基于LFD-RPA技术的水稻细菌性条斑病菌检测试剂盒及其引物探针组合物与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及基于LFD-RPA技术的水稻细菌性条斑病菌检测试剂盒及其引物探针组合物与应用。

背景技术

稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)是黄单胞菌属病原细菌中的重要类群，由该菌的2个致病变种水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)和水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xoc)所引起的白叶枯病和细菌性条斑病是水稻粮食生产中两种非常严重的病害，严重威胁我国水稻的安全生产。水稻白叶枯病主要在我国和一些亚洲国家的许多稻作区流行，印度次大陆及韩国日本也有发生。水稻细菌性条斑病发生的范围要比水稻白叶枯病广泛得多，最早主要发现于菲律宾(1918年)，随后在亚洲的热带和亚热带地区、澳洲的北部以及非洲东部均发现有该病害，目前该病害在全世界的稻作区均有发生，除危害水稻外，还危害阔叶稻(Oryza latifolia)、茭白(Zizanialatifolia)，许多野生稻均可受侵染而发病。近二十年来，水稻细菌性条斑病在我国南方地区，尤其是广西、广东等亚热带地区快速流行，已成为我国南方地区水稻生产的主要病害。因此，相对于水稻白叶枯病，细菌性条斑病对我国水稻生产造成的危害更为严重，是我国进境植物检疫性有害生物。

目前，针对这种病原菌的检测方法主要有育苗生长观察法、病原菌分离培养及致病性测定等传统检测法，以及血清学检测和PCR检测等方法。但这些方法大多耗时较长、成本高、需要专业仪器设备与操作技术人员，无法满足现场快速检测(point-of-caretesting，POCT)的要求。

重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)是一种高效的恒温核酸扩增技术。其技术原理是：重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。该技术与PCR不同，不需要退火反应过程，可在常温条件下实现核酸指数扩增，通过与荧光基团标记，RPA技术可与侧流层析试纸条(lateral flowdipsticks，LFD)相结合，实现扩增产物的可视化检测，不需复杂仪器设备，适合现场快速检测，具有极为广泛的应用前景。RPA技术自2006年Piepenburg等首次报道以来发展迅速，在动物疫病诊断、微生物及其耐药性检测等领域均得到了很好的应用。如RPA技术已成功应用到日本血吸虫、猪嵴病毒和磺胺耐药基因等的检测中，结合LFD，检测结果在2-5min内直接可视。虽然LFD-RPA技术存在易因气溶胶污染导致假阳性等弱点，但其具有检测时间短、灵敏度高、特异性高、无需仪器且常温下即可反应等优势，在基层现场检测领域有较广阔的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何方便、快速、灵敏地检测水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测水稻细菌性条斑病菌的试剂盒，所述试剂盒包括检测水稻细菌性条斑病菌的组合物和LFD试纸；所述组合物包括引物XOC367-3F、引物XOC367-3R和探针Probe；所述引物XOC367-3F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物XOC367-3R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述探针Probe的核苷酸序列如SEQID No.3所示。

所述引物XOC367-3F为正向引物；所述引物XOC367-3R为反向引物。

上述试剂盒中，所述引物XOC367-3R的5’端用生物素标记。

上述试剂盒中，所述探针Probe具有下述任一修饰或其组合：

A1)在所述探针Probe的5’端起第30-35位碱基中的任一个碱基位置标记四氢呋喃；

A2)在所述探针Probe的5’端标记荧光基团；

A3)在所述探针Probe的3’端用胺基、磷酸基团或C3-spacer标记。

进一步地，所述标记四氢呋喃的位点距离3’端约15个碱基。

所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、TRT、CY3、CY5、ROX、JOE、FITC、TET、NED、TAMRA、LCRED460、LC RED705、Quasar705或Texas Red中的至少一种。

