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Lgr5基因在保护内耳毛细胞及促进支持细胞再生上的应用

文献发布时间：2023-06-19 11:59:12

技术领域

本发明涉及耳蜗毛细胞的保护与再生技术领域，尤其涉及Lgr5基因在保护内耳毛细胞及促进支持细胞再生上的应用。

背景技术

在哺乳动物中，听觉毛细胞和支持细胞仅在胚胎发育中产生，由于环境压力、耳毒性、遗传因素或老化导致的毛细胞缺失是永久性的，一旦受到损伤将会导致永久耳聋，内耳毛细胞的不可逆损伤是造成感音神经性聋的核心原因。目前临床上常用的助听器和人工耳蜗移植治疗虽然在一定程度上改善了患者的听力，但是其效果完全依赖于残留毛细胞的数量和质量；因此最理想的治疗感音神经性聋的方法是通过干细胞治疗使毛细胞再生达到耳蜗结构和功能的修复，从而在根本上恢复听力。在临床上助听器和人工耳蜗移植是当前恢复耳聋患者听觉功能的主要技术方法。助听器通过传声器将外界声音信号转变为电信号，输入放大器后将声压放大到1万乃至几万倍，再经耳机输出这个放大后的声信号。人工耳蜗通过外机接收声音语言信号,接收刺激器将这种信号转换成电信号传到植入体中的电极线上,再通过神经细胞接收电信号并将电信号传到大脑中。助听器和人工耳蜗移植虽然能帮助患者重建听觉功能，但是都是借助残存的毛细胞，存在一定的局限性，不能从根本上解决问题。

现有技术只能使部分支持细胞再生为毛细胞，再生效率不是特别高，并且参与这一过程的分子机制仍不是很清楚，这可能是多基因多信号通路相互作用的结果，需要后续的探索去说明究这一复杂的再生过程。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种Lgr5基因在保护内耳毛细胞及促进支持细胞再生上的应用，该方法首先构建了Lgr5、Lgr5-C(Lgr5 823位氨基酸后全部截断)和Lgr5-190(190位氨基酸发生点突变，由丙氨酸变为天冬氨酸) 的腺病毒，然后分别探究Lgr5基因的C末端和N末端对毛细胞的保护作用和内耳干细胞的再生作用，最后分别研究Lgr5基因的C末端和N末端在内耳中的具体作用机制，可直观的反映出Lgr5具有良好的促进内耳毛细胞再生的效果，为解决耳聋问题及后期的临床应用增加了有力的证据。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

Lgr5基因在保护内耳毛细胞及促进支持细胞再生上的应用，所述Lgr5的C 端具有如SEQ NO.4所示的核苷酸序列，且N端的第190位具有编码丙氨酸(GCC) 的核苷酸序列。

SEQ NO.4(即823位后的核苷酸序列)

AATCCCCATTTTAAGGAGGATATGGGCAGCCTGGGAAAGCATACCCGTTTCTGGATGAGATCAAAACACGCGAGTCTGCTGTCCATTAACTCGGACGATGTTGAGAAACGGTCCTGTGAGTCAACCCAAGCCTTAGTA TCCTTTACCCACGCCAGCATAGCCTATGACTTGCCTTCCACTTCCGGGGCATCACCAGCTTACCCCATG ACTGAAAGCTGTCATCTCTCTTCAGTTGCATTTGTCCCATGTCTCTAG

SEQ NO.5(即823位后的氨基酸序列)

NPHFKEDMGSLGKHTRFWMRSKHASLLSINSDDVEKRSCESTQALVSFTHASIAYDLPSTSGASPAYPMTESCHLSSVAFVPCL

作为改进的是，所述应用的验证方法，包括以下步骤：

步骤1，Lgr5基因的C末端823位氨基酸后被全部被截断，N端第190位氨基酸丙氨酸(GCC)突变为天冬氨酸(GAC)后，并将全长的Lgr5、Lgr5-C和Lgr5-190 构建为腺病毒和作为对照的RFP的腺病毒备用，且这四种腺病毒均可发出红色荧光；

