一种具有防污微凝胶芯片的制备方法、芯片，以及传感器

技术领域

本发明涉及医疗器械技术领域，特别涉及一种具有防污微凝胶芯片的制备方法、芯片，以及传感器。

背景技术

糖尿病的诊断和治疗需要定期或(理想情况下)持续控制血液中的葡萄糖水平，以便优化治疗和改善糖尿病患者的生活质量。目前血糖水平检测主要依靠以下两种方法:一种是刺穿手指测量血糖，另一种是在皮肤中插入微探针连续测量细胞间液中的葡萄糖。然而，这两种方法均属于有创方法。为满足糖尿病患者的医疗需求，提高患者的生活质量，无创技术已成为临床和科研的研究热点。特别是唾液中葡萄糖浓度与血糖水平相关性高，且唾液具有安全、方便、便于实时采集等天然优势，因此基于唾液的无创血糖监测成为研究热点。

唾液中的葡萄糖含量很低，大约是血糖的1/100～1/50。因此，对唾液葡萄糖的检测仪器提出了很高的要求。石英晶体微天平(QCM)是一种成熟的质量敏感检测生物分子的工具，可以检测亚纳米级的质量变化。与其他电子元件相比，QCM具有灵敏度高、响应速度快、生产成本低、实时测量能力强、集成简单等特点，已成为在线检测液态DNA、核酸、蛋白质、细菌等多种分子识别事件的合适工具。一般来说，聚合物涂层或经生物化学修饰的QCM芯片形成具有特定识别生物分子特性的薄膜，这使得暴露在生物液体中的生物分子的无标签检测成为可能。随着目标分子被QCM芯片吸收，芯片的振荡频率降低，可以进行现场实时监测。但是唾液中葡萄糖分子含量极低(3.6-36mg/L)，使得频率变化很小，更糟糕的是，高蛋白质所引起的晶振片振荡频率下降很大，会掩盖掉葡萄糖引起的频率变化，蛋白质高度非特异性(唾液中的蛋白质的总量可以达到数千毫克每升)产生了巨大的背景信号，导致测试不准确。

因此，为了解决现有技术中的问题，需要一种具有防污微凝胶芯片的制备方法、芯片，以及传感器。

发明内容

本发明的一个方面在于提供一种具有防污微凝胶芯片的制备方法，所述制备方法包括：

合成微凝胶：将516mg 3-丙烯酰胺基苯硼酸，831mg丙烯酰胺，350uL甲基丙烯酸缩水甘油酯，46.2mg N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，5mg偶氮二异丁腈加入到40mL乙腈种，90℃聚合1个小时，蒸馏水反复清洗，得到微凝胶；

合成微凝胶防污层：苏氨酸和丝氨酸按照摩尔比1：1的比例，加入到乙醇溶液中，调节pH至10.5得到混合溶液，取500mg所述微凝胶分散到所述混合溶液中，50℃反应24小时，产物蒸馏水洗至中性，并加入乙醇，高速离心得到白色膏状物质；

固定在晶振片上：取30mg所述白色膏状物质，50μLN-乙烯基吡咯烷酮，5μL乙二醇二甲基丙烯酸酯，3mg2,2-二甲氧基-苯基乙酮分散在50μL二甲基亚砜制备成预聚合溶液，