进一步地，上述试剂盒中，所述探针Probe的5’端标记FAM、距5’端33位碱基和34位碱基中间用四氢呋喃修饰以及3’端标记C3-spacer。

本发明还提供了检测水稻细菌性条斑病菌的组合物。

所述组合物为用于检测水稻细菌性条斑病菌的LFD-RPA可视化检测组合物。

本发明还提供了检测水稻细菌性条斑病菌的方法，包括以下步骤：

B1)提取待测样品基因组DNA；

B2)以所述基因组DNA为模板，用所述组合物进行LFD-RPA检测；根据LFD试纸条条带确定待测样品是否含有水稻细菌性条斑病菌。

上述方法中，根据LFD试纸条条带确定待测样品是否含有水稻细菌性条斑病菌的方法为：如果LFD试纸条出现两条紫红色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明待测样品中含有水稻细菌性条斑病菌；如果LFD试纸条只出现一条紫红色条带，位于质控区内，则结果为阴性，表明待测样品中不含有水稻细菌性条斑病菌。

所述位于质控区内的紫红色条带为质控线(C线)；所述位于检测区内的紫红色条带为检测线(T线)。

上述方法中，步骤B2)所述LFD-RPA检测的反应体系为：向RPA冻干酶中加入29.4μL缓冲液、11.5μL超纯水、10μM引物XOC367-3F 2μL、10μM引物XOC367-3R2μL、10μM探针Probe0.6μL、2μL DNA模板及2.5μL醋酸镁。

进一步地，所述方法在所述LFD-RPA检测体系下39℃水浴箱内进行扩增反应，15分钟后将扩增产物置于侧流层析检测试纸条密闭装置中，室温放置5分钟后观察。

本发明还提供了所述试剂盒在水稻细菌性条斑病菌的检测或辅助检测中的应用。

本发明还提供了所述组合物在水稻细菌性条斑病菌的检测或辅助检测中的应用。

本发明还提供了所述组合物在制备用于水稻细菌性条斑病菌的检测或辅助检测的产品中的应用。

水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xoc)是我国进境植物检疫性有害生物，可随种子进行远距离传播。快速简便的检测对于防止该病害的扩散传播具有重要意义。建立灵敏高效的LFD-RPA最佳体系的关键是要设计出扩增效率高、特异性强的引物和探针。由于其技术原理的特殊性，PCR引物往往不适用于LFD-RPA。因此，本发明依据水稻细菌性条斑病菌的基因序列，设计出特异性扩增引物XOC367-3F、引物XOC367-3R和探针Probe，建立了水稻细菌性条斑病菌的基于测流层析试纸条的重组酶聚合酶等温扩增(LFD-RPA)检测方法。该方法简捷、快速、灵敏、特异，可从不同的植物病原细菌中特异性地检测到3个参试水稻细菌性条斑病菌株。对病菌DNA的检测灵敏度可达2.59×10

附图说明

图1为灵敏度分析结果。1：259ng/μL；2：25.9ng/μL；3：2.59ng/μL；4：2.59×10

图2为特异性分析结果。

图3为模拟携带水稻细菌性条斑病菌的水稻种子样品LFD-RPA检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面实施例中，涉及的供试菌株、试剂和仪器为：

1、供试菌株

所有供试菌株公众均可从下列菌种库获得：

ATCC(American Type Culture Collection)为美国典型培养物保藏中心，其网站为https://www.atcc.org/。

NCPPB(National Collection of Plant Pathogenic Bacteria,UK)为英国植物病原细菌国家保藏中心，其网站为https://www.fera.co.uk/ncppb。

BCCM(Belgian Co-ordinated Collections of Micro-Organisms，BCCM/LMG Bacteria Collection)为比利时微生物保藏中心，其网站为https://bccm.belspo.be/catalogues/。

表1供试菌株信息

2、试验仪器：实时荧光PCR仪器购自罗氏诊断产品(上海)有限公司。

3、试验试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)购自天根生化科技(北京)有限公司；胶体金试纸条型RPA试剂盒购自山东潍坊安普未来生物科技公司；引物以及探针由上海生工生物工程有限公司合成；LFD测流层析胶体金试纸条购自美国Agdia公司。

实施例1LFD-RPA检测方法

1、菌株培养及保存

表1中的9株供试菌株均使用营养琼脂NA固体培养基和营养肉汤NB液体培养基进行培养。首先用接种环醮取保存在30％甘油中的菌液在NA固体培养基上划线，将平板置于28℃培养24-48h，然后挑取纯的单菌落至NB液体培养基中，28℃，200rpm，振荡培养过夜，培养好的菌液可用于基因组DNA的提取。菌株平时均用30％的甘油于-20℃冷冻保存。长期保存时需置于-80℃超低温冰箱中保存。