步骤2，在类毛细胞系HEI-OC1细胞中分别加入Lgr5、Lgr5-C、Lgr5-190 和RFP(Ctr),通过对细胞进行染色，记录细胞的生长情况；

步骤3，对转染了Lgr5腺病毒、Lgr5-C腺病毒、Lgr5-190腺病毒和RFP(Ctr) 腺病毒的类毛细胞HEI-OC1细胞进行RNA提取，并逆转录为cDNA通过QPCR检测细胞RNA水平的凋亡情况，发现加入Lgr5-C后，促凋亡基因caspase8/9/12和 Bax显著增加，抗凋亡基因P21和Bcl2显著降低，ROS相关基因Catalase显著降低；

步骤4，选取P0-P3的Lgr5-EGFP-CreERT2/+转基因小鼠，解剖耳蜗并取出基底膜，通过流式分选筛选出Lgr5阳性的支持细胞，分别加入不同转染复数的 Lgr5、Lgr5-C、Lgr5-190和RFP(Ctr)，于低粘附的96孔板中培养5天，确定相关数据。

作为改进的是，步骤2中染色采用的是通过PI/FITC凋亡试剂盒、tunel染色或DCFH-DA染色。

进一步改进的是，当染色采用通过PI/FITC凋亡试剂盒或tunel染色时，可通过流式分析仪检测细胞凋亡情况，并记录细胞凋亡率。

进一步改进的是，当染色采用DCFH-DA染色时，可检测细胞ROS水平。

作为改进的是，所述相关数据为转染复数、细胞成球的大小及数目，或支持细胞分化为毛细胞的数量。

进一步改进的是，当相关数据为细胞成球的大小及数目时，将在低粘附的 96孔板中培养5天，通过活细胞工作站拍摄，再通过imageJ软件分别统计各组细胞成球的大小和数目。

进一步改进的是，当相关数据为支持细胞分化为毛细胞的数量时，将在低粘附的96孔板中培养5天，随后转移到提前涂好laminin的四孔皿中进行贴壁分化培养10天，最后进行免疫荧光染色，免疫荧光结果显示每组支持细胞分化为毛细胞的数量。

有益效果：

与现有技术相比，本发明Lgr5基因在保护内耳毛细胞及促进支持细胞再生上的应用，该方法首先构建了Lgr5、Lgr5-C(Lgr5中823位氨基酸后全部截断) 和Lgr5-190(190位氨基酸发生点突变，由丙氨酸变为天冬氨酸)的腺病毒，然后分别探究Lgr5基因的C末端和N末端对毛细胞的保护作用和内耳干细胞的再生作用，最后分别研究Lgr5基因的C末端和N末端在内耳中的具体作用机制。从Lgr5的C末端缺少会增加类毛细胞系HEI-OC1的凋亡上看，表明Lgr5的C 末端参与调控类毛细胞的保护；对流式筛选的Lgr5阳性支持细胞进行成球实验发现，Lgr5的N末端(190位)的点突变后其成球的直径和数量都明显减少；从而确定Lgr5基因对毛细胞的保护和支持细胞再生为毛细胞的作用机制，为治疗耳聋提供新的理论思路，最终代替助听器和人工耳蜗帮助患者恢复和重建听觉功能。

附图说明

图1为G蛋白偶联受体(GPCR)和Lgr5的结构示意图，其中(A)为GPCR 的总体结构，(B)为Lgr5的结构；

图2为对类毛细胞系HEI-OC1分别按照不同的感染复数(MOI)转染腺病毒Lgr5、Lgr5-C、Lgr5-190、RFP(Ctr)进行转染，得到合适的转染复数，MOI＝200；

图3为不同腺病毒转染HEI-OC1细胞后，HEI-OC1细胞的凋亡情况；

图4为腺病毒Lgr5、Lgr5-C、Lgr5-190、RFP(Ctr)分别转染HEI-OC1细胞后，通过免疫荧光tunel染色显示Lgr5的C末端缺失会增加HEI-OC1细胞的凋亡； (A)为tunel染色的免疫荧光图，(B)对凋亡细胞的统计，(C)为通过QPCR 检测，发现Lgr5-C会导致HEI-OC1细胞的凋亡；

