一种有机废物处理用复合菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种有机废物处理用复合菌。

背景技术

畜禽污废、餐厨垃圾等有机废物类垃圾的产生量在逐年增加，这些垃圾虽然富含大量的有机物，但由于其特殊性很难进行直接的回收利用，如果不及时处理又会滋生大量的有害生物，造成环境污染。目前对于这一类垃圾的处理方法有物理吸收法如活性炭吸收，这种方法成本高投入大，而且处理效率低；或者化学吸收法如添加过氧化钙、过氧化氢等化学物质，通过氧化、中和、加成、缩合等反应工序对垃圾进行降解处理，这种方法的试剂毒性较大，给操作人员带来较大的伤害风险；且不具有可持续性，因而长期消耗量较大；物理和化学试剂的生产过程本身也伴有废气/液的产生，总体来看并不利于环保。另外，由于其毒性成分，可以诱导环境中的细菌产生耐药，可能引发难以控制的感染。

近年来，随着微生物技术的发展，开始出现通过使是用微生物制剂对有机物垃圾进行降解的的技术，但现有的降解用微生物制剂大多降解速度较慢，菌株抗逆性差，对于高温、高盐、高酸等特殊环境的抗逆性差，处理过程中活菌数量减少速度过快，处理效果不理想。

发明内容

为解决现有技术中的问题，本发明专利公开了一种有机废物处理用复合菌，复合菌的抗逆性好，在其基础上制成的处理复合菌剂菌种增殖能力强，处理效率高。

所述复合菌包括赖氨酸芽孢杆菌Owin-1、芽孢杆菌Owin-2和赖氨酸芽孢杆菌Owin-3,所述赖氨酸芽孢杆菌Owin-1、芽孢杆菌Owin-2和赖氨酸芽孢杆菌Owin-3的有效菌数比例为3:4:3；

所述赖氨酸芽孢杆菌Owin-1分类命名为赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)Owin-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2021020，保藏日期：2021年1月21日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学；所述芽孢杆菌Owin-2分类命名为芽孢杆菌(Bacillussp.)Owin-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M 2021021，保藏日期：2021年1月21日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学；所述赖氨酸芽孢杆菌Owin-3分类命名为赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusxylanilyticus)Owin-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2021022，保藏日期：2021年1月21日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。

本发明同时公开了一种有机废物处理用复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包含100g的Na

上述有机废物处理用复合菌剂可应用于畜禽粪污、餐厨垃圾等有机垃圾的降解中。

上述有机废物处理用复合菌剂在畜禽粪污降解中的应用，是将所述复合菌剂与载体物料以1：100-1000的质量比混合构成降解堆，将降解堆与畜禽粪污混合。

进一步的，所述载体物料为秸秆、锯末、稻草、稻壳、花生壳、砻糠、麸皮、鱼粉、米糠中的任意两种以上的混合物。

本发明公开的有机废物处理用复合菌剂应用餐厨垃圾的降解是将餐厨垃圾加入到垃圾处理机中粉碎后加入复合菌剂，所述复合菌剂用量为1％-5％。

相对于现有技术，本发明专利设计的一种有机废物处理用复合菌剂的进步之处在于：利用各工作菌对于各类化合物的转化能力差异及生长曲线的特点设计的复合菌剂，相比于传统的菌剂，在复杂环境中的生存、适应能力更强，使得其在实际应用中具有显著优势。应用的复合菌剂，对有机物的降解可长时间稳定在较高水平，其对餐厨垃圾的降解率较传统产品提高10％以上，用于畜禽粪污等的处理，24小时内去除率可高达90％以上。

附图说明

图1是各菌消除尿素的时量曲线

图2是各菌消除氨的时量曲线

图3是各菌转化吲哚的时量曲线

图4是复合菌对尿素的消除率

图5是复合菌对氨水的消除率

图6是复合菌对吲哚的消除率

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，所描述的实施例仅仅是本发明创造一部分的实施例，而不是全部。基于本发明创造中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明创造保护的范围。

实施例1

1、将餐厨垃圾处理厂污泥加入玉米粉、豆粉搅拌均匀，加无菌水后于无菌环境进行细菌增值。使用无菌水进行稀释，划线涂布于选择培养基上，完成菌落的初步筛选。

然后于牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g和水1000ml构成的液体培养基，通过恒温水浴摇床培养进行耐盐性菌种筛选驯化，液体培养基中每次增加10g氯化钠至100g，每次培养条件37℃，200r/h摇床培养72小时。

将筛选的耐盐菌株接种到新的含有3g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠的液体培养基上，进行耐酸驯化，每隔12小时增加添加1ml醋酸，72小时后补充培养基，每隔12小时增加添加2ml醋酸，36小时后进行传代。筛选得到赖氨酸芽孢杆菌Owin-1，送青岛西弥斯检测技术服务有限公司进行16srDNA检测，序列如SEQ No.1所示。