2、基因组DNA提取

2-1、供试菌株基因组DNA提取

使用细菌基因组DNA提取试剂盒，按照操作说明提取待测菌株基因组DNA，具体如下：

(1)取细菌培养液1.5mL，12000rpm离心2min，用移液器吸出上清，留沉淀。

(2)向沉淀中加入200μL缓冲液GA，充分振荡至沉淀完全悬浮。

(3)加入4μL RNaseA(100mg/mL)，振荡15s，室温放置5min。

(4)加入20μL蛋白酶K，振荡混匀。

(5)加入220μL缓冲液GB，振荡15s，70℃放置10min。

(6)加入220μL无水乙醇并振荡混匀。

(7)取吸附柱CB3放入收集管中，然后将上一步混匀的溶液全部转移到吸附柱中，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液(由于吸附柱的最大容量一般为700μL，所以该步骤有时需要分多次进行过柱)。

(8)向上一步离心后的吸附柱CB3中加入500μL已按要求加入无水乙醇的缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃废液。

(9)向上一步离心后的吸附柱CB3中加入600μL已按要求加入无水乙醇的漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃废液。

(10)重复上一步操作。

(11)将经过两次漂洗的吸附柱再次以12000rpm空离2min后倒掉收集管中的废液，打开管盖晾干数分钟。

(12)将彻底晾干的吸附柱CB3放入干净的离心管中，然后加入50μL TE，放置5min后12000rpm离心2min。

(13)将上一步离心得到的DNA重新吸取到吸附柱CB3中，放置2min后再次12000rpm离心2min。

(14)将最终得到的供试菌株DNA保存于-20℃备用。

2-2、种子样品基因组DNA提取

A、种子样品处理：称取种子样品50g左右倒入灭菌三角瓶中，加入适量无菌水，使种子完全浸没，4℃浸泡过夜。吸取10mL浸出液12000rpm离心5min，弃上清液，沉淀用于DNA提取。

B、DNA提取：使用新型植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取种子样品总DNA，具体按下述步骤操作：

(1)向上一步所得种子样品浸出液沉淀中加入400μL缓冲液LP1和6μL RNase A，旋涡振荡1min，室温放置10min。

(2)加入130μL缓冲液LP2，充分振荡混匀1min，使全部沉淀都被重新悬浮。

(3)随后12000rpm离心5min，吸取上清液到新的2mL离心管中。

(4)向上清液中加入1.5倍体积的已事先按要求加好相应量无水乙醇的缓冲液LP3，立即充分振荡混匀15sec。

(5)取吸附柱CB3放入收集管中，然后将上一步混匀的溶液全部转移到吸附柱中，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液(由于吸附柱的最大容量一般为700μL，所以该步骤有时需要分多次进行过柱)。

(6)向上一步离心后的吸附柱CB3中加入600μL已按要求加入无水乙醇的漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。

(7)重复上一步骤。

(8)将经过两次漂洗的吸附柱再次以12000rpm空离2min后倒掉收集管中的废液，打开管盖晾干数分钟。

(9)将彻底晾干的吸附柱CB3放入干净的离心管中，然后加入50μL洗脱缓冲液TE，放置5min后12000rpm离心2min。

(10)将上一步离心得到的DNA重新吸取到吸附柱CB3中，放置2min后再次12000rpm离心2min。

(11)将最终得到的种子样品DNA保存于-20℃备用。

2-3、DNA浓度测定

通过电泳检测所提DNA的质量并使用NanoDrop分光光度计测定其浓度。

3、引物和探针的设计与筛选

根据水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)全基因组中一段长度约为700bp的假定膜蛋白基因GHV42-03765为靶序列，设计了LFD-RPA的引物XOC367-3F、引物XOC367-3R与探针Probe。LFD-RPA引物和普通RPA的引物序列相同，只是LFD-RPA的反向引物5’端带有一个生物素(biotin)标记。本发明所述引物XOC367-3F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物XOC367-3R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述探针Probe的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。所述引物XOC367-3R的5’端用生物素标记。所述探针Probe的5’端起第33位碱基上标记FAM、距5’端33位碱基和34位碱基中间用四氢呋喃修饰，以及3’端标记C3-spacer。