图5为腺病毒Lgr5、Lgr5-C、Lgr5-190、RFP(Ctr)分别转染HEI-OC1细胞后，分别通过免疫荧光和QPCR检测Lgr5的C末端缺失，对HEI-OC1细胞的活性氧 ROS水平的表达，(A)为DCFH-DA活性氧试剂盒对ROS染色的免疫荧光图，(B) 为活性氧ROS的流式分析图，(C)是对B图的统计，(D)是通过QPCR检测，发现Lgr5-C会导致HEI-OC1细胞部分ROS基因表达升高。

图6(A)为通过流式分选得到Lgr5阳性支持细胞的示意图；

图6(B)为分别加入不同感染复数(MOI)10,50,100,300,500,700的腺病毒 Lgr5、Lgr5-C、Lgr5-190、RFP(Ctr)分别对Lgr5阳性支持细胞进行转染，得到合适的转染复数，MOI＝300；

图7为通过流式分选得到Lgr5阳性支持细胞，加入腺病毒Lgr5、Lgr5-C、 Lgr5-190、RFP(Ctr)分别对Lgr5阳性支持细胞进行转染，Lgr5-190导致Lgr5 阳性支持细胞成球的大小和数目减少；(A)为该实验流程图，(B)为活细胞工作站拍摄培养5天的Lgr5阳性支持细胞的明场图，(C-D)分别是对B图的统计；

图8为通过流式分选得到Lgr5阳性支持细胞，加入腺病毒Lgr5、Lgr5-C、 Lgr5-190、RFP(Ctr)分别对Lgr5阳性支持细胞进行转染，Lgr5-190导致Lgr5 阳性支持细胞分化为毛细胞的数目减少；(A)为该实验流程图，(B)为免疫荧光图，(C-E)分别是对B图的统计。

