加热2小时，冷却至室温，浓缩。将残余物用冰水小心地淬灭，用碳酸钠将pH调节为7至8，用EtOAc萃取。合并的有机物用冰水和卤水(brine)洗涤，经Na

步骤e：(Z)-2-(二甲氧基甲基)-3-甲氧基-3-氧代丙-1-烯-1-油酸钠(化合物206)

将NaH(27g，60％，在矿物油中，0.675mol)在无水1,2-二甲氧基乙烷(300mL)中的混合物加热至40-50℃，然后逐滴添加3,3-二甲氧基丙酸甲酯(205)(100g，0.675mol)。将所得混合物搅拌0.5小时，在40-50℃下逐滴加入无水甲酸甲酯(81g，1.35mol)。将所得混合物在40-50℃(内部温度)下搅拌2小时，然后冷却至0℃。使反应混合物缓慢升温至25℃，搅拌过夜。加入Et

步骤f：2-氨基-嘧啶-5-羧酸甲酯(化合物207)

向盐酸胍(42.2g，0.44mol)在DMF(300mL)中的混合物中加入化合物206(80g，0.40mol)。将所得混合物在100℃加热1小时。将反应混合物过滤，然后冷却。滤饼用50mLDMF洗涤，浓缩合并的滤液，得到残余物，将其悬浮在冷EtOH中，用冷EtOH(50mL)洗涤，得到化合物207(38g，61.5％)，为黄色固体。LCMS(m/z)：154.2[M+1]

步骤g：2-氯嘧啶-5-羧酸甲酯(化合物R-2-2)

将化合物207(7g，0.046mol)加入浓盐酸(15.2mL)和CH

步骤h：5-溴-2-甲氧基吡啶(化合物303)

将2-甲氧基吡啶(100g，0.92mol)、NBS(180g，1.0mol)在乙腈(1.0L)中的溶液回流搅拌21小时。TLC显示反应完成。将反应混合物冷却至室温，浓缩。收集约900mL溶剂。过滤得到的悬浮液，用正己烷(约400mL)洗涤。再次浓缩滤液，得到粗产物。减压(30℃/约0.3mmHg)蒸馏粗产物，得到标题化合物(146g，84％)，为澄清油状物。LCMS(m/z)：190.0[M+1]

步骤i：6-甲氧基吡啶-3-基硼酸(R-3-1)：

在-78℃下，向化合物303(20g，0.11mol)的无水THF(180mL)溶液中滴加正丁基锂(59mL，2M，在THF中)，搅拌所得混合物1小时。在-78℃下加入硼酸三异丙酯(37mL)，将反应混合物温热至室温，继续搅拌过夜。TLC(己烷/乙酸乙酯＝5：1)显示反应完成。用4N HCl(90mL)将混合物的pH调节为3至4。通过过滤收集沉淀物，得到粗化合物R-3-1(21g，128％)。将粗化合物R-3-1(21g)溶于水(200mL)中，用浓氨水将溶液的pH调节为8至9，通过过滤收集沉淀物，得到纯的标题化合物R-3-1(11g，67％)，为白色固体。LCMS(m/z)：154.1[M+1]

步骤j：2-甲氧基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)吡啶(化合物R-3-2)

在N

步骤k：噻吩并[3,2-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(化合物102)

尿素法：将3-氨基噻吩-2-羧酸甲酯(101)(90.0g，573mmol，1.0当量)和尿素(277.6g，4.6mol，8.0当量)的混合物在190℃加热3-4小时，冷却至室温。向反应混合物中加入NaOH水溶液(10％，800mL)。在环境温度下搅拌1小时后，通过过滤除去固体。滤液用HCl酸化至pH 3-4，过滤收集沉淀的固体，用水洗涤，真空干燥，得到所需产物化合物102，为灰白色固体(87g，89％)。熔点：280-285℃。LCMS(m/z)：169.0[M+1]

