一种肺炎支原体药敏快速检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于临床医学检测技术领域，具体涉及一种肺炎支原体药敏快速检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

肺炎支原体是人类支原体肺炎的病原体。支原体肺炎主要通过飞沫传播，儿童和青少年最易被传染，潜伏期可达2～3周，大多起病较缓慢，症状主要以呼吸道症状为主，表现为发热、咳嗽、咽痛、头痛，一年四季均可以发生，但是秋冬时节更容易感染。因此，建立一种敏感、稳定的检测方法对肺炎支原体的检测和监控及流行病学调查具有重要的意义。

肺炎支原体感染潜伏期长，病情发展缓慢，症状表现不明显，与常见细菌、病毒感染所致呼吸道症状相似，仅通过临床症状和用药情况，不能准确判断是否发生肺炎支原体感染。另外，由于支原体没有细胞壁，多数抗生素对肺炎支原体无治疗效果，不规范用药也使得少数有效抗生素也存在耐药菌株。即使确定为肺炎支原体感染，也不能盲目用药，合理的药敏试验是指导临床用药的重要参考依据。因此，需要一种肺炎支原体药敏快速检测试剂盒及其制备方法。

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于提供一种肺炎支原体药敏快速检测试剂盒及其制备方法，旨在缩短肺炎支原体检测时间，而且可同时进行耐药检测，进而指导临床用药，具有灵敏度高、特异性强、检出率高、操作简便等优势。

用于解决问题的方案

本发明提供了一种肺炎支原体药敏快速检测试剂盒。所述试剂盒包括：肺炎支原体培养液、药敏板和治疗肺炎支原体的药物；所述肺炎支原体培养液包括以下组分：琼脂粉7～10g，蛋白胨5～8g，短链肽2～3g，莫诺苷700～800mg，酵母粉3～5g，葡萄糖2～4g，丙酮酸钠2.5～3.5g，MEM培养基90～120mL，1％(w/v)酚红溶液2mL，马血清140～180mL，30万单位青霉素和蒸馏水750～850mL，所述短链肽为由3-5个氨基酸残基组成的短链肽。

在以上技术方案中，本发明优化了肺炎支原体培养液的成分和用量。所述短链肽为由3-5个氨基酸残基组成的短链肽，也是蛋白质水解的中间产物。肺炎支原体基因组小，自身合成能力较弱，本发明发现，在肺炎支原体培养液中加入所述短链肽后，能快速促进肺炎支原体的生长。

莫诺苷是从山茱萸干燥成熟果肉中提取得到的，研究表明莫诺苷具有保护细胞免于过氧化氢诱导的细胞毒性和细胞凋亡的作用。本发明发现在一定浓度范围内莫诺苷能够延长肺炎支原体稳定期，减慢肺炎支原体凋亡的速度。

所述肺炎支原体液体培养基用于培养肺炎支原体，由于肺炎支原体生长时可以分解葡萄糖产生酸性物质，培养基pH值会下降，液体培养基颜色会由最初的偏红色，逐渐变成橙色，变成最终的黄色。本发明将所述短链肽和所述莫诺苷配合加入肺炎支原体培养液中，两者相互作用，显著促进了肺炎支原体细胞的生长和代谢。8～12h即可观察到酚红指示剂的颜色变化，16～20h已完全变黄。因此，提高了传统的肺炎支原体培养基的特异性、灵敏度、缩短了检测时间，可以快速地进行支原体肺炎的确诊。此外，药敏检测试剂盒可以准确地检测出感染肺炎支原体时对多种临床常用抗生素中哪种抗生素敏感，从而准确地指导用药，避免盲目用药和用药过度，提高治愈率。

进一步，所述肺炎支原体培养液包括以下组分：琼脂粉9g，蛋白胨7g，短链肽2.6g，莫诺苷780mg，酵母粉4g，葡萄糖3g，丙酮酸钠3g，MEM培养基100mL，1％(w/v)酚红溶液2mL，马血清150mL，30万单位青霉素和蒸馏水800mL。

进一步，为了更快速地促进肺炎支原体的生长，所述短链肽优选为Ala-Asn-Leu、Ala-Ser-Asn-Thr或Ala-Ser-Asn-Leu-Val。

进一步，所述药敏板为96孔培养板，标有A～H号，A～H号依次包被有8种不同的所述药物，每个标号的1～11孔中，所述药物的浓度为128μg/mL～0.125μg/mL且设置为依次递减，列举为：128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL。

进一步，所述药物选自以下抗生素药物：大环内酯类、四环素类、氯霉素类、氨基酸糖苷类和氟喹诺酮类。

进一步，所述药物选自以下抗生素药物：林可霉素、克林霉素、青霉素、头孢菌素、环丙沙星、恩诺沙星、红霉素、氟苯尼考、替米考星或四环素。

另外，本发明还提供了一种肺炎支原体药敏快速检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)肺炎支原体培养液的制备：将琼脂粉、蛋白胨、短链肽、莫诺苷、酵母粉、葡萄糖、丙酮酸钠溶于蒸馏水中，加入MEM培养基、1％(w/v)酚红溶液，110℃灭菌30min后，加入56℃灭活的马血清和青霉素，调节PH值为7.6～7.8，分装至15mL的培养管中，9mL/管。