具体实施方式

本发明所用的Lgr5、Lgr5-C、Lgr5-190和RFP(对照)的腺病毒均直接购买于汉恒生物，且所有病毒均带有红色荧光。

其中，Lgr5、Lgr5-C和Lgr5-190核苷酸序列信息分别为SEQ NO.1、SEQ NO.2 和SEQNO.3所述。

SEQ NO.1：

ATGGACACCTCCTGCGTCCACATGCTCCTGTCCTTGCTGGCGCTGCTGCAGTTGGTGGC CGCCGGCAGCTCACCGGGACCAGATGCGATACCGCGGGGCTGCCCATCACACTGTCAC TGTGAGCTGGATGGCAGGATGCTGCTCAGGGTGGACTGCTCGGACCTGGGGCTCTCGG AGCTGCCCTCCAACCTCAGCGTCTTCACCTCCTACCTGGACCTCAGTATGAACAACATC AGTCAGCTACCCGCCAGTCTCCTACATCGCCTCTGCTTCCTAGAAGAGTTACGTCTTGCTGGAAATGCTTTGACACACATTCCCAAGGGAGCGTTCACGGGCCTTCACAGCCTCAAA GTGCTTATGCTGCAGAACAACCAGCTGAGACAGGTTCCGGAGGAAGCGCTACAGAAT TTGAGAAGCCTTCAATCCCTGCGCCTAGATGCCAACCACATCAGCTACGTGCCACCCA GCTGTTTCAGCGGCCTGCACTCCCTGAGGCACCTGTGGCTAGATGACAATGCTCTCAC AGACGTCCCTGTCCAGGCTTTCAGAAGTTTATCAGCCCTGCAAGCCATGACCTTGGCC CTGAACAAAATACACCACATAGCAGACTACGCCTTTGGAAACCTCTCCAGCCTCGTGG TTCTGCATCTCCATAATAATAGAATCCACTCCCTGGGAAAGAAATGCTTTGATGGACTC CACAGCCTGGAGACTTTAGATTTAAATTATAATAACCTTGATGAATTCCCCACTGCAATC AAGACACTCTCCAACCTTAAGGAACTAGGATTCCACAGCAACAACATCAGGTCAATACCGGAGCGAGCGTTCGTAGGCAACCCTTCTCTTATCACAATACACTTCTATGACAACCCC ATCCAATTTGTTGGAGTATCTGCTTTTCAGCATTTGCCTGAACTAAGAACACTGACTTT GAATGGTGCCTCGCACATTACTGAATTTCCTCACTTGACAGGAACTGCCACCCTGGAG AGTCTGACTTTAACTGGAGCAAAGATCTCATCTCTTCCCCAGGCCGTCTGTGATCAGTT ACCTAATCTCCAAGTGCTAGATTTGTCTTACAACCTACTCGAAGACTTACCCAGTTTGT CAGGCTGCCAAAAACTTCAGAAAATTGACCTGAGGCATAACGAGATCTATGAAATTAA GGGCAGCACTTTTCAGCAGTTGTTTAACCTCCGATCTCTGAACTTAGCATGGAATAAAA TTGCTATCATTCACCCCAATGCGTTTTCTACGTTGCCGTCTCTAATAAAGTTGGACCTAT CATCCAATCTCCTGTCGTCCTTCCCTGTGACTGGGTTACATGGTTTAACTCACTTAAAAT TAACAGGGAACCGAGCCTTACAGAGCCTGATACCATCTGCAAACTTCCCAGAGCTCAA GATTATAGAAATGCCATCTGCTTACCAGTGTTGTGCATTTGGGGGGTGTGAGAATGTCT ATAAAATTTCTAACCAATGGAATAAAGACGACGGCAACAGTGTGGACGACCTTCATAA GAAAGACGCTGGGTTATTTCAAGTTCAAGATGAGCGGGACCTTGAAGATTTCCTACTT GACTTTGAGGAAGACCTGAAGGCCCTTCACTCGGTGCAGTGCTCGCCTTCCCCAGGTCCCTTCAAGCCCTGTGAGCACCTATTTGGTAGCTGGCTGATCCGAATCGGGGTGTGGAC CACGGCAGTACTGGCGCTTTCCTGCAATGCCTTGGTGGCTTTGACCGTGTTCAGAACT CCTCTGTACATCTCTTCCATAAAGCTGCTAATTGGGGTAATCGCGGTAGTGGACATTCTC ATGGGGGTCTCCAGTGCTGTGCTGGCTGCCGTGGATGCATTCACTTTTGGCCGTTTTGC TCAGCACGGTGCGTGGTGGGAAGACGGAATCGGCTGCCAAATCGTTGGCTTCCTGTCC ATTTTTGCTTCCGAATCGTCGATCTTCCTGCTCACTCTGGCAGCGCTGGAACGAGGTTT TTCTGTCAAGTGCTCTTCGAAGTTTGAAGTGAAAGCTCCCCTTTTTAGCCTGAGAGCG ATCGTTTTGCTATGTGTCCTGTTGGCCCTGACCATTGCCACAATCCCCTTGCTAGGAGG CAGTAAGTACAATGCCTCTCCCCTCTGCCTGCCCTTGCCCTTTGGGGAGCCCAGCACC ACGGGCTACATGGTGGCTCTCGTGTTGCTCAACTCTCTCTGTTTCCTCATAATGACCATT GCCTACACAAAGCTCTACTGCAGTTTGGAGAAAGGAGAGCTGGAGAATCTTTGGGATT GTTCGATGGTGAAGCACATTGCTCTGTTGCTCTTCGCCAACTGCATCCTTTACTGCCCC GTGGCTTTCTTATCCTTCTCCTCTTTGCTAAACCTCACCTTTATCAGTCCTGACGTCATT AAATTTATACTTCTCGTGATCGTCCCACTTCCTTCCTGTCTCAACCCACTTCTCTACATTGTCTTCAATCCCCATTTTAAGGAGGATATGGGCAGCCTGGGAAAGCATACCCGTTTCTG GATGAGATCAAAACACGCGAGTCTGCTGTCCATTAACTCGGACGATGTTGAGAAACGG TCCTGTGAGTCAACCCAAGCCTTAGTATCCTTTACCCACGCCAGCATAGCCTATGACTT GCCTTCCACTTCCGGGGCATCACCAGCTTACCCCATGACTGAAAGCTGTCATCTCTCTT CAGTTGCATTTGTCCCATGTCTCTAG