KOCN法：在1小时内，缓慢地向3-氨基噻吩-2-羧酸酯(101)(100.0g，636.9mmol，1.0当量)、乙酸(705mL)和水(600mL)的混合物中加入氰酸钾(154.8g，1.91mol，3.0当量)的水溶液(326mL)。将所得混合物在室温搅拌20小时，过滤，用水(500mL)冲洗。将滤饼装入合适大小的反应器中，加入2M氢氧化钠水溶液(1.65L)，将浆液搅拌2小时，LCMS证实形成了所需产物。将混合物冷却至10℃，加入3M盐酸水溶液(1.29L)直至pH＝5.0至6.0。过滤浆液，用水(700mL)冲洗，在50℃的真空烘箱中干燥24小时，得到化合物102(100g，94％)，为灰白色固体。LCMS(m/z)：169.1[M+1]

步骤l：2,4-二氯噻吩并[3,2-d]嘧啶(化合物103)

将三氯氧磷(152mL，1.67mol，7.0当量)缓慢加入到化合物102(40g，238mmol，1.0当量)和N,N-二甲基苯胺(22.5mL，179mmol，0.75当量)的冷乙腈溶液(250mL)中，同时保持温度低于20℃。然后将混合物加热至85℃，搅拌24小时。将反应混合物冷却至15℃，然后缓慢倒至冰水混合物(360mL)上。过滤所得浆液，用冷水(200mL)冲洗。将滤饼在真空烘箱中在40℃下干燥24小时，得到化合物103(40.5g，83％)，为灰白色固体。熔点：245-250℃。LCMS(m/z)：205.0[M+1]

步骤m：2-氯-4-吗啉噻吩并[3,2-d]嘧啶(化合物104)

向化合物103(34.2g，167mmol，1.0当量)和甲醇(500mL)的混合物中缓慢加入吗啉(31.2mL，367mmol，2.2当量)。将反应混合物在室温搅拌过夜。通过过滤收集沉淀物，用甲醇洗涤，真空干燥，得到所需产物化合物104，为浅黄色固体(39g，91％)。熔点：250-255℃。LCMS(m/z)：256.0[M+1]

步骤n：2-氯-4-吗啉噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲醛(化合物105)

在-78℃下，在氮气下缓慢向化合物104(20g，78.4mmol，1.0当量)在THF(无水，320mL)中的悬浮液中添加正丁基锂(在己烷中，2.4M，40.8mL，102mmol，1.3当量)。使所得浆液升温至-60℃，变成澄清的棕色溶液。然后将反应混合物再次冷却至-78℃，缓慢加入DMF(无水，9.1mL，118mmol，1.5当量)。将所得溶液在-78℃下搅拌0.5小时，在1小时内升温至0℃，缓慢倒入HCl水溶液(0.25M，660mL)和冰水(320mL)的混合物中。将所得浆液在0-10℃下搅拌0.5小时，过滤，用冷水洗涤并真空干燥，得到化合物105(22g，98％)，为黄色固体。熔点：260-265℃。LCMS(m/z)：284.0[M+1]

步骤o：(2-氯-4-吗啉-4-基-噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基甲基)-甲胺(化合物106)

在氮气氛下，向化合物105(20.0g，70.4mmol，1.0当量)的甲醇(125mL)溶液中加入甲胺的甲醇溶液(27％v/v，75mL，563.2mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜，真空除去溶剂，得到粗固体产物，将其在氮气下溶解于甲醇(550mL)和THF(220mL)中。分批加入硼氢化钠(8g，211.2mmol)，将反应混合物在室温搅拌过夜。真空蒸发反应混合物，添加水(300mL)。混合物水溶液用二氯甲烷萃取，合并的萃取液经Na

步骤p(a)：2-[(2-氯-4-吗啉-4-基-噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基甲基)-甲基-氨基]-嘧啶-5-羧酸乙酯(化合物107-1)

在室温下向106(10g，33.6mmol)和R-2-1(6.8g，36.4mmol)在CH

步骤p(b)：2-[(2-氯-4-吗啉-4-基-噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基甲基)-甲基-氨基]-嘧啶-5-羧酸甲酯(化合物107-2)