(2)药敏板的制备：

①将所述药敏板粗洗，精洗，50℃条件下烘干备用；

②将待筛选的8种所述药物溶解到2～5mL缓冲液中，依次稀释至128μg/mL～0.125μg/mL；

③用加样器分别吸取各浓度的所述药物，添加到相对应的96孔板中，静置30分钟后，吸出。

发明的效果

(1)本发明的肺炎支原体药敏快速检测试剂盒中所采用的肺炎支原体培养液能快速促进肺炎支原体生长，缩短了显色时间，16～20h内即可完成检测；

(2)本发明检测试剂盒性能稳定，特异性强，减少检测过程中假阴性的出现，可以准确地检测出感染肺炎支原体时对多种临床常用抗生素中哪种抗生素敏感，从而准确地指导用药，避免盲目用药和用药过度，提高治愈率。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。本发明不限于以下的实施例。

实施例1

一种肺炎支原体药敏快速检测试剂盒，包括肺炎支原体培养液、药敏板和治疗肺炎支原体的药物。

所述肺炎支原体培养液包括以下组分：琼脂粉9g，蛋白胨7g，短链肽Ala-Asn-Leu2.6g，莫诺苷780mg，酵母粉4g，葡萄糖3g，丙酮酸钠3g，MEM培养基100mL，1％(w/v)酚红溶液2mL，马血清150mL，30万单位青霉素和蒸馏水800mL。

所述药敏板为96孔培养板，标有A～H号，A～H号依次包被有8种不同的所述药物，每个标号的1～12孔中，所述药物的浓度按照128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0μg/mL依次递减设置。

所述药物为以下抗生素药物：林可霉素、青霉素、头孢菌素、环丙沙星、红霉素、氟苯尼考、替米考星或四环素。

另外，本发明还提供了一种肺炎支原体药敏快速检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)肺炎支原体培养液的制备：将琼脂粉、蛋白胨、短链肽、莫诺苷、酵母粉、葡萄糖、丙酮酸钠溶于蒸馏水中，加入MEM培养基、1％(w/v)酚红溶液，110℃灭菌30min后，加入56℃灭活的马血清和青霉素，调节PH值为7.6～7.8，分装至15mL的培养管中，9mL/管。

(2)药敏板的制备：

①将所述药敏板粗洗，精洗，50℃条件下烘干备用；

②将待筛选的8种所述药物溶解到2～5mL缓冲液中，依次稀释至128μg/mL～0.125μg/mL；

③用加样器分别吸取各浓度的所述药物，添加到相对应的96孔板中，静置30分钟后，吸出。

实施例2

所述短链肽为Ala-Ser-Asn-Thr，其他条件同实施例1。

实施例3

所述短链肽为Ala-Ser-Asn-Leu-Val，其他条件同实施例1。

对比例1

所述肺炎支原体培养液中不含所述短链肽，其他条件同实施例1。

对比例2

所述短链肽为Tyr-Leu-Tyr-Glu-Val-Ala，其他条件同实施例1。

对比例3

所述肺炎支原体培养液中不含莫诺苷，其他条件同实施例1。

试验例一

肺炎支原体在不同培养液中生长情况

肺炎支原体可利用葡萄糖，葡萄糖分解时产生H

分别用实施例1-3及对比例1-3的培养液培养肺炎支原体，并记录传代稳定后各培养物的颜色变化。实验结果如表1所示。

表1.实施例1-3及对比例1-3的培养液颜色变化情况

注：“-”表示未生长；“+，++，+++，++++”分别表示培养基颜色变黄的程度。

由表1可知，实施例1～3培养液培养肺炎支原体8h后，即可观察到颜色变化，20h已完全变黄，颜色变化均早于对比例1～3的培养液。

试验例二

不同培养液灵敏性、特异性、稳定性检测

灵敏性检测：取实施例3的培养液3支，参考2010年药典第三部灵敏度检测方法，检测10

特异性检测：取实施例3的培养液4支，分别接种10

稳定性检测：将培养液成品置于37℃±1℃下加速试验6天。检测灵敏度和特异性均符合上述要求。

试验例三

试剂盒药敏检测

2020年10月份，采自河南、河北、西安的50个鼻拭子中分离得到3株肺炎支原体A、B、C，并通过特异性PCR进行确定。随后对分离株采用本发明涉及的试剂盒进行药敏试验，实验方法如下：

1.支原体的分离培养

1.1疑似支原体感染样品的处理

鼻拭子：用2ml生理盐水浸润拭子后，8000rpm离心5min，用注射器吸取1mL上清液，经0.45μm滤膜滤过后备用；

1.2液体培养

将1mL处理好的样品上清液加入到含9mL实施例3培养液的15ml离心管中，吸取100μL加入药敏孔中，培养20小时。若第12孔液体培养基由红色变为黄色且透亮的培养液判为疑似肺炎支原体阳性，若无变色且透亮，盲传1次后再次判定。

1.3药敏试验结果判定：

对于肺炎支原体阳性的样品，培养48小时后，从右到左，红色首孔所对应的药物浓度即为药物的最小抑菌浓度。例如：当第12孔变为黄色时，8—11孔为黄色，1-7孔为红色，则第7孔为红色首孔，其所对应的药物浓度为2μg/ml，即为该药物的最小抑菌浓度。

实验结果如表3所示。

表3.不同分离株的常用药物敏感性试验

从表3看出，本发明的药敏检测试剂盒可以准确地检测出感染肺炎支原体时对多种临床常用抗生素中哪种抗生素敏感，从而准确地指导用药，避免盲目用药和用药过度，提高治愈率。