SEQ NO.2

SEQ NO.3

ATGGACACCTCCTGCGTCCACATGCTCCTGTCCTTGCTGGCGCTGCTGCAGTTGGTGGC CGCCGGCAGCTCACCGGGACCAGATGCGATACCGCGGGGCTGCCCATCACACTGTCAC TGTGAGCTGGATGGCAGGATGCTGCTCAGGGTGGACTGCTCGGACCTGGGGCTCTCGG AGCTGCCCTCCAACCTCAGCGTCTTCACCTCCTACCTGGACCTCAGTATGAACAACATC AGTCAGCTACCCGCCAGTCTCCTACATCGCCTCTGCTTCCTAGAAGAGTTACGTCTTGCTGGAAATGCTTTGACACACATTCCCAAGGGAGCGTTCACGGGCCTTCACAGCCTCAAA GTGCTTATGCTGCAGAACAACCAGCTGAGACAGGTTCCGGAGGAAGCGCTACAGAAT TTGAGAAGCCTTCAATCCCTGCGCCTAGATGCCAACCACATCAGCTACGTGCCACCCA GCTGTTTCAGCGGCCTGCACTCCCTGAGGCACCTGTGGCTAGATGACAATGCTCTCAC AGACGTCCCTGTCCAGGCTTTCAGAAGTTTATCAGCCCTGCAAGACATGACCTTGGCC CTGAACAAAATACACCACATAGCAGACTACGCCTTTGGAAACCTCTCCAGCCTCGTGG TTCTGCATCTCCATAATAATAGAATCCACTCCCTGGGAAAGAAATGCTTTGATGGACTC CACAGCCTGGAGACTTTAGATTTAAATTATAATAACCTTGATGAATTCCCCACTGCAATC AAGACACTCTCCAACCTTAAGGAACTAGGATTCCACAGCAACAACATCAGGTCAATACCGGAGCGAGCGTTCGTAGGCAACCCTTCTCTTATCACAATACACTTCTATGACAACCCC ATCCAATTTGTTGGAGTATCTGCTTTTCAGCATTTGCCTGAACTAAGAACACTGACTTT GAATGGTGCCTCGCACATTACTGAATTTCCTCACTTGACAGGAACTGCCACCCTGGAG AGTCTGACTTTAACTGGAGCAAAGATCTCATCTCTTCCCCAGGCCGTCTGTGATCAGTT ACCTAATCTCCAAGTGCTAGATTTGTCTTACAACCTACTCGAAGACTTACCCAGTTTGT CAGGCTGCCAAAAACTTCAGAAAATTGACCTGAGGCATAACGAGATCTATGAAATTAA GGGCAGCACTTTTCAGCAGTTGTTTAACCTCCGATCTCTGAACTTAGCATGGAATAAAA TTGCTATCATTCACCCCAATGCGTTTTCTACGTTGCCGTCTCTAATAAAGTTGGACCTAT CATCCAATCTCCTGTCGTCCTTCCCTGTGACTGGGTTACATGGTTTAACTCACTTAAAAT TAACAGGGAACCGAGCCTTACAGAGCCTGATACCATCTGCAAACTTCCCAGAGCTCAA GATTATAGAAATGCCATCTGCTTACCAGTGTTGTGCATTTGGGGGGTGTGAGAATGTCT ATAAAATTTCTAACCAATGGAATAAAGACGACGGCAACAGTGTGGACGACCTTCATAA GAAAGACGCTGGGTTATTTCAAGTTCAAGATGAGCGGGACCTTGAAGATTTCCTACTT GACTTTGAGGAAGACCTGAAGGCCCTTCACTCGGTGCAGTGCTCGCCTTCCCCAGGTCCCTTCAAGCCCTGTGAGCACCTATTTGGTAGCTGGCTGATCCGAATCGGGGTGTGGAC CACGGCAGTACTGGCGCTTTCCTGCAATGCCTTGGTGGCTTTGACCGTGTTCAGAACT CCTCTGTACATCTCTTCCATAAAGCTGCTAATTGGGGTAATCGCGGTAGTGGACATTCTC ATGGGGGTCTCCAGTGCTGTGCTGGCTGCCGTGGATGCATTCACTTTTGGCCGTTTTGC TCAGCACGGTGCGTGGTGGGAAGACGGAATCGGCTGCCAAATCGTTGGCTTCCTGTCC ATTTTTGCTTCCGAATCGTCGATCTTCCTGCTCACTCTGGCAGCGCTGGAACGAGGTTT TTCTGTCAAGTGCTCTTCGAAGTTTGAAGTGAAAGCTCCCCTTTTTAGCCTGAGAGCG ATCGTTTTGCTATGTGTCCTGTTGGCCCTGACCATTGCCACAATCCCCTTGCTAGGAGG CAGTAAGTACAATGCCTCTCCCCTCTGCCTGCCCTTGCCCTTTGGGGAGCCCAGCACC ACGGGCTACATGGTGGCTCTCGTGTTGCTCAACTCTCTCTGTTTCCTCATAATGACCATT GCCTACACAAAGCTCTACTGCAGTTTGGAGAAAGGAGAGCTGGAGAATCTTTGGGATT GTTCGATGGTGAAGCACATTGCTCTGTTGCTCTTCGCCAACTGCATCCTTTACTGCCCC GTGGCTTTCTTATCCTTCTCCTCTTTGCTAAACCTCACCTTTATCAGTCCTGACGTCATT AAATTTATACTTCTCGTGATCGTCCCACTTCCTTCCTGTCTCAACCCACTTCTCTACATTGTCTTCAATCCCCATTTTAAGGAGGATATGGGCAGCCTGGGAAAGCATACCCGTTTCTG GATGAGATCAAAACACGCGAGTCTGCTGTCCATTAACTCGGACGATGTTGAGAAACGG TCCTGTGAGTCAACCCAAGCCTTAGTATCCTTTACCCACGCCAGCATAGCCTATGACTT GCCTTCCACTTCCGGGGCATCACCAGCTTACCCCATGACTGAAAGCTGTCATCTCTCTT CAGTTGCATTTGTCCCATGTCTCTAG