在室温下搅拌化合物106(25g，84mmol)、CH

步骤q(a)：2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)嘧啶-5-羧酸乙酯(化合物108-1)

方法A：在N

方法B：在N

熔点：198-202℃。LCMS：522.30[M+1]

步骤q(b)：2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)嘧啶-5-羧酸甲酯(化合物108-2)

在室温下向在二氧六环(540mL)中的化合物107-2(20g，46.0mmol)和B-3-1(9.2g，60.2mmol，1.3当量)的混合物中加入固体NaHCO

步骤r：N-羟基-2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)嘧啶-5-羧酰胺(化合物1)

羟胺甲醇溶液的制备

将在MeOH(400mL)中的NH

由化合物108-1制备化合物1

将化合物108-1(10g，19mmol)悬浮在上述新鲜制备的羟胺甲醇溶液(1.79M，350mL)中。向该混合物中加入二氯甲烷(100mL)。密封反应烧瓶，将混合物在室温搅拌5小时，然后变成澄清溶液。将反应另外搅拌9小时。过滤除去任何不溶固体。通过添加乙酸将滤液的pH调节为6至7，形成固体沉淀物。通过过滤收集固体，用水和最小量的甲醇洗涤，在60℃下真空干燥5小时，得到的化合物1(9.2g，96％)，为白色固体。熔点：177-180℃。LCMS：509.3[M+1]

由化合物108-2制备化合物1

在室温下，向化合物108-2(31g，61.1mmol)在二氯甲烷(310mL)中的悬浮液中加入上述新鲜制备的羟胺甲醇溶液(1.79M，744mL)。密封反应烧瓶，将反应混合物在室温搅拌5小时。反应混合物变成澄清溶液。过滤反应溶液，除去任何不溶固体。然后向滤液中添加水(310mL)，添加过程中没有形成固体。在搅拌的同时添加乙酸(18.5mL)以将pH调节为10.20(通过pH计连续监测)。添加乙酸期间，内部温度没有变化。将所得反应混合物继续搅拌另外4小时。白色固体逐渐形成。将悬浮液过滤并用最小量的甲醇(100mL×3)洗涤。将收集的白色固体重新悬浮在甲醇(620mL)和水(124mL)中以形成悬浮液。向上述悬浮液中加入另外的乙酸(11g)以将pH调节为5至6。观察到固体形式的变化。将悬浮液继续搅拌另外2小时，通过滤纸过滤，用最小量的甲醇(100mL×3)洗涤。将收集的白色固体在烘箱(50℃)中干燥12小时，得到标题化合物1(23.6g，76.0％)，为白色固体。熔点：255-259℃。LCMS(m/z)：509.3[M+1]

实施例2：N-羟基-2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)嘧啶-5-羧酰胺甲磺酸盐(化合物1的甲磺酸盐)的制备

方法A：在0℃下向化合物1(300mg，0.59mmol)和MeOH/Et

方法B：在室温(15℃)下，向化合物1(1.5g，2.95mmol)在二氯甲烷/MeOH(40mL/10mL)中的悬浮液中加入甲磺酸(341mg，3.55mmol)在2mL MeOH中的悬浮液，形成澄清溶液。将反应混合物在室温搅拌过夜。反应混合物仍为澄清。向混合物中加入乙酸乙酯(40mL)，在室温下继续搅拌3小时。过滤收集得到的沉淀物，得到化合物2(1.45g，83％)，为白色固体。

熔点：179-185℃。LCMS：509.3[M+1]

实施例3：N-羟基-2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)嘧啶-5-羧酰胺钠盐(化合物1的钠盐)的制备

在0℃下向化合物1(300mg，0.59mmol)在甲醇(30mL)中的悬浮液中缓慢加入t-BuONa(85mg，0.88mmol)。将所得混合物温热至室温，继续搅拌2小时。将反应浓缩，将残余物研磨并用乙醇洗涤，随后过滤，得到化合物3(230mg，73％)，为白色固体。熔点：178-183℃。LCMS：509.3[M+1]

实施例4：N-羟基-2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)嘧啶-5-羧酰胺钾盐(化合物1的钾盐)的制备

