LFD-RPA可视化快速检测曼氏血吸虫核酸的引物、探针、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种LFD-RPA可视化快速检测曼氏血吸虫核酸的引物、探针、反应体系、试剂盒及检测方法。

背景技术

曼氏血吸虫(S.mansoni)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、和埃及血吸虫(S. haematobium)是对人类危害最大的3种血吸虫。其中，曼氏血吸虫目前主要集中流行于非洲、中东地区、加勒比海地区和南美洲北部巴西委内瑞拉等国家。不同种的血吸虫有其特定的中间宿主螺，光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata)是曼氏血吸虫最重要的中间宿主之一，是生活在热带和亚热带淡水中的水生螺，而温度是影响和制约该螺分布和螺群规模的关键因素之一。我国是日本血吸虫病最主要的流行区，没有曼氏血吸虫病流行，但已在广东、深圳等地发现曼氏血吸虫中间宿主篙杆双脐螺的分布。随着全球气候变暖、一体化的实现，国际间交流的日益频繁，导致血吸虫感染者和宿主的活动性增大，大大增加了曼氏血吸虫病在我国传播的潜在风险。

血吸虫病的检测金标准是在粪便、尿液或组织中发现虫卵。但这种传统的病原学检测(直接涂片粪检法、改良加藤法等)漏诊率高、耗时耗力，加之大规模预防性化疗的实施，全球不少国家血吸虫病感染情况显著下降，使这种传统手段的敏感性大打折扣、受检者依从性降低，不再适用于血吸虫病监测和现场检测。免疫学检测被认为是有临床意义的，通过检测血吸虫特异性抗体或循环抗原作为血吸虫病筛查的工作，但免疫学方法特别是对抗体的检测不能有效区分现症与既往感染，同时也有反应时间长、容易出现假阳性结果等缺点，不能作为确诊的依据。在快速、有效检测手段的迫切需求下，以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)为代表的核酸扩增技术快速发展，包括常规PCR、巢式PCR(Nested PCR)、实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR)等，但因这些技术依赖昂贵仪器、需高温循环、成本高、耗时长等缺点，使其大多限制于条件优良的实验室内，难以广泛应用于现场及野外检测。重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymeraseamplification,RPA)是在这种背景下出现的一种新的检测技术，具有较高的敏感性和特异性，且操作简单，可在非实验室条件下实现对核酸的快速检测。因此，本研究立足于当前我国消除血吸虫的需求，拟将RPA和横向试纸条等其他技术相结合，建立基于直视RPA的检测技术，实现曼氏血吸虫的现场快速检测，为今后曼氏血吸虫病的防控及其中间宿主媒介的监测及传播风险识别提供技术支撑。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种可视化快速检测曼氏血吸虫核酸的检测方法，该方法具有敏感性高、检测快速、简单便携、无需借助昂贵仪器即可肉眼观察检测结果、适用于实验室及现场血吸虫病的早期诊断、鉴定和筛查的特点。

为解决上述技术问题，本发明根据登录号为AF101196.1的曼氏血吸虫COX1基因序列，设计并提供了以下技术方案。

第一方面，本发明提供一对LFD-RPA可视化快速检测曼氏血吸虫核酸的特异性RPA引物，所述RPA引物的核苷酸序列为：

上游引物RPA-PF:5'-TCAGGCGGTGGCGATCCTATTTTGTTTCAG-3'；(如SEQ ID NO.1所示)；

下游引物RPA-PR:Biotin-CCACCCCTGTGACACCACCAACCGTAAATA-3'；(如SEQ IDNO.2所示)。

作为一个优选的实例，所述引物中，下游引物(RPA-PR)的5'端为生物素化修饰。

本发明提供的特异性RPA引物，比PCR引物较长，最佳长度为30-35bp；5’端避免聚G(鸟嘌呤)，可争取C(胞嘧啶)；3’端的C、G有助于聚合酶的稳定结合，提升引物的扩增性能；GC含量40-60％。

第二方面，本发明提供一种LFD-RPA可视化检测血吸虫核酸的探针，所述探针序列特异性结合于如SEQ ID NO.4所示的引物扩增序列之间，探针序列长度为46-52nt(本发明中为 49nt),探针的5'端为荧光素或地高辛修饰(本发明中为荧光素，FAM)，距离5'端的30-35nt(本发明中为30nt)的中部位置标记一个dspacer(四氢呋喃，THF),作为核酸外切酶的识别位点，探针的3'端为磷酸化修饰。THF距离3'末端一般为15个碱基左右(本发明为19nt)。