图1为G蛋白偶联受体(GPCR)和Lgr5的结构示意图，其中(A)为GPCR 的总体结构，GPCR是细胞信号转导中重要的蛋白质，是7次跨膜蛋白，(B)为 Lgr5的结构，Lgr5为GPCR中一员，含有一个信号肽，接着是17个富含亮氨酸重复(LRR)结构域，随后是7个与视紫红质样GPCR同源的螺旋TM域和C末端。

首先在类毛细胞系HEI-OC1细胞中，分别加入不同感染复数(MOI)即10、 50、100、200、400、800的Lgr5、Lgr5-C、Lgr5-190和RFP(Ctr)腺病毒转染 24h，如图2所示，通过活细胞工作站对转染后的细胞进行拍摄，最终选择合适的滴度MOI＝200,此时对细胞的转染效率较高。

确定感染复数后，后续都使用该转染复数，在类毛细胞系HEI-OC1细胞中分别加入Lgr5、Lgr5-C、Lgr5-190和RFP(Ctr)腺病毒,在转染24h后收样，通过 PI/FITC凋亡试剂盒进行染色，随后通过流式分析仪检测凋亡，如图3(A)-3 (D)，分别为加入RFP(Ctr)、Lgr5-190、Lgr5-C和Lgr5后，类毛细胞系HEI-OC1 的凋亡，从图中可以看出Lgr5-C加入会导致HEI-OC1细胞的凋亡；

为了确定Lgr5是否参与到相关信号通路NF-kB中，在类毛细胞系HEI-OC1 细胞中加入了NF-kB的抑制剂tpca，浓度为1μm，Lgr5+tpca组的凋亡率明显增加。其中为探究Lgr5具体如何参与到该通路的，使用了SRC激酶的抑制剂src, 浓度为1μm,Lgr5+src组的凋亡率明显增加，表明Lgr5是与SRC激酶结合从而影响到NF-kB信号通路，表明Lgr5对类毛细胞系的调控与NF-kB信号通路有关，并说明这是一个复杂的过程，具体如图3(E)-3(H)分别为加入NF-kB的抑制剂tpca(1um),Lgr5+tpca,SRC激酶的抑制剂src(1um)和Lgr5+src；(I)为统计图。表明Lgr5-C会导致HEI-OC1细胞发生凋亡，并且加入NF-kB的抑制剂tpca 和SRC激酶的抑制剂src会减弱凋亡率。