然后取25μL所述预聚合溶液置于石英板上，将晶振片正面朝下放置在所述预聚合溶液液上，利用压膜机压制晶振片背面，紫外灯照射1个小时，蒸馏水冲洗并氮气吹干。

优选地，所述方法还包括将微凝胶防污层固定在晶振片之前，对晶振片进行如下处理：

晶振片在piranha溶液和中超声10分钟，蒸馏水冲洗晶振片并用氮气吹干；

然后放含有100μLγ―氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇中，室温反应12小时；

蒸馏水冲洗晶振片并用氮气吹干，再放入马来酸酐的N,N-二甲基甲酰胺反应12小时，再次蒸馏水冲洗，氮气吹干。

优选地，所述piranha溶液为：质量百分浓度为96％w/w的H

优选地，苏氨酸和丝氨酸按照摩尔比1：1的比例，加入到乙醇溶液中，该乙醇溶液的乙醇与水体积比为1：3。

本发明的另一个方面在于提供一种芯片，所述芯片包括晶振片，所述晶振片通过化学交联固定防污微凝胶；

其中，所述防污微凝胶通过对微凝胶接枝氨基酸，形成微凝胶防污层，使所述为芯片降低蛋白质的非特异性吸附。

优选地，所述晶振片通过如下化学交联固定防污微凝胶：

对晶振片进行如下处理：

晶振片在piranha溶液和中超声10分钟，蒸馏水冲洗晶振片并用氮气吹干；

然后放含有100μLγ―氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇中，室温反应12小时；

蒸馏水冲洗晶振片并用氮气吹干，再放入马来酸酐的N,N-二甲基甲酰胺反应12小时，再次蒸馏水冲洗，氮气吹干；

在晶振片上通过化学交联固定防污微凝胶：

取30mg所述微凝胶防污层，50μLN-乙烯基吡咯烷酮，5μL乙二醇二甲基丙烯酸酯，3mg2,2-二甲氧基-苯基乙酮分散在50μL二甲基亚砜制备成预聚合溶液，

然后取25μL所述预聚合溶液置于石英板上，将晶振片正面朝下放置在所述预聚合溶液液上，利用压膜机压制晶振片背面，紫外灯照射1个小时，蒸馏水冲洗并氮气吹干。

优选地，所述piranha溶液为：质量百分浓度为96％w/w的H

优选地，所述微凝胶通过如下方法合成：

将516mg 3-丙烯酰胺基苯硼酸，831mg丙烯酰胺，350uL甲基丙烯酸缩水甘油酯，46.2mg N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，5mg偶氮二异丁腈加入到40mL乙腈种，90℃聚合1个小时，蒸馏水反复清洗，得到微凝胶。

优选地，微凝胶防污层通过如下方法合成：

苏氨酸和丝氨酸按照摩尔比1：1的比例，加入到乙醇溶液中，调节pH至10.5得到混合溶液，取500mg微凝胶分散到所述混合溶液中，50℃反应24小时，产物蒸馏水洗至中性，并加入乙醇，高速离心得到白色膏状物质。

本发明的再一个方面在于提供一种传感器，所述传感器包括权利要芯片，所述芯片包括晶振片，所述晶振片通过化学交联固定防污微凝胶；

其中，所述防污微凝胶通过对微凝胶接枝氨基酸，形成微凝胶防污层，使所述为芯片降低蛋白质的非特异性吸附。

本发明提供的一种具有防污微凝胶芯片的制备方法、芯片，以及传感器在QCM芯片上合成了一种防污微凝胶，在检测唾液葡萄糖时克服了蛋白质的非特异性吸附。

本发明提供的一种具有防污微凝胶芯片的制备方法、芯片，以及传感器，将含有硼酸的微凝胶被用作葡萄糖的结合位点，接枝到微凝胶上的氨基酸被用作蛋白抵抗成分，然后通过化学交联固定在芯片上，使葡萄糖传感器具有葡萄糖响应性和抗污染性能，能够在生理条件下检测0～40mg/L的唾液葡萄糖。

本发明提供的一种具有防污微凝胶芯片的制备方法、芯片，以及传感器，具有优越的蛋白质和有机分子耐受能力，实现了对唾液溶液中葡萄糖的检测(V

本发明提供的一种具有防污微凝胶芯片的制备方法、芯片，以及传感器，在唾液中葡萄糖分子含量极低(3.6-36mg/L)，频率变化很小的情况下，消除蛋白质高度非特异性导致的测试不准确的问题。

