抗人CD271的单克隆抗体及用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗人CD271的单克隆抗体及用途。

背景技术

CD271是一种低亲和力的神经生长因子受体(LNGFR)，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，相对分子质量为75kD，又称为p75NTR，它包含3个区域：富含半胱氨酸的膜外区、跨膜区和155个氨基酸残基组成的胞内区。CD271不仅表达在神经系统，与神经细胞的发育、分化和存活密切相关，也是富集间充质干细胞比较合适的标志分子，与传统分选方法相比，具有特异性高、纯度高、集落形成能力强等优点。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，在再生医学研究中具有广泛的应用前景。间充质干细胞进行的临床试验主要包括组织损伤修复，如骨、软骨、关节损伤的修复，心脏、肝脏、脊髓损伤和神经系统疾病的治疗。但MSC用于靶向组织修复一直受到干细胞在受损部位定植、增殖的限制。因此，在组织损伤部位或者神经系统疾病相关的治疗中，清除或富集移植物中特定的细胞成为当前移植领域中最为关键的问题。CD271、CD105、CD133等作为间充质干细胞的表面标记物，可以有效分离或者富集间充质干细胞，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为软骨、肌肉、肌腱等，达到组织修复的目的。另一方面，CD271也是多种肿瘤干细胞(CSC)的标志物之一。CD271作为MSC和CSC的表面标记分子，相对于CD44、CD105等分子具有对干细胞更好的特异性，其单克隆抗体不但可用于MSC的筛选和鉴定，也能用于抗肿瘤研究，具有重要的研究和应用价值。但目前仍缺乏对间充质干细胞及肿瘤干细胞等具有广泛的识别能力的抗CD271单克隆抗体。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种抗人CD271的单克隆抗体及用途。

天然CD271的胞外结构包括4个富含半胱氨酸的CRD结构(CRD1-4)以及一个连接区域(stalk区)。在CD271表达后，CRD区域会被蛋白酶水解从而脱落，因此靶向CRD区的抗体与CD271阳性细胞的结合会受到影响，甚至在细胞代谢的某个阶段无法检测到CD271的表达。而靠近细胞膜的stalk区无糖基化、磷酸化修饰或高级空间结构，结构稳定，识别此区域的抗体理论上具有较好的通用性。因此，为了获得能够稳定识别人CD271的单克隆抗体，我们选取stalk区作为靶点开发新型的抗CD271单克隆抗体，为该领域研究提供新的工具。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明第一方面提供一种抗分泌抗人CD271单克隆抗体的杂交瘤细胞株CD271T-2，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC 21494。保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏日期为2021年1月25日。分类命名为杂交瘤细胞株CD271T-2。

本发明第二方面提供一种抗人CD271单克隆抗体，抗人CD271单克隆抗体由CD271T-2杂交瘤细胞株分泌。

所述的抗人CD271单克隆抗体与人间充质干细胞有很好的结合亲和力。

可选的，所述述抗体是鼠源性单克隆抗体，属于IgM亚型。

本发明第三方面提供一种抗人CD271的工程抗体，所述抗人CD271的工程抗体包括轻链和重链，所述轻链包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述重链包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

具体的，轻链互补决定区LCDR1，长度：10aa，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：QSVDYDGDSY。

轻链互补决定区LCDR2，长度：3aa，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：AAS。

轻链互补决定区LCDR3，长度：9aa，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：QQSNEDPFT。

重链互补决定区HCDR1，长度：10aa，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：GFSLSTSGMG。

重链互补决定区HCDR2，长度：7aa，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：IWWDDDK。

重链互补决定区HCDR3，长度：13aa，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：ARRDYGNYYAMDY。

进一步的，所述抗人CD271的工程抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；或为对SEQ ID NO.7进行一定的取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，或为对SEQ ID NO.8进行一定的取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。