随后在类毛细胞系HEI-OC1细胞中分别转染腺病毒Lgr5、Lgr5-C、Lgr5-190 和RFP(Ctr)，通过免疫荧光tunel染色检测细胞凋亡，具体如图4所示，发现加入Lgr5-C后，细胞凋亡率明显增加。

对转染了腺病毒Lgr5、Lgr5-C、Lgr5-190和RFP(Ctr)的类毛细胞系HEI-OC1 细胞进行RNA提取，并逆转录为cDNA进行QPCR检测加入Lgr5-C后，细胞RNA 水平的凋亡情况，发现加入Lgr5-C后，促凋亡基因caspase8/9/12和Bax显著增加，抗凋亡基因P21和Bcl2显著降低。

所用到的相关序列如下表所示:

在类毛细胞系HEI-OC1细胞中分别转染腺病毒Lgr5、Lgr5-C、Lgr5-190和 RFP(Ctr)，通过DCFH-DA免疫荧光染色检测和流式分析活性氧ROS水平，发现加入Lgr5-C后，细胞活性氧水平升高；同时通过QPCR检测相关活性氧基因在RNA 水平选取P0-P3的Lgr5-EGFP-CreERT2/+转基因小鼠，解剖耳蜗并取出基底膜，使用0.25％的胰酶消化成单细胞，通过流式分选筛选出Lgr5阳性的支持细胞。

分别加入不同转染复数的Lgr5、Lgr5-C、Lgr5-190和RFP(Ctr)，培养5天，期间补充培养液，通过活细胞工作站拍摄荧光，选择合适的转染复数MOI＝300。

在流式分选筛选出Lgr5阳性的支持细胞中分别加入Lgr5、Lgr5-C、Lgr5-190 和RFP(Ctr)，于低粘附的96孔板中培养5天，通过活细胞工作站拍摄，并分别统计各组细胞成球的大小和数目，发现Lgr5-190组的Lgr5阳性的支持细胞的成球数目和大小均显著低于其他组。

在流式分选筛选出Lgr5阳性的支持细胞中分别加入Lgr5、Lgr5-C、Lgr5-190 和RFP(Ctr)，于低粘附的96孔板中培养5天，随后转移到提前涂好laminin的四孔皿中进行贴壁分化培养10天，通过免疫荧光结果显示，Lgr5-190组的Lgr5 阳性的支持细胞分化为毛细胞的数量明显低于其他组。

综上所述，本发明欲探究Lgr5基因的C末端对毛细胞保护作用，和N末端对内耳支持细胞分化为毛细胞的影响，从而确定Lgr5基因对毛细胞的保护和支持细胞再生为毛细胞的作用机制，为治疗耳聋提供新的理论思路，最终代替助听器和人工耳蜗帮助患者恢复和重建听觉功能。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 东南大学

<120> Lgr5基因在保护内耳毛细胞及促进支持细胞再生上的应用

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatccccatt ttaaggagga tatgggcagc ctgggaaagc atacccgttt ctggatgaga 60

tcaaaacacg cgagtctgct gtccattaac tcggacgatg ttgagaaacg gtcctgtgag 120

tcaacccaag ccttagtatc ctttacccac gccagcatag cctatgactt gccttccact 180

tccggggcat caccagctta ccccatgact gaaagctgtc atctctcttc agttgcattt 240

gtcccatgtc tctag 255

<210> 2

<211> 2724

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggacacct cctgcgtcca catgctcctg tccttgctgg cgctgctgca gttggtggcc 60