SEQ.No.1：

GCCGTCCCGAAGGTTACCCCACCTACTTCTTTTGTTACACACTCCCATGGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATTCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGAACTACGAACCACTTTATGAGATCAGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCCCTTTGTATGCTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGTCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCTTTGAGTGCCCGGCCGAACGATGGCAACTAAAAGAAAAGGGTGCGCTCGTTGCGGGACTTTAACCCACATCTTCACACACGAACTGAACAACACCATGCACCACCTGTCATCGTAGCCCCCGAAGGGGAAACTATATCTCTACAGTGGTCAACGGAATGTCAAGACATGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCAAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCACTCTTGCGACCGTACTCCCCAAGCCGTCGTGCTTAATGCGTTAGCTCCAAAGCTAACGC

2、取畜禽粪污集中处理厂的腐熟粪污样品10g于三角瓶中，加入100ml生理盐水，搅拌均匀，于恒温水浴摇床中振摇30分钟，

按比例配制芽孢杆菌固体培养基,用接种环蘸取粪污样品在盛有培养基的平皿上进行划线培养；将划线的平皿倒置于37℃的培养箱中，培养72小时；升温至45℃再培养24℃；挑取平皿上的芽孢杆菌落作进一步的纯化，完成菌落的初步筛选。

制备驯化液体培养基包含牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g和水1000ml，选取长势良好的筛选菌落接种于装有液体培养基的摇瓶中，于数显恒温水浴摇床进行培养，每次升温5℃，培养24小时，至驯化到60℃培养。然后改为每次升温2℃，培养24小时，至驯化到70℃，连续传代培养7代，直至菌落生长速度与37℃时相同。待菌种进入对数生长期后，将菌种接种到新的含有3g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠的液体培养基上，70℃摇床培养，添加醋酸进行耐酸驯化，得到芽孢杆菌Owin-2，送青岛西弥斯检测技术服务有限公司进行16srDNA检测，序列如SEQ No.2所示。

SEQ.No.2：

CCGCTCCAGAAGGTTACCTTACCGACTTCTTGTGTGCATACACACTCTCAGGGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGACTACAATCCGAACTGAGAACGACTTTATCAGATTAGCTCGCTCTCGCGAGTTGGCTTCCCTTTGTATCCTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTAAATGATGGCAACTAAGAGATAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCAACACACGAGCTGAACACCACCATGCACCAACTGTCATCGTTGCCCCCGAAGGGGAAACTATATCTCTACAGTGGTCAACGGGATGTCAAAACCTGGAAAGGTTCTTCGCGTTGCTCCAAATTAAACCACATGCTCCACCGCTGGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGATTTTCACTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGGGGAGTGCTTAATGCGTTACCCGCGACACTAAGGCGCGGAAACCCCCTCACACTTACCACTCATCTTTTACGGCGTGCAATACCGGGGTATCTAATCGTGTTTGCTCCCCACGCTT

3、称取100g垃圾处理场的处理污泥，加入到1L的扩增培养基中，于恒温水浴摇床中37℃下培养扩增。

按比例配置芽孢杆菌固体培养基，并于120℃灭菌30分钟，培养基的组成包括酵母膏10g、蛋白胨10g、琼脂10g、葡萄糖10g、硫酸镁1g、氯化钠1g、氯化钙1g、磷酸钠3g。

将灭菌好的培养基铺到10个平皿中，凝固后备用；用接种环分别蘸取混合的样品，并分别在10个平皿中进行划线培养；

将划线的平皿倒置于37℃的培养箱中，培养12小时；升温至45℃再培养24℃；分别挑取平皿上的芽孢杆菌落作进一步的纯化，完成菌落的初步筛选。

制备驯化液体培养基包含牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g和水1000ml，分装多个摇瓶中，并于120℃灭菌30分钟。

选取长势良好的筛选菌落分别接种于5只装有液体培养基的摇瓶中，于45℃恒温水浴摇床中振荡培养，培养24小时；之后每24小时接种到新的5只装有液体培养基的摇瓶中，并将培养温度升高5℃，直至甚至60℃。接着继续每24小时更换一次新的培养基，并将培养温度升高2℃，直至甚至70℃。在70℃环境下，连续传代培养7代，直至菌落生长速度与37℃时相同。

制备盐含量分别为1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％的6种浓度梯度培养基，并分别分装于5个摇瓶中，并分别于120℃灭菌30分钟。将经过高温筛选的菌种分别接种于6个含盐浓度梯度的摇瓶中，分别培养24小时。分别取离心后6种浓度的菌液，无菌水重悬，进行OD值检测，随着盐含量浓度的增加OD值逐渐降低，在4％以下的盐浓度的培养基中生长很好，在8％-10％盐浓度的培养基中生长较好，在12％盐浓度的培养基中生长较差。