具体的，SEQ ID NO.7所示序列，具体为：

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPFTFGSGTKLEIK。

SEQ ID NO.8所示序列，具体为：

QVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLKITSVDTAGTATYYCARRDYGNYYAMDYWGQGTSVTVS。

可选的，所述工程抗体可以为单克隆抗体。

可选的，所述单克隆抗体是鼠源性的。

一种实施方式中，所述单克隆抗体亚类为IgM。

可选的，所述抗体由CD271T-2杂交瘤细胞株经反转录-聚合酶链式合成反应制备产生。

本发明第四方面提供一种多核苷酸，编码前述的抗人CD271抗体的重链可变区和/或轻链可变区或全长氨基酸。

编码前述的抗人CD271抗体的重链可变区和/或轻链可变区如SEQ ID NO.9-SEQID NO.14所示。

具体的，轻链互补决定区LCDR1，DNA，长度：30bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，具体为：CAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTAT。

轻链互补决定区LCDR2，DNA，长度：9bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，具体为：GCTGCATCC。

轻链互补决定区LCDR3，DNA，长度：27bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，具体为：CAGCAAAGTAATGAGGATCCATTCACG。

重链互补决定区HCDR1，DNA，长度：30bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，具体为：GGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGT。

重链互补决定区HCDR2，DNA，长度：21bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，具体为：ATTTGGTGGGATGATGATAAG。

重链互补决定区HCDR3，DNA，长度：39bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，具体为：GCTCGAAGGGACTATGGTAACTACTATGCTATGGACTAC。

进一步的，编码前述抗人CD271抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，编码前述的抗人CD271抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

具体的，SEQ ID NO.15所示序列：

GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA。

SEQ ID NO.16所示序列：

CAAGTTACTCTAAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGAAGCCCTCACAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGGATGATGATAAGTACTATAACCCATCCCTGAAGAGCCAGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAGAAACCAGGTATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACTTACTACTGTGCTCGAAGGGACTATGGTAACTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAG。

本发明第五方面提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码前述的抗CD271抗体的Fab段的轻链可变区和重链可变区的重组序列，能够获得分子量更小的单链抗体。

本发明第五方面提供一种构建体，含有前述的多核苷酸。

所述构建体可以由所述分离的多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。

本发明中的表达载体通常指本领域熟知的各种市售表达载体，例如可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。具体可采用的表达载体包括但不限于：pET系列表达载体、pGEX系列表达载体、pcDNA系列表达载体等。

本发明的宿主细胞，所述宿主细胞含有前述的构建体或基因组中整合有外源的前述的多核苷酸。任何适用于表达载体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞，例如，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞等；或是低等真核细胞，如酵母细胞等；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞等。具体的，可以为例如，酵母、昆虫、植物等的细胞。优选的，所述宿主细胞为真核细胞，可采用不会产生抗体的哺乳动物宿主细胞系，具体可采用的细胞系包括但不限于：中国仓鼠的卵巢细胞(CHO)、幼仓鼠的肾脏细胞(BHK,ATCC CCL 10)、幼鼠的塞尔托利细胞(Sertoli cells)、猴的肾脏细胞(COS细胞)、通过SV40(COS-7,ATCC CRL 165 1)转化的猴的肾脏CVI细胞、人的胚肾细胞(HEK-293)、猴肾脏细胞(CVI，ATCC CCL-70)、非洲绿猴的肾脏细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)、人的子宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL-2)等。

合适的表达所述抗体的条件对于本领域技术人员来说应该是已知的，本领域技术人员可根据经验选择适用的培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明第六方面提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有前述的构建体或基因组中整合有外源的前述的多核苷酸。

本发明第七方面提供前述的细胞株，或前述的抗人CD271单克隆抗体，或前述的抗人CD271的工程抗体，或前述的多核苷酸，或前述的构建体，或前述的抗体的宿主细胞的用途，选自以下任一种：

a)表达CD271的细胞，所述细胞包括但不限于间充质干细胞、肿瘤干细胞、神经系统细胞，其体外的检测、鉴定、分离、富集、靶向；

b)介导间充质干细胞靶向修复组织；

c)干细胞、肿瘤干细胞、神经系统细胞的检测及示踪；

d)制备神经系统靶向药物；

e)制备肿瘤治疗药物；

f)与其他化学小分子、生物大分子、放射性分子、纳米材料等偶联，用于上述a)-e)的各类用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的由杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势。抗人CD271的工程抗体由CD271T-2杂交瘤经反转录-聚合酶链式合成反应制备产生，该抗体能特异性结合人CD271分子，在体外对于人间充质干细胞有一定的亲和力。CD271在间充质干细胞、肿瘤干细胞和神经系统相关疾病细胞表面均有表达，是介导间充质干细胞或者靶向神经系统相关细胞及肿瘤的潜在靶点。因此抗人CD271单克隆抗体是一种具有巨大潜力的医疗用抗体。