gccggcagct caccgggacc agatgcgata ccgcggggct gcccatcaca ctgtcactgt 120

gagctggatg gcaggatgct gctcagggtg gactgctcgg acctggggct ctcggagctg 180

ccctccaacc tcagcgtctt cacctcctac ctggacctca gtatgaacaa catcagtcag 240

ctacccgcca gtctcctaca tcgcctctgc ttcctagaag agttacgtct tgctggaaat 300

gctttgacac acattcccaa gggagcgttc acgggccttc acagcctcaa agtgcttatg 360

ctgcagaaca accagctgag acaggttccg gaggaagcgc tacagaattt gagaagcctt 420

caatccctgc gcctagatgc caaccacatc agctacgtgc cacccagctg tttcagcggc 480

ctgcactccc tgaggcacct gtggctagat gacaatgctc tcacagacgt ccctgtccag 540

gctttcagaa gtttatcagc cctgcaagcc atgaccttgg ccctgaacaa aatacaccac 600

atagcagact acgcctttgg aaacctctcc agcctcgtgg ttctgcatct ccataataat 660

agaatccact ccctgggaaa gaaatgcttt gatggactcc acagcctgga gactttagat 720

ttaaattata ataaccttga tgaattcccc actgcaatca agacactctc caaccttaag 780

gaactaggat tccacagcaa caacatcagg tcaataccgg agcgagcgtt cgtaggcaac 840

ccttctctta tcacaataca cttctatgac aaccccatcc aatttgttgg agtatctgct 900

tttcagcatt tgcctgaact aagaacactg actttgaatg gtgcctcgca cattactgaa 960

tttcctcact tgacaggaac tgccaccctg gagagtctga ctttaactgg agcaaagatc 1020

tcatctcttc cccaggccgt ctgtgatcag ttacctaatc tccaagtgct agatttgtct 1080

tacaacctac tcgaagactt acccagtttg tcaggctgcc aaaaacttca gaaaattgac 1140

ctgaggcata acgagatcta tgaaattaag ggcagcactt ttcagcagtt gtttaacctc 1200

cgatctctga acttagcatg gaataaaatt gctatcattc accccaatgc gttttctacg 1260

ttgccgtctc taataaagtt ggacctatca tccaatctcc tgtcgtcctt ccctgtgact 1320

gggttacatg gtttaactca cttaaaatta acagggaacc gagccttaca gagcctgata 1380

ccatctgcaa acttcccaga gctcaagatt atagaaatgc catctgctta ccagtgttgt 1440

gcatttgggg ggtgtgagaa tgtctataaa atttctaacc aatggaataa agacgacggc 1500

aacagtgtgg acgaccttca taagaaagac gctgggttat ttcaagttca agatgagcgg 1560

gaccttgaag atttcctact tgactttgag gaagacctga aggcccttca ctcggtgcag 1620

tgctcgcctt ccccaggtcc cttcaagccc tgtgagcacc tatttggtag ctggctgatc 1680

cgaatcgggg tgtggaccac ggcagtactg gcgctttcct gcaatgcctt ggtggctttg 1740

accgtgttca gaactcctct gtacatctct tccataaagc tgctaattgg ggtaatcgcg 1800

gtagtggaca ttctcatggg ggtctccagt gctgtgctgg ctgccgtgga tgcattcact 1860

tttggccgtt ttgctcagca cggtgcgtgg tgggaagacg gaatcggctg ccaaatcgtt 1920

ggcttcctgt ccatttttgc ttccgaatcg tcgatcttcc tgctcactct ggcagcgctg 1980

gaacgaggtt tttctgtcaa gtgctcttcg aagtttgaag tgaaagctcc cctttttagc 2040

ctgagagcga tcgttttgct atgtgtcctg ttggccctga ccattgccac aatccccttg 2100

ctaggaggca gtaagtacaa tgcctctccc ctctgcctgc ccttgccctt tggggagccc 2160

agcaccacgg gctacatggt ggctctcgtg ttgctcaact ctctctgttt cctcataatg 2220

accattgcct acacaaagct ctactgcagt ttggagaaag gagagctgga gaatctttgg 2280

gattgttcga tggtgaagca cattgctctg ttgctcttcg ccaactgcat cctttactgc 2340

cccgtggctt tcttatcctt ctcctctttg ctaaacctca cctttatcag tcctgacgtc 2400

attaaattta tacttctcgt gatcgtccca cttccttcct gtctcaaccc acttctctac 2460

attgtcttca atccccattt taaggaggat atgggcagcc tgggaaagca tacccgtttc 2520

tggatgagat caaaacacgc gagtctgctg tccattaact cggacgatgt tgagaaacgg 2580

tcctgtgagt caacccaagc cttagtatcc tttacccacg ccagcatagc ctatgacttg 2640

ccttccactt ccggggcatc accagcttac cccatgactg aaagctgtca tctctcttca 2700

gttgcatttg tcccatgtct ctag 2724

<210> 3

<211> 2472

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3