具体地，本发明提供一种LFD-RPA可视化检测曼氏血吸虫核酸的RPA-nfo探针，所述探针的核苷酸序列为：

5'-FAM-CATCCAGAGGTTTATGTTTTGATCCTTCCG(THF)AGTTTTGGTATAGTTA GGC-C3Spacer-3'(如SEQ ID NO.3所示)。

具体地，所述探针的核苷酸序列中，5'端为荧光素修饰(FAM)，第31个碱基为四氢呋喃残基(THF)，3'为磷酸化修饰(C3-spacer)。

本发明还提供前述的引物及探针的组合。前述的引物及探针，其扩增的特异性片段为曼氏血吸虫线粒体编码区全序列基因中细胞色素C氧化酶亚基1的第945-1350bp间的序列，大小为406bp，扩增序列为：

TCAGGCGGTGGCGATCCTATTTTGTTTCAGCATTTATTTTGGTTTTTTGGTCATCCA GAGGTTTATGTTTTGATCCTTCCGGGTTTTGGTATAGTTAGGCATATCTGTATGAGTCTA AGGAATAAAGATTCGTCGTTTGGTTATTATGGATTGATTTGCGCTATGGCTTCCATAGT ATGCTTAGGTAGAGTAGTATGGGGTCATCATATGTTTATGGTTGGCTTTGATTCGTTAA CTGGAGTGTTTTTTAGTTCTATTACTATGATAATAGGTGTTCCTACTGGTATTAAGGTGT TTTCATGACTTTATATGTTGAATAGTTGTGGTATGCGGGTTTTAGATCCCATAGTATGGT GATTAGTCGGTTTTATATTTTTATTTACGGTTGGTGGTGTCACAGGGGTGG(如SEQ ID NO.4所示)。

本发明还提供前述的引物及探针的组合用于制备成LFD-RPA可视化快速检测曼氏血吸虫核酸的试剂盒的应用。

第三方面，本发明提供一种LFD-RPA可视化快速检测曼氏血吸虫核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：如SEQ ID NO.1～2所示的RPA引物对，和如SEQ ID NO.3所示RPA-nfo探针。

优选的，所述试剂盒还包括RPA扩增反应体系试剂。RPA扩增反应体系试剂是指除了引物对、探针及模板之外的RPA扩增反应体系中的所有试剂组分。所述RPA扩增反应体系试剂包含：RPA反应缓冲液、RPA扩增试剂、醋酸镁、双蒸水。其中，RPA扩增试剂是指依赖重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶的作用，实现目的基因扩增的试剂。所述RPA扩增试剂的组分包括：噬菌体重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、dNTP以及外切酶。

优选的，所述试剂盒还包括侧流层析试纸条(LFD)。

优选的，所述试剂盒还可以包括阴性对照品。在一种实施方式中，所述阴性对照品为双蒸水。

优选的，所述试剂盒还可以包括阳性对照品。在一种实施方式中，所述阳性对照品为曼氏血吸虫基因组DNA。

第四方面，本发明公开一种非诊断目的的LFD-RPA可视化检测曼氏血吸虫核酸的方法，其步骤为：

1)提取待测样本中的总DNA；

2)RPA扩增：将如SEQ ID NO.1～2所示的RPA引物对、如SEQ ID NO.3所示RPA-nfo探针、RPA反应缓冲液、总DNA模板及醋酸镁混合于含RPA扩增试剂的反应管中配置成RPA反应体系，反应温度设为20～50℃，反应时间为5～30min，进行RPA扩增；设置双蒸水为阴性对照，曼氏血吸虫基因组DNA为阳性对照；

3)LFD检测RPA扩增产物：采用侧流层析试纸条(LFD)检测RPA扩增产物；将扩增产物稀释后，滴加于侧流层析试纸条样品垫上，然后将侧流层析试纸条样品垫垂直插入100ul试纸条缓冲液中，室温反应5～10min。肉眼观察结果，当试纸条检测线及质控线均显色(出现紫色条带)，表明RPA扩增产物为阳性，样本中含有血吸虫DNA；若只质控线显色，表明RPA无目标扩增产物，样本中无血吸虫DNA；若质控线未显色，表明实验结果无效。

作为一个具体的实施例，所述RPA扩增试剂组分包括：噬菌体重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、dNTP以及外切酶。