本发明的抗人CD271抗体具有高特异性和亲和力，可以将其与磁性纳米材料偶联，制备免疫磁珠来分选间充质干细胞，也可将其与其他靶点联用设计双特异性抗体，或与其他化学分子、放射性分子、多肽或蛋白、纳米材料等联合使用，用于某些组织修复疾病及神经系统或者肿瘤相关疾病的治疗。

本发明菌株保藏信息如下：

细胞株名称：杂交瘤细胞株CD271T-2；

保藏号为：CGMCC 21494；

保藏日期：2021年1月25日；

保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心；

保藏单位简称：CGMCC；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1是ELISA检测抗人CD271免疫后小鼠血清效价检测图：包被抗原为全长CD271蛋白抗原，抗原浓度为4μg/mL，上样血清从1:2000稀释到1:256000稀释，1号、2号、3号、4号、5号小鼠血清效价都在1：128000以上，5只小鼠对抗原的反应性都较高；

图2是小鼠CD271T-2腹水纯化抗体SDS-PAGE检测图：在非还原情况下，腹水抗体条带较为单一，还原情况下，在26kDa和53kDa处分别是抗体的轻链和重链；

图3是小鼠腹水纯化抗体ELISA鉴定：包被抗原为全长CD271蛋白抗原，抗原浓度为2μg/mL，每孔100μL,上样抗体浓度梯度为0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL，每孔100μL，结果表明CD271T-2抗体能够识别结合人CD271抗原；

图4是ForteBio验证纯化后抗体亲和力图谱；

图5是本发明所述抗人CD271抗体的重轻链可变区基因克隆PCR结果：图5A为CD271T-2杂交瘤的抗体重轻链可变区的基因克隆PCR结果，图5B为CD271T-2杂交瘤的抗体重轻链可变区嵌合ScFv基因克隆PCR结果；

图6是抗人CD271单克隆抗体检测间充质干细胞表面CD271的表达情况：图6A为来源于Biolegend的APC Goat anti human CD271的阳性对照抗体，免疫原来自黑色素瘤细胞，其细胞表面高表达CD271分子，此抗体与阴性对照相比有略微迁移；图6B为来源于Abcam的Rabbit anti human CD271阴性对照抗体，免疫原来自人CD271细胞膜内350-450氨基酸区域，与阳性对照相比，无任何偏移；图6C为CD271T-2腹水纯化抗体，与阳性和阴性对照相比，其偏移程度较高，说明制备的抗人CD271单克隆抗体具有非常高的亲和力和特异性，且从阳性细胞比例上优于市售的APC mouse anti human CD271对照抗体。

具体实施方式

如本文中所使用的，术语“抗体”是指，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。从一般意义上，重链可以理解为抗体中分子量较大的多肽链，轻链是指抗体中分子量较小的多肽链。轻链可分类为κ和λ轻链。重链通常可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins ofImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature342:878-883的定义。特别地，重链还可以包含3个以上CDR，例如6、9、或12个。例如在本发明的双功能抗体中，重链可以是IgG抗体的重链的C端连接另一个抗体的ScFv，这种情况下重链含有9个CDR。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

本发明所用的“CD271-T2”当跟杂交瘤细胞株一起使用时时表示细胞株；当单独使用或者跟单克隆抗体、抗体等一起时表示为本发明所述的单克隆抗体或工程抗体。

【实施例1】抗人CD271杂交瘤细胞株及单克隆抗体的制备

1.小鼠免疫

免疫抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，具体为：

EEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDN。

1)初免抗原制备：取1mL无菌EP管，将免疫原100μg用PBS稀释至100μL放于EP管中；充分摇匀弗氏完全佐剂，使沉淀的双歧杆菌均匀混合；取100μL弗氏完全佐剂加入5mL的无菌EP管，再加入稀释好的免疫原，使抗原的体积与佐剂的体积比为1：1，将离心管置于冰盒中；准备好超声破碎仪，将离心管置于冰盒中超声。超声条件是总功率200W，总时间10min，工作时间5秒，间隔时间6秒。实时观察溶液乳化的情况；用1毫升一次性注射器吸入乳化好的抗原，置于冰盒中备用。