具体引物和探针序列见表2。

表2 LFD-RPA扩增所用引物与探针序列信息

4、LFD-RPA检测体系及方法

向RPA冻干酶中加入29.4μL缓冲液、11.5μL超纯水、10μM引物XOC367-3F2μL、10μM引物XOC367-3R 2μL、10μM探针Probe 0.6μL、2μLDNA模板及2.5μL醋酸镁，充分混匀后放入39℃水浴箱内进行扩增反应，15分钟后将扩增产物置于侧流层析检测试纸条密闭装置中，室温放置5分钟后观察。根据LFD试纸条条带确定待测样品是否含有水稻细菌性条斑病菌。如果LFD试纸条出现两条紫红色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明待测样品中含有水稻细菌性条斑病菌；如果LFD试纸条只出现一条紫红色条带，位于质控区内，则结果为阴性，表明待测样品中不含有水稻细菌性条斑病菌。

实施例2LFD-RPA检测性能分析

利用系列梯度浓度259ng/μL、25.9ng/μL、2.59ng/μL、2.59×10

1、灵敏度分析

利用系列梯度浓度259ng/μL、25.9ng/μL、2.59ng/μL、2.59×10

2、特异性分析

分别选取3株阳性菌株(编号分别为：LMG654、LMG658、NCPPB1150)、4株同属病原菌(编号分别为NCPPB793、LMG817、NCPPB4351、LMG559)以及2株其它属病原菌(编号分别为LMG3189、NCPPB2309)，以其基因组DNA为模板来验证LFD-RPA体系特异性，将模板DNA替换为等量的水做空白对照(CK)。结果如图2所示，LFD测流层析试纸条结果显示只有水稻细菌性条斑病菌(编号分别为LMG654、LMG658、NCPPB1150)为阳性结果，其余病原菌DNA检测结果均为阴性，试纸条上只出现一条质控线，即LFD试纸条只出现一条紫红色条带，位于质控区内，结果为阴性，表明待测样品中不含有水稻细菌性条斑病菌。

实施例3种子样品的LFD-RPA检测

1、模拟带菌种子样品的制备

(1)接种用菌悬液的制备：将水稻细菌性条斑病菌阳性菌株LMG654于NA平板上进行活化，28℃培养24-48h，用无菌水将纯培养的菌株配制成10

(2)模拟带菌种子的制备：首先利用常规检测方法对所购买的健康水稻种子进行检测，以确保其上不带有水稻细菌性条斑病菌，随后在室温下，用按照步骤(1)所述方法制备的菌悬液浸泡健康水稻种子1小时，倒掉菌悬液，室温风干2天，制备成带菌种子样品。

2、种子样品的LFD-RPA检测

按照实施例1中步骤2-2的方法提取该实施例3中步骤1制备的模拟带菌种子样品的基因组DNA，以其为模板，利用本发明设计出的引物及探针组合物，按照实施例1中步骤4描述的体系及方法进行LFD-RPA检测。

利用建立的水稻细菌性条斑病菌LFD-RPA检测体系对2份人工接种水稻细菌性条斑病菌的水稻种子样品以及2份健康水稻种子进行了测试，检测结果如图3所示。从图3中可以看出，接种水稻细菌性条斑病菌的种子检测结果均为阳性，以健康水稻种子作为阴性对照的处理组和空白对照(CK)均为阴性结果(只有C线出现，即试纸条上只出现一条质控线)。说明本体系能够成功应用于水稻种子样品中细菌性条斑病菌的检测分析。

本研究中，我们基于LFD-RPA技术建立了针对水稻细菌性条斑病菌的核酸可视化检测技术，设计引物探针组合并评估其检测效能。经验证，此体系检测灵敏度高，可达2.59×10

带菌稻种是水稻细菌性条斑病的重要初侵染源，是病原菌远距离传播的最主要方式。因此，对稻种进行检测是提高水稻病害的控制水平，防止病害传播扩散，保证我国水稻产业持续、健康发展的重要途径。结果证明本研究所建立的LFD-RPA检测体系能够在水稻种子样品上进行应用。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 基于LFD-RPA技术的水稻细菌性条斑病菌检测试剂盒及其引物探针组合物与应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

caacgaggcg gtgcttccat gtcaaccgca g 31

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

acctttttgc catcgcctca ttccttgcat ac 32

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

agcaccagac caagcacctg aggtgtcaag ggtcttcccg agtggatcgg 50