作为一个具体的实施例，所述反应缓冲液为Rehydration Buffer。

作为一个具体的实施例，所述侧流层析试纸条为Milenia Genline Hybridetect-1试纸条。

作为一个具体的实施例，所述RPA反应体系通常为50ul反应体系：向含RPA组分的冻干粉中加入29.5μl Rehydration Buffer，2～2.5μl 10μM的上游引物、2～2.5μl 10μM的下游引物， 2～2.5μl 10μM的醋酸镁、1～5μl DNA模板，用双蒸水补足到50μl。

优选的，RPA扩增的较佳条件为：反应温度为39℃，反应时间为20min。

优选的，LFD检测RPA扩增产物的较佳条件为：将扩增产物稀释100倍后，取10μl滴加于侧流层析试纸条样品垫上，然后将试纸条样品垫垂直插入100ul试纸条缓冲液中，室温反应5min，肉眼观察结果。

本发明提供的上述方法可以应用于科研和教学中对不同来源样本的快速筛选和分类。从候选样本中筛选并确认出符合要求的曼氏血吸虫感染的样本(比如中间宿主)以用于进一步的研究。

为实现对曼氏血吸虫核酸的敏感、快速及简便检测，本发明经过大量的前期筛选工作，选取了曼氏血吸虫COX-1序列，设计了新型的RPA引物及探针，结合RPA技术及侧流层析试纸条法建立了曼氏血吸虫核酸可视化快速敏感检测方法，并对其检测曼氏血吸虫核酸的敏感性、特异性及循环核酸早期检测可行性进行初步评价。本发明中通过引入荧光标记的探针及生物素标记的引物，在RPA反应过程中，产生大量一端FAM标记、另一端生物素标记的双链DNA产物。RPA反应液滴加于金标试纸条并随试纸条层析移动时，标记有FAM和生物素的扩增产物与纳米金偶联抗体及检测线上的配体形成复合物使纳米金聚集显色，出现检测线。试纸条上的质控线包被有二抗，可与游离的FAM探针及FAM抗体标记的纳米金粒结合而显色，出现质控线，以指示结果的有效性。

本发明以曼氏血吸虫细胞色素C氧化酶亚基1(SmCOX1)为靶序列，设计了新型的RPA 扩增引物及RPA-nfo探针，将重组酶聚合酶扩增与侧流试纸条结合，建立了RPA-LFD可视化快速检测曼氏血吸虫核酸的方法。本发明公开的LFD-RPA方法在20～45℃反应10min即可肉眼检出血吸虫阳性条带，在39℃，20min的最佳反应条件下，其最低可检出10fg曼氏血吸虫成虫基因组DNA，比本实验室以COX1为靶标建立的RPA电泳检测方法(检出限1pg) 及PCR方法(检出限1pg)敏感性更高。本发明的方法检测阴性双脐螺、日本血吸虫、阳性钉螺、阴性钉螺、埃及血吸虫、华支睾吸虫、大片吸虫、卫氏并殖吸虫基因组DNA时基本无交叉反应，仅检测曼氏血吸虫基因组DNA时出现阳性结果，提示可以用于曼氏血吸虫的检测，检测特异性强。

本发明最低可成功检出感染曼氏血吸虫后1W时小鼠的粪便、血清DNA样本中的目的片段，显示了该方法用于检测血清和粪便痕量曼氏血吸虫DNA的可行性及优良性能，具有曼氏血吸虫的早期识别价值。

综上，本发明的有益效果为：本研究提供的LFD-RPA检测方法及试剂盒操作简单，无需特殊仪器设备(如荧光检测仪、电泳仪、电化学DNA传感器等)，反应温度范围宽，常用温度与室温接近，反应快速，可肉眼观察结果，具有较强的曼氏血吸虫病防治现场应用潜力。该方法能成功检出感染曼氏血吸虫后1W时小鼠的粪便、血清DNA样本中的目的片段，具有早期检测价值，有望用于曼氏血吸虫感染的早期检测，为及时发现曼氏血吸虫病传播的高危风险环境及输入性感染病例提供技术支撑，并为我国输入性血吸虫病的敏感监测提供技术储备。

附图说明

图1为实施例2中LFD-RPA检测曼氏血吸虫基因组DNA的反应温度优化的试纸条显色结果图。其中，1～7：左侧反应温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、 50℃；右侧均为对照灭菌双蒸水。

图2为实施例2中LFD-RPA检测曼氏血吸虫基因组DNA的反应时间优化的试纸条显色结果图。其中，1～7：左侧反应时间分别为0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min；右侧均为灭菌双蒸水。