2)二免、三免抗原制备：取1mL无菌EP管，将免疫原100μg用PBS稀释至100μL放于EP管中；充分摇匀弗氏不完全佐剂，使沉淀的双歧杆菌均匀混合；取100μL弗氏不完全佐剂加入5mL的无菌EP管，再加入稀释好的免疫原，使抗原的体积与佐剂的体积比为1：1，将离心管置于冰盒中；准备好超声破碎仪，将离心管置于冰盒中超声。超声条件是总功率200W，总时间10min，工作时间5s，间隔时间6s。实时观察溶液乳化的情况；用1毫升一次性注射器吸入乳化好的抗原，置于冰盒中备用。

3)加强免疫抗原制备：取1mL无菌EP管，将免疫原200μg用PBS稀释至400μL，用1毫升一次性注射器吸入，置于冰盒备用。

4)小鼠免疫方法

用1毫升注射器吸入免疫抗原，分2-3点，每点0.1mL左右，给小鼠进行背部(或腹部)皮下注射；三免后第三天采血进行抗体滴度ELISA检测，具体结果见图1，滴度达到1:100000时即可加强免疫。

2.饲养细胞的准备

饲养细胞可促进单个或少数分散细胞的生长繁殖。

1)准备好灭菌的手术器具和玻璃平皿，96孔板，5mL一次性注射器，300mL 70％的酒精，Balb/c小鼠若干，无血清DMEM培养液，灭菌的PBS。

2)拉颈处死Balb/c小鼠，浸入70％酒精10min。

3)拿出小鼠沥去多余的酒精，置于灭菌的玻璃平皿上。

4)剪开并分离小鼠腹部的皮肤(勿剪破肌肉层)。用5mL注射器吸取5mL DMEM无血清培养液，注入小鼠腹部，轻轻按摩并摇动小鼠身体，使巨噬细胞充分混入培养液。用注射器小心吸回培养液，放入15mL离心管。