应当理解，前述大体的描述和后续详尽的描述均为示例性说明和解释，并不应当用作对本发明所要求保护内容的限制。

附图说明

参考随附的附图，本发明更多的目的、功能和优点将通过本发明实施方式的如下描述得以阐明，其中：

图1示意性示出了本发明一个实施例中制备具有防污微凝胶芯片的流程图。

图2a示出了合成的微凝胶显微结构。

图2b示出了合成的微凝胶防污层的显微。

图2c示出了芯片上固定微凝胶防污层后的显微结构。

图3示出了本发明具有防污微凝胶芯片的稳定性测试图。

图4示出了本发明具有防污微凝胶芯片的检出限测试示意图。

图5示出了本发明具有防污微凝胶芯片不同PH对测试的影响示意图。

图6示出了本发明具有防污微凝胶芯片的回复性测试示意图。

图7示出了本发明具有防污微凝胶芯片的真实唾液测试示意图。

具体实施方式

通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。

在下文中，将参考附图描述本发明的实施例。在附图中，相同的附图标记代表相同或类似的部件，或者相同或类似的步骤。

为了解决现有技术中蛋白质高度非特异性产生了巨大的背景信号，导致对唾糖检测产生的不准确性的问题，提供一种具有防污微凝胶芯片的制备方法。

实施例一。

如图1所示本发明一个实施例中制备具有防污微凝胶芯片的流程图，根据本发明的一个实施例，一种具有防污微凝胶芯片的制备方法包括：

晶振片在piranha溶液和中超声10分钟，蒸馏水冲洗晶振片1并用氮气吹干。

然后放含有100μLγ―氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇(50mL)中，室温反应12小时。

蒸馏水冲洗晶振片并用氮气吹干，再放入马来酸酐(1g)的N,N-二甲基甲酰胺(50mL)反应12小时，再次蒸馏水冲洗，氮气吹干。

piranha溶液为：质量百分浓度为96％w/w的H

将516mg 3-丙烯酰胺基苯硼酸，831mg丙烯酰胺，350uL甲基丙烯酸缩水甘油酯，46.2mg N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，5mg偶氮二异丁腈加入到40mL乙腈种，90℃聚合1个小时，蒸馏水反复清洗，得到微凝胶；

苏氨酸和丝氨酸按照摩尔比1：1的比例，加入到乙醇溶液中，调节pH至10.5得到混合溶液，取500mg所述微凝胶分散到所述混合溶液中，50℃反应24小时，产物蒸馏水洗至中性，并加入乙醇，高速离心得到白色膏状物质。

在一些优选的实施例中，苏氨酸和丝氨酸按照摩尔比1：1的比例，加入到乙醇溶液中，该乙醇溶液的乙醇与水体积比为1：3。

取30mg所述白色膏状物质(微凝胶防污层)，50μLN-乙烯基吡咯烷酮，5μL乙二醇二甲基丙烯酸酯，3mg2,2-二甲氧基-苯基乙酮分散在50μL二甲基亚砜制备成预聚合溶液，

然后取25μL所述预聚合溶液置于石英板(10×10cm)上，将晶振片1正面朝下放置在所述预聚合溶液液上，利用压膜机压制晶振片背面，紫外灯(365nm)照射1个小时，蒸馏水冲洗并氮气吹干，完成将微凝胶防污层2交联固定在晶振片1上。

实施二。

本实施例提供一种芯片，该芯片包括晶振片，所述晶振片通过化学交联固定防污微凝胶，其中，所述防污微凝胶通过对微凝胶接枝氨基酸，形成微凝胶防污层，使所述为芯片降低蛋白质的非特异性吸附。

晶振片通过如下化学交联固定防污微凝胶：

对晶振片进行如下处理：

晶振片在piranha溶液和中超声10分钟，蒸馏水冲洗晶振片并用氮气吹干。piranha溶液为：质量百分浓度为96％w/w的H

然后放含有100μLγ―氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇(50mL)中，室温反应12小时。

蒸馏水冲洗晶振片并用氮气吹干，再放入马来酸酐(1g)的N,N-二甲基甲酰胺(50mL)反应12小时，再次蒸馏水冲洗，氮气吹干。

在晶振片上通过化学交联固定防污微凝胶：

取30mg所述微凝胶防污层，50μLN-乙烯基吡咯烷酮，5μL乙二醇二甲基丙烯酸酯，3mg2,2-二甲氧基-苯基乙酮分散在50μL二甲基亚砜制备成预聚合溶液。

然后取25μL所述预聚合溶液置于石英板(10×10cm)上，将晶振片正面朝下放置在所述预聚合溶液液上，利用压膜机压制晶振片背面，紫外(365nm)灯照射1个小时，蒸馏水冲洗并氮气吹干。

微凝胶通过如下方法合成：

将516mg 3-丙烯酰胺基苯硼酸，831mg丙烯酰胺，350uL甲基丙烯酸缩水甘油酯，46.2mg N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，5mg偶氮二异丁腈加入到40mL乙腈种，90℃聚合1个小时，蒸馏水反复清洗，得到微凝胶。

微凝胶防污层通过如下方法合成：

苏氨酸和丝氨酸按照摩尔比1：1的比例，加入到乙醇溶液中，调节pH至10.5得到混合溶液，取500mg微凝胶分散到所述混合溶液中，50℃反应24小时，产物蒸馏水洗至中性，并加入乙醇，高速离心得到白色膏状物质。