在0℃下，在N

实施例5：N-羟基-2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)嘧啶-5-羧酰胺胆碱盐(化合物1的胆碱盐)的制备

向化合物1(200mg，0.39mmol)的DCM/MeOH(60mL/12mL)溶液中加入氢氧化胆碱(106mg，0.39mmol，45％，在MeOH中)。将混合物在室温搅拌2小时，然后浓缩以除去约30mL的溶剂。加入乙酸乙酯(60mL)，将混合物在室温搅拌2小时。发生少量沉淀后，将混合物浓缩以除去约40mL溶剂，添加另外的乙酸乙酯(60mL)。将混合物在室温搅拌2小时，过滤，得到化合物5(180mg，76％)，为白色固体。熔点：181-185℃。LCMS：509.3[M+1]

实施例6：N-羟基-2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)嘧啶-5-羧酰胺硫酸盐(化合物1的硫酸盐)的制备

向化合物1(200mg，0.39mmol)在DCM/MeOH(30mL/7.5mL)中的悬浮液中添加硫酸(77mg，0.79mmol，在1mL MeOH中)，形成澄清溶液。将反应混合物在室温搅拌过夜。发生沉淀，然后加入叔丁基甲基醚(60mL)。将所得混合物在室温下继续搅拌1小时。通过过滤收集固体，得到化合物6(180mg，76％)，为白色固体。熔点：243-246℃。LCMS：509.3[M+1]

实施例7：N-羟基-2-(甲基((2-(6-(甲基氨基)吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶-5-羧酰胺(化合物2)

步骤7a：(2-氯-4-吗啉-4-基-噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基甲基)-甲胺(化合物0503)

在氮气气氛下，向0112(20.0g，70.4mmol)的甲醇(125mL)溶液中加入甲胺的甲醇溶液(27％v/v，75mL，563.2mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜，真空除去溶剂，得到粗固体产物，将其在氮气下溶解于甲醇(550mL)和THF(220mL)中。分批加入硼氢化钠(8g，211.2mmol)，将反应混合物在室温搅拌过夜。真空蒸发反应混合物，添加水(300mL)。混合物水溶液用二氯甲烷萃取，合并的萃取液经Na

LCMS：299[M+1]

步骤7b：2-[(2-氯-4-吗啉-4-基-噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基甲基)-甲基-氨基]-嘧啶-5-羧酸乙酯(化合物0504)

在室温下搅拌0503(10g，33.6mmol)、CH

步骤7c：2-(甲基((2-(6-(甲基氨基)吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶-5-羧酸乙酯(化合物0603-111)

将N-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)吡啶-2-胺(0602-227)(351mg，1.5mmol)、0504(314mg，0.7mmol)、NaHCO

步骤7d：N-羟基-2-(甲基((2-(6-(甲基氨基)吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶-5-羧酰胺(化合物2)

使用类似于实施例1中所述的方法，由0603-236(150mg，0.29mmol)和新鲜制备的羟胺甲醇溶液(6mL)制备化合物2(21mg，14％)，为棕色固体。熔点：193-195℃。LCMS：508[M+1]

实施例8：2-(((2-(4-氨基苯基)-4-吗啉噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基](甲基)氨基)-N-羟基嘧啶-5-羧酰胺(化合物3)

步骤8a：N-(4-溴苯基)乙酰胺(化合物0601-150)

在0℃下向4-溴苯胺(6.3g，63.7mmol)的CH

步骤8b：N-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)乙酰胺(化合物0602-150)

使用类似于针对化合物0602-107(实施例34)所述的方法，由0601-150(2.0g，9.3mmol)、双戊酰二硼(bis(pinacolato)diboron)(4.4g，17.5mmol)、乙酸钾(3.5g，14mmol)和PdCl

步骤8c：2-(((2-(4-氨基苯基)-4-吗啉噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)嘧啶-5-羧酸乙酯(化合物0603-150)