5)按上述方法重复1-2次，以尽量多的获得巨噬细胞。

6)1500rpm，离心10min，弃上清。用培养液悬浮备，1只成年Balb/c小鼠可取约10

3.PEG介导大鼠脾脏B细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合

1)细胞：Sp2/0-Ag14，培养基：DMEM+10％FBS，融合前48小时传代，密度视48小时后覆盖瓶底80％左右为宜。

2)小鼠剪尾拉颈处死Balb/c小鼠，浸入70％酒精10min。

3)剪开左侧上腹部直至小鼠左背部，分离出脾脏，除去脾脏上的结缔组织，放入干净平皿中，加少量DMEM基础培养基(无血清)。

4)将小鼠脾脏剪成4-5小段，用5mL注射器内塞顶部研磨，边磨边加入少量DMEM，将磨出的脾脏细胞冲入平皿。

5)将平皿中的细胞全部移入15mL离心管，加入适量的DMEM基础培养基，混匀离心，200g，5min。

6)用PBS洗涤二遍，离心，200g，5min。

7)收集所有的Sp2/0-Ag14细胞，并用PBS洗涤一遍待用并计数。

8)将10

9)轻敲离心管的底部，使沉淀物充分打散。

10)将细胞放入37℃水浴，按下列方法缓慢滴入PEG。

11)用滴管沿管壁缓慢滴入1mL PEG溶液，持续时间1min，边加边轻轻振荡，100g，离心2min；

12)用同样的方法滴入4.5mL DMEM基础培养基(预热、无血清)，持续时间3min，边加边轻轻振荡；

13)用同样的方法滴入5mL DMEM基础培养基(预热、无血清)，持续时间2min，加完后轻轻振荡30s；

14)慢慢加入45mL DMEM基础培养基(预热、无血清)，

15)100g离心5min，去上清，轻敲底部。

16)加入含HAT的DMEM完全培养基(含20％FBS)，轻轻重悬，用台盼蓝进行细胞计数，100μL/孔，种入5块96孔板。

17)37℃，5％CO

18)融合后11-13天进行ELISA鉴定，并根据细胞生长情况进行测定，在测定之前的2-3天内不要换液，使上清中抗体的量充分蓄积。

4.有限稀释筛选单克隆

1)取出抗体阳性孔细胞，用HT培养液制成细胞悬液。并取样进行台盼兰染色，计数。

2)取320个细胞分散在6.4mL的HT培养液中，充分混匀后用排枪加入96孔板的第1-4列，每孔100μL，使每孔5个细胞；剩下的细胞液再加入3.2mL的HT培养液，充分混匀后，100μL每孔加入5-8列，使每孔2.5个细胞；取剩下的细胞液1mL，再加入2mL培养液，充分混匀后，100μL每孔加入9-12列，使每孔0.625个细胞。

3)将96孔板放入CO

4)第五天，显微镜下观察细胞的生长情况，记录细胞生长的孔。

5)克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3～1/2时，测培养液抗体。

6)在每孔0.625细胞的孔中选取Elisa阳性最高、生长状态良好的孔中的细胞，做下一轮有限稀释；同时选取相同情况的另一孔转移到含有饲养细胞的24孔板中的一孔扩增后冻存。

7)三轮有限稀释后将经过筛选并符合建株条件的细胞扩增培养冻存。

5.杂交瘤细胞产生小鼠腹水的制备方法

1)细胞注射7-10天之前，每只裸鼠腹腔注射0.5mL高压灭菌的降植烷(石蜡油)。

2)复苏建株细胞株培养传代，上清测ELISA，确定为阳性时，离心收集细胞，台盼蓝染色技术；按每只Balb/c 5×10

3)腹腔注射8周雌性Balb/c小鼠。

4)1-2星期左右，腹水开始出现。当动物的体型像怀孕的雌鼠时，可开始抽取腹水。用5mL注射器从腹腔的外周抽取腹水，每只约2-3mL左右。

5)将腹水3000rpm(1500g)离心10分钟，上清分装后-70℃保存。

6)保持裸鼠健康的情况下，可根据腹水产生的情况，间隔1-3天反复抽取。

【实施例2】小鼠腹水纯化鉴定及ForteBio验证纯化抗体亲和力

1.小鼠腹水Mab Select Sure

1)小鼠腹水在采集后立刻离心，上清冻存于-80℃。纯化前室温或4度解冻，离心取上清，加入1/10体积1M Tris-HCl，0.5M NaCl，pH 8.0调pH值，0.22μm过滤即为待上柱样品，取样S；

2)柱子用10CV的1M Tris-HCl，0.5M NaCl,pH 8.0平衡；

3)上样，收集所有流穿，取样FL；

4)Mab Select Sure

5)Mab Select Sure

6)收集管中预先加入0.1CV的1M Tris-HCl pH 9.0，洗脱时每次加入0.5CV的100mM NaCt/HCt pH3.0，并立即混合；洗脱Elute 1，2，3…管，分半取样制备样品。

2.纯化抗体SDS-PAGE及ELISA鉴定

1)SDS-PAGE鉴定

对纯化得到的腹水抗体CD271T-2进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，具体结果见图2。

2)ELISA鉴定

收集所有收集管的蛋白，超滤离心后测定蛋白浓度，对CD271T-1，CD271T-2进行ELISA鉴定，底物为CD271全长蛋白，一抗为小鼠腹水纯化抗体，二抗为Goat Anti MouseIgG(H+L)-HRP，具体结果见图3。

3.ForteBio验证纯化后抗体亲和力

用proA传感器固化全长抗原CD271，检测30，50，70，90，110，130nM CD271T-1，CD271T-2抗体亲和力。固化5分钟(固化高度1nm左右)结合5分钟，解离5分钟(解离拟合最前面1分钟)。再生5s，中和15s，循环三次。所有抗原抗体的稀释液为PBS，再生缓冲液为pH1.510mM甘氨酸缓冲液，平衡洗脱液为0.02％Tween PBS，中和为0.05％Tween PBS。固化物(即抗原)的浓度为10μg/mL。固化高度在1nm左右。具体参数见表1，曲线图见图4。