图3为实施例3中LFD-RPA检测曼氏血吸虫基因组DNA的特异性评价的试纸条显色结果图。其中，1～10：分别为曼氏血吸虫、日本血吸虫、埃及血吸虫、阴性钉螺、阳性钉螺、阴性双脐螺、阳性双脐螺、华支睾吸虫、大片吸虫、卫氏并殖吸虫基因组DNA；11：灭菌双蒸水

图4为实施例3中LFD-RPA检测质粒DNA的敏感性评价的试纸条显色结果图。其中，1～6：基因组DNA浓度分别为10

图5为实施例3中LFD-RPA检测曼氏血吸虫基因组DNA的敏感性评价的试纸条显色结果图。其中，1～7：基因组DNA浓度分别为1ng/ul、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl、；8：灭菌双蒸水；

图6为实施例4中LFD-RPA检测曼氏血吸虫感染小鼠模型血清基因组DNA的试纸条显色结果图。其中，图6A中，1：曼氏血吸虫成虫基因组DNA 10ng/μl；2～10：为40条曼氏血吸虫尾蚴感染小鼠后1W、2W、3W、4W、5W、6W、7W、8W及对照组小鼠血清DNA； 11：灭菌双蒸水。图6B中，1：曼氏血吸虫成虫基因组DNA 10ng/μl；2～10：为80条曼氏血吸虫尾蚴感染小鼠后1W、2W、3W、4W、5W、6W、7W、8W及对照组小鼠血清DNA； 11：灭菌双蒸水

图7为实施例4中LFD-RPA检测曼氏血吸虫感染小鼠模型粪便基因组DNA检测的试纸条显色结果图。其中，图7A中，1：曼氏血吸虫成虫基因组DNA 10ng/μl；2～10：为40尾曼氏血吸虫尾蚴感染小鼠后1W、2W、3W、4W、5W、6W、7W、8W及对照组小鼠粪便DNA； 11：灭菌双蒸水。图7B中，1：曼氏血吸虫成虫基因组DNA 10ng/μl；2～10：为80尾曼氏血吸虫尾蚴感染小鼠后1W、2W、3W、4W、5W、6W、7W、8W及对照组小鼠粪便DNA； 11：灭菌双蒸水。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：模板DNA、引物及探针的制备

1)模板DNA制备：采用组织DNA抽提试剂盒(

2)血清DNA制备：使用omega公司的循环DNA抽提试剂盒进行感染后小鼠1W、2W、3W、4W、5W、6W、7W、8W血清DNA的抽提；

3)粪便DNA制备：天根公司的粪便DNA抽提试剂盒进行感染后小鼠1W、2W、3W、 4W、5W、6W、7W、8W粪便DNA的抽提，

4)引物及探针设计：以COX1基因片段为靶序列，采用Primer primer 5软件结合BLAST 设计RPA引物及探针，扩增产物长度为406bp。所有引物及探针DNA由上海生工生物科技有限公司合成。

上游引物(RPA-PF)为：5'-TCAGGCGGTGGCGATCCTATTTTGTTTCAG-3'；

下游引物(RPA-PR)为：5'-Biotin-CCACCCCTGTGACACCACCAACCGTAAATA-3”

探针(RPA-nfo probe)：5'-FAM-CATCCAGAGGTTTATGTTTTGATCCTTCCG(THF)AGTTTTGGTATAGTTAGGC-C3 Spacer-3'(5'端氨基修饰)；其中，5'端为荧光素修饰(FAM)；[THF]是四氢呋喃(tetrahydrofuran)残基，为核酸外切酶的识别位点；3'为磷酸基团封闭(ph)， ph代表磷酸基团，用以阻断DNA链的延伸。

实施例2：LFD-RPA检测曼氏血吸虫基因组DNA方法的建立及条件优化

1)LFD-RPA检测方法的建立：

参照

采用Milenia GenLine HybriDetect 1侧流层析试纸条检测RPA扩增产物。将扩增产物稀释100倍后，取10μl滴加于试纸条样品垫上，然后将试纸条样品垫垂直插入100μl试纸条缓冲液中，室温反应5min，肉眼观察结果。