用氮气冲洗在甲苯(4mL)、乙醇(2mL)和水(1mL)中的化合物0504-54(210mg，0.46mmol)、0602-150(159mg，0.60mmol)、碳酸氢钠(118mg，1.4mmol)和双(三苯基膦)氯化钯(II)(17mg，0.02mmol)的混合物，在微波辐射下于120℃加热2小时。将反应混合物在乙酸乙酯和水之间分配，有机层用卤水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤，真空蒸发。将残余物用二氯甲烷洗涤，获得2-(((2-(4-乙酰氨基苯基)-4-吗啉噻吩并-[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)嘧啶-5-羧酸乙酯(136mg，53％)，为白色固体。LCMS：548[M+1]

在40℃下，向上述乙酯(280mg，0.51mmol)的THF(10mL)溶液中加入HCl水溶液(6M，15mL)，搅拌2小时，将反应混合物用NaHCO

步骤8d：2-(((2-(4-氨基苯基)-4-吗啉噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基](甲基)氨基)-N-羟基嘧啶-5-羧酰胺(化合物3)

使用类似于实施例1中描述的方法，由0603-150(170mg，0.3mmol)和新鲜制备的羟胺甲醇溶液(4mL)来制备化合物3(43mg，26％)，为黄色固体。熔点：183-186℃。LCMS：493[M+1]

实施例9：PI3激酶活性测定

以下测定法用于确定化合物1抑制PI3K的各种同工型(isoform)和突变体的能力。

使用ADP-Glo发光激酶测定法测量PI3Kα活性。在杆状病毒感染的Sf9细胞表达系统中，共表达P13Kα、N末端带有GST标记的重组全长人p110α的复合体和未标记的重组全长人p85α(p110α的GenBank登录号为U79143；p85α的GenBank登录号为XM_043865)。通过使用谷胱甘肽-琼脂糖的一步(one-step)亲和色谱法纯化蛋白质。在存在纯化的重组PI3Kα(p110α/p85α)和PIP2的情况下，进行竞争测定以测量由ATP产生的ADP量。在反应缓冲液(50mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，5mM MgCl

还使用上述一般方法测定了化合物1抑制PI3Kα突变体H1047R和E545K的能力。测得两个突变体的IC

使用均相时间分辨荧光(HTRF，homogenous time resolved fluorescence)技术通过时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET，time-resolved fluorescence resonanceenergy transfer)测定法来测量PI3Kβ的活性。在杆状病毒感染的Sf21细胞表达系统中，共表达P13Kβ、N末端带有组氨酸标记的重组全长人p110β的复合体和未标记的重组全长人p85α(p110β的GenBank登录号为NM_006219；p85α的GenBank登录号为XM_043865)。通过使用谷胱甘肽-琼脂糖的一步亲和色谱法纯化蛋白质。在纯化的重组PI3Kβ(p110β/p85α)存在下，进行竞争测定以测量由PIP2产生的PIP3的量。在反应缓冲液(20mM HEPES，pH 7.5，10mMNaCl，4mM MgCl

在该测定中，测得化合物1的IC

使用荧光偏振测定法测量PI3Kδ的活性。在杆状病毒感染的Sf9细胞表达系统中，共表达P13Kδ、N末端带有组氨酸标记的重组全长人p110δ的复合物和未标记的重组全长人p85α(p110δ的GenBank登录号为NM_005026)。通过使用谷胱甘肽-琼脂糖的一步亲和色谱法纯化蛋白质。在纯化的重组PI3Kδ(p110δ/p85α)存在下，进行竞争测定以测量从PIP2产生的PIP3的量。在反应缓冲液(20mM HEPES(pH 7.5)、10mM NaCl、4mM MgCl

在该测定中，测得化合物1的IC

使用均相时间分辨荧光(HTRF)技术通过时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)测定法来测量PI3Kγ的活性。在杆状病毒感染的Sf9细胞表达系统中表达N末端带有组氨酸标记的人P13Kδ(GenBank登录号AF327656)。通过使用谷胱甘肽-琼脂糖的一步亲和色谱法纯化蛋白质。在纯化的重组PI3Kγ(p120γ)存在下，进行竞争测定以测量从PIP2产生的PIP3的量。在反应缓冲液(20mM HEPES，pH 7.5，10mM NaCl，4mM MgCl