表1

【实施例3】抗人CD271的重轻链可变区基因克隆及嵌合抗体2的构建

1.RNA提取：采用Trizol一步法，取杂交瘤细胞CD271T-2约10

2.逆转录为cDNA(20μL)：取Oligo dT Primer(50μM)1μL，dNTP Mixture(10nM)1μL，模板RNA 5μg，加水至10μL，65℃保温5min，冰上迅速冷却；加入上述变性后反应液10μL，5x primerscript II Buffer 4μL，RNase Inhibitor(40U/μL)0.5μL，PrimeScirpt IIRTase(200U/μL)1μL，加水至20μL，42℃反应60min，70℃，15min失活；

3.PCR扩增抗CD271抗体的重轻链可变区基因：轻、重链可变区基因PCR扩增于苏州泓迅生物技术公司操作，PCR结果见图5A&5B；

4.测序载体的构建：PMD19-T载体购自takara，将重轻链可变区基因pcr产物回收，与T载体连接后，进行DH5α转化，以100μg/mL氨苄浓度筛选阳性克隆，送测序，与蛋白数据库所具有的若干保守的框架氨基酸比对。所得单克隆抗体包括轻链和重链，轻链包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述重链包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。编码轻链互补决定区LCDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；编码轻链互补决定区LCDR2的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示；编码轻链互补决定区LCDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；编码重链互补决定区HCDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；编码重链互补决定区HCDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；编码重链互补决定区HCDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

【实施例4】抗人CD271腹水抗体与Hu-MSC流式亲和表达鉴定

取适当生长良好的Hu-MSC细胞胰酶消化离心收集，用FACS(PBS+2％FBS)重悬洗涤，1000rpm，3min离心，弃上清；按表3加入一抗，室温避光孵育30min，用FACS(PBS+2％FBS)重悬洗涤，离心1000rpm，3min，重复3次，弃上清，按表1加入二抗，室温避光30min，用FACS(PBS+2％FBS)重悬洗涤，离心1000rpm，3min，重复3次，加入300μL FACS重悬细胞，流式细胞仪检测，具体结果见图6。图中表明，来源于Biolegend的APC mouse anti human CD271的阳性抗体，免疫原来自黑色素瘤细胞，其细胞表面高表达CD271分子，此抗体与阴性对照相比有略微迁移(图6A)；来源于Abcam的Rabbit anti human CD271阳性对照抗体，免疫原来自人CD271细胞膜内350-450氨基酸区域，与阴性对照相比，也无任何偏移(图6B)；CD271T-2的腹水纯化抗体与阳性和阴性对照相比，其偏移程度较高，说明制备的抗人CD271单克隆抗体具有非常高的亲和力和特异性(图6C)。

表2

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 抗人CD271的单克隆抗体及用途

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr

1 5 10

<210> 2

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Ala Ser

1

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ala Arg Arg Asp Tyr Gly Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 8

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Gly Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Gly Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser

115 120

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caaagtgttg attatgatgg tgatagttat 30

<210> 10

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gctgcatcc 9

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cagcaaagta atgaggatcc attcacg 27

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gggttttcac tgagcacttc tggtatgggt 30

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atttggtggg atgatgataa g 21

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gctcgaaggg actatggtaa ctactatgct atggactac 39

<210> 15

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60

atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180

gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccattc 300

acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaa 333

<210> 16

<211> 364

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

caagttactc taaaagagtc tggccctggg atattgaagc cctcacagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120

cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataagtac 180

tataacccat ccctgaagag ccagctcaca atctccaagg atacctccag aaaccaggta 240

ttcctcaaga tcaccagtgt ggacactgca gatactgcca cttactactg tgctcgaagg 300

gactatggta actactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360

tcag 364

<210> 17

<211> 62

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly

1 5 10 15

Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu

20 25 30

Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met

35 40 45

Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn

50 55 60