当试纸条检测线及质控线均出现红色条带，表明RPA扩增产物为阳性，若只质控线显色，表明RPA无目标扩增产物；若质控线未显色，表明实验结果无效。

2)LFD-RPA检测曼氏血吸虫反应温度及时间条件优化结果：

在反应20min条件下，LFD-RPA在所设置的20、25、30、35、40、45梯度温度条件下质控线均出现条带，但50℃并未出现，其中30～45℃范围内检测线条带均较明显，且 35～40℃范围内检测线条带颜色最深(图1)，表明30～45℃为RPA适合反应温度区间， 35～40℃为最佳反应温度，因此选择RPA试剂盒推荐的39℃作为后续实验扩增温度。

在39℃扩增温度条件下，扩增10min即达到可检出的产物水平；10～30min内，阳性条带随着反应时间的增加逐渐增强，25min基本达到饱和(图2)。为满足低浓度模板的检测效率并提高时效性，同时避免非特异性扩增反应的产生，选择20min作为后续性能评价的反应时间。

实施例3：LFD-RPA检测曼氏血吸虫敏感性及特异性评价

选择39℃，20min作为RPA扩增条件，检测质粒DNA浓度分别为10

选择39℃，20min作为RPA扩增条件，将曼氏血吸虫基因组DNA模板设置为1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl 7个浓度梯度，以此评价LFD-RPA检测敏感性。

以曼氏血吸虫、埃及血吸虫、卫氏并殖吸虫、华支睾吸虫、阳性钉螺、阴性钉螺、阳性双脐螺、阴性双脐螺基因组DNA各1ng为模板，评价LFD-RPA检测的特异性。

结果显示：质粒DNA浓度分别为10

实施例4：LFD-RPA检测小鼠血清、粪便的效果评价

采用优化的实验条件，对感染后小鼠血清、粪便DNA进行LFD-RPA检测，考察该方法检测曼氏血吸虫感染血清及粪便样本中核酸的性能，评价其早期检测价值。

不同感染度(40尾、80尾)感染后小鼠1W、2W、3W、4W、5W、6W、7W、8W血清抽提DNA；同时提取不同感染度(40尾、80尾)感染后小鼠1W、2W、3W、4W、5W、6W、 7W、8W粪便DNA，评价该检测技术其早期感染的检出价值。

结果显示，LFD-RPA检测感染后1～8W的血清DNA时，40尾组于3W及以后出现肉眼可见阳性检测线，80尾组于1W及以后出现肉眼可见阳性检测线，而感染前血清DNA组未出现阳性检测线，如图6。而粪便样本结果显示，LFD-RPA检测40尾组感染后3～8W的粪便 DNA时，均出现肉眼可见阳性检测线，80尾组于1W及以后出现肉眼可见阳性检测线，而感染前血清DNA组及对照组未出现阳性检测线，如图7。

结果显示了本发明用于血清、粪便等复杂样品中痕量曼氏血吸虫循环核酸检测的可行性及优良性能，同时提示本发明用于曼氏血吸虫早期(童虫期)、中期(未产卵成虫期)及晚期(产卵期)感染宿主血清、粪便DNA检测的潜在应用价值，该方法可检出实验室曼氏血吸虫感染小鼠血清、粪便中DNA片段，具有早期检测价值，可用于以非诊断为目的的实验室早期鉴定及筛查。

综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所（国家热带病研究中心）

<120> LFD-RPA可视化快速检测曼氏血吸虫核酸的引物、探针、试剂盒及方法

<130> CPC-NP-21-102513

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 正向引物(正向引物)

<400> 1

tcaggcggtg gcgatcctat tttgtttcag 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 反向引物(反向引物)

<400> 2

ccacccctgt gacaccacca accgtaaata 30

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 探针(探针)

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> n为四氢呋喃

<400> 3

catccagagg tttatgtttt gatccttccg nagttttggt atagttaggc 50

<210> 4

<211> 406

<212> DNA

<213> 曼氏血吸虫COX1序列(Sm COX1)

<400> 4

tcaggcggtg gcgatcctat tttgtttcag catttatttt ggttttttgg tcatccagag 60

gtttatgttt tgatccttcc gggttttggt atagttaggc atatctgtat gagtctaagg 120

aataaagatt cgtcgtttgg ttattatgga ttgatttgcg ctatggcttc catagtatgc 180

ttaggtagag tagtatgggg tcatcatatg tttatggttg gctttgattc gttaactgga 240

gtgtttttta gttctattac tatgataata ggtgttccta ctggtattaa ggtgttttca 300

tgactttata tgttgaatag ttgtggtatg cgggttttag atcccatagt atggtgatta 360

gtcggtttta tatttttatt tacggttggt ggtgtcacag gggtgg 406