实施例三。

本实施例提供一种传感器，传感器包括芯片，该芯片包括晶振片，所述晶振片通过化学交联固定防污微凝胶，其中，所述防污微凝胶通过对微凝胶接枝氨基酸，形成微凝胶防污层，使所述为芯片降低蛋白质的非特异性吸附。

晶振片交联固定防污微凝胶的过程与实施例一和实施例二的方式相同，这里不再赘述。

下面对本发明提供的一种具有防污微凝胶芯片的制备方法、芯片，以及传感器进行实验验证。

1、表征：

扫描电子显微镜用于评价制备的防污微凝胶的形态和颗粒大小。

如图2a所示合成的微凝胶显微结构，微凝胶表面光滑，大小均匀(约600nm)，形貌呈球形。

如图2b所示合成的微凝胶防污层的显微结构，氨基酸后接枝到表面的微凝胶,表面出现不均匀。

如图2c所示芯片上固定微凝胶防污层后的显微结构，许多小球包装内的交联层，证明微凝胶抗污层被成功固定到芯片晶振片的表面。

2、稳定性：

在PBS(磷酸缓冲盐溶液，phosphate buffer saline，PBS)中，对传感器的稳定性进行评估。

如图3所示本发明具有防污微凝胶芯片的稳定性测试图。当聚合物涂覆的芯片暴露于PBS约2小时时，△F(频率位移)的波动值仅为△F＝～2.4Hz。

3、检出限：

为了得到葡萄糖传感器的检测限，实施例中逐步提高葡萄糖浓度。

如图4所示本发明具有防污微凝胶芯片的检出限测试示意图，结果表明，本发明提供具有防污微凝胶芯片的制备方法的检出限为5毫克每升。

4、检测范围：

不同范围的葡萄糖检测是通过调节不同的pH值实现的。

如图5所示本发明具有防污微凝胶芯片不同PH对测试的影响示意图，随着pH的升高，ΔF的绝对值逐渐增加。葡萄糖浓度从0到40毫克每升，传感器显示出良好的线性关系,线性相关系数分别为0.9523(pH6.8)、0.9274(pH 7.2)、0.9482(pH 7.5)

5、回复性：

如图6所示本发明具有防污微凝胶芯片的回复性测试示意图，芯片多次交替暴露200毫克每升葡萄糖和0毫克每升葡萄糖时，频率变化基本不变。

6、真实唾液测试：

为了进一步证明本发明葡萄糖芯片(传感器)的抗污染性能，实施例中使用真实唾液检测。

将棉签放入口中，咀嚼2-3分钟以充分吸收唾液，将棉签放入唾液收集管中，离心获得唾液。将等量的唾液和PBS混合，加入不同量的葡萄糖。如图7所示本发明具有防污微凝胶芯片的真实唾液测试示意图，随着葡萄糖浓度的逐渐增加,△F绝对值增大(图7中的a)。葡萄糖浓度与△F有良好的线性关系,线性相关系数为0.9671(图7中的b)。

本发明提供的一种具有防污微凝胶芯片的制备方法、芯片，以及传感器在QCM芯片上合成了一种防污微凝胶，在检测唾液葡萄糖时克服了蛋白质的非特异性吸附。

本发明提供的一种具有防污微凝胶芯片的制备方法、芯片，以及传感器，将含有硼酸的微凝胶被用作葡萄糖的结合位点，接枝到微凝胶上的氨基酸被用作蛋白抵抗成分，然后通过化学交联固定在芯片上，使葡萄糖传感器具有葡萄糖响应性和抗污染性能，能够在生理条件下检测0～40mg/L的唾液葡萄糖。

本发明提供的一种具有防污微凝胶芯片的制备方法、芯片，以及传感器，具有优越的蛋白质和有机分子耐受能力，实现了对唾液溶液中葡萄糖的检测(V

本发明提供的一种具有防污微凝胶芯片的制备方法、芯片，以及传感器，在唾液中葡萄糖分子含量极低(3.6-36mg/L)，频率变化很小的情况下，消除蛋白质高度非特异性导致的测试不准确的问题。

结合这里披露的本发明的说明和实践，本发明的其他实施例对于本领域技术人员都是易于想到和理解的。说明和实施例仅被认为是示例性的，本发明的真正范围和主旨均由权利要求所限定。