在该测定中，测得化合物1的IC

实施例10：HDAC活性测定

使用Biomol Color de Lys系统(AK-500，Biomol，Plymouth Meetin g，PA)评估HDAC抑制活性。简言之，将HeLa细胞核提取物用作HDAC的来源。在二甲基亚砜(DMSO)中连续稀释不同浓度的测试化合物，在比色人工底物存在下将其添加到HeLa细胞核提取物中。最终测定条件包括：50mM Tris/Cl，pH 8.0，137mM NaCl，2.7mM KCl和1mM MgCl

还测定了化合物1针对HDAC同种型的活性。按照其标准操作程序，在BPSBioscience(加利福尼亚州圣地亚哥)进行HDAC特异性测定。简言之，纯化的标志(flag)-(人HDAC-1)、NCOR2-(人HDAC3)、GST-(人HDAC4、HDAC6、HDAC7、HDAC10和HDAC11)或His-(人HDAC2、HDAC5、HDAC8和HDAC9)标记的酶用Sf9昆虫细胞进行表达并在使用前纯化。用于HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9和HDAC11的底物是BPS Bioscience开发的HDAC底物3。对于其他HDAC酶，使用HDAC 2a类底物。除HDAC11酶测定法在室温下进行3小时以外，所有酶促反应均在37℃下进行30分钟，重复两次。

下表列出了HDAC1-11各个结果，IC

实施例11：在小鼠异种移植模型-CTW26.WT小鼠结肠癌细胞中研究化合物1和抗PD-1

动物：雌性Balb/c小鼠，8周龄，以高脂肪饮食喂养。

化合物1：PO给药，50mg/kg，计划用药5天、停药2天(5+2-)

同种型对照：LEAF

PD-1抗体：LEAF

细胞施用：

从烧瓶中收集CT26.WT细胞，用无添加剂的RPMI 1640洗涤一次。在普通(plain)培养基(RPMI-1640)中达到最终浓度，维持在冰上，直至施用于小鼠。在第7或8天，一旦肿瘤可触知(palpable)，将小鼠按体重随机分组。用抗体开始治疗，立即开始化合物1。

分组：

研究时间安排：

监测动物，直至开始给药，然后在给药期间每周两次进行测量，直至肿瘤体积达到方案极限或溃疡过于严重。在研究结束时收集肿瘤组织和血液/血浆。

结果

该研究的结果显示在下表和图1中。第1-3组有7只可评估的小鼠。在4-6组中，所有8只小鼠均可评估。单独的50mg/kg化合物1仅显示出很小的肿瘤生长抑制。抗PD-1显示出更大的肿瘤生长抑制作用，但仍低于50％。然而，化合物1和抗PD-1的组合显示出几乎完全抑制了肿瘤的生长。

实施例12：在A20小鼠异种移植模型中研究化合物1和抗PD-1

动物：雌性Balb/c小鼠，4至5周龄，定期进食

化合物：

化合物1：PO给药，50mg/kg或100mg/kg，计划用药5天、停药2天(5+2-)。

同种型对照：LEAF

抗PD-1抗体：LEAF

载体：化合物1载体-30％Captisol

细胞施用：

从烧瓶中收集A20同系细胞，用无添加剂的RPMI 1640洗涤一次。在普通培养基(RPMI-1640)中达到最终浓度，维持在冰上，直至施用于小鼠。在动物右侧腹植入2×10

分组：

当肿瘤完全可触知且进行测量后，在约第13天开始动物给药。继续给药，直至肿瘤开始显示需要处死的溃疡为止。在广泛坏死之前收集肿瘤，进行ELISA和流式分析。

结果

该研究的结果在下表和图2中给出。单独的100mg/kg化合物1和单独的抗PD-1均显示出显著的肿瘤生长抑制作用。化合物1和抗PD-1的组合显示出比单独的任何一种药物更大的肿瘤生长抑制作用。

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