制备酸度分别为PH6、PH5、PH4、PH3.5、PH3的五种酸度梯度培养基，每种培养基分装于5个摇瓶中，并分别于120℃灭菌30分钟。将10％盐浓度的菌落以10％的接种量依次于5组培养基中进行接种驯化，每次培养12小时，直至菌落在酸度为PH3的培养基中达对数成长期，将菌株传代培养5代。稀释后使用接种环接种于固体培养基上进行多次划线培养，直至长出单株菌落。

菌落为革兰氏阳性，杆状，产芽孢，芽孢呈椭圆形，有运动性。菌株送青岛西弥斯检测技术服务有限公司进行16srDNA检测，提取总DNA，然后以其为模板，在原核生物16S rRNA基因的通用引物F27:5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′和F27:5′-AGA GTT TGA TCATGG CTC AG-3′的引导下进行16S rDNA基因的PCR扩增。扩增条件为：95℃预变性3min，55℃复性1min，72℃延伸1.5min，共30个循环，72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用胶回收试剂盒回收，所得序列如序列表SEQ No.3所示。Blast结果同源性最高的为赖氨酸芽孢杆菌，同源性为95.58％，命名为赖氨酸芽孢杆菌Owin-3。

SEQ.No.3：

TGAATCCACCTTTGCGTGCGGCTGGTTCCAAAGGTTACCTTACCGACTTCTTTGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGRCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGACTACAATCCGAACTGAGAACSACTTTATSAGATTAGCTCSCTCTCGCGAGKTGGCWWCCSTTTGTATSSTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCWGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCWCCTTAGAGTGCCCRACTAAATGATGGCAACTAAAATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACAACAACCATGCGCCACCTGTCACCGTTGCCCCCGAAGGGGAAACTATATCTCTACAGTGGTCAACGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGTGCGGAGACCCCCTAACCCTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGAAC

实施例2

1、取扩增的实施例1分离筛选得到的赖氨酸芽孢杆菌Owin-1、芽孢杆菌Owin-2和赖氨酸芽孢杆菌Owin-3、将3种筛选得到的菌株按3:4:3比例混合的复合菌以及市购的有机物降解用单菌、复合菌的菌悬液，离心，菌体分别用5％葡萄糖溶液重悬，以保证体系中无其它氮元素来源。加入一定浓度的尿素、氨水、吲哚溶液后，置于37℃，220rpm摇床振摇，以相同体积的无菌体系为阴性对照。按一定时间间隔取样，用比色法测定离心所得上清中的含氮化合物含量。以5％葡萄糖溶液为空白对照。绘制含氮化合物浓度-时间曲线(时效曲线)，分析比较结果。

尿素

反应机理：尿素与PDAB反应生成柠檬黄色的对二氨基苯甲醛脲；

主要试剂：对二甲氨基苯甲醛(PDAB)溶液、硫酸；

显色时间：20min

测定波长：422nm

氨水

反应机理：铵态氮在碱性介质中与次氯酸钠作用生成靛酚蓝；

主要试剂：水杨酸、次氯酸钠溶液、氢氧化钠；

显色时间：20min

测定波长：580nm

吲哚

反应机理：吲哚与PDAB反应生成玫瑰红色的希夫氏碱；

主要试剂：PDAB的乙醇溶液、盐酸；

显色时间：90℃10min；22℃10min

测定波长：555nm

2、菌种消除尿素溶液的定量测定

将菌密度OD

3、菌种消除氨水的定量测定

将菌密度OD

3、菌种消除吲哚水溶液的定量测定

将菌密度OD

由图1、图2、图3可以看出，本申请公开的复合菌体外条件下对氨水，尿素和吲哚的综合消除能力更强，且混合菌与单一种类的工作菌相比具有综合优势，特别是其在三种物质的处理的过程中都能够进行有效的自我增殖，综合处理能力更加的持久，而市购的复合菌随着时间的推移，菌密度都存在明显的下降，自我增殖更新能力不足，持久性差。

同时检测复合菌对尿素、氨水和吲哚的转化率，检测结果如图4、图5、图6所示，从3组检测结果表明，复合菌在体外条件下对氨水、尿素、吲哚都具有很强的消除能力，相较于单菌及现有市售菌具有综合优势，能够最大限度地消除含氮化合物。

实施例3

使用实施例1分离筛选得到的3株菌种制备复合菌液体菌剂，菌剂包含100g的Na

将某工厂餐厅的餐厨垃圾收集后加入到垃圾处理机中进行粉碎，后均匀输入到两个处理槽中，将液体菌剂按体积比5％的使用量喷淋到其中的一个处理槽中，并使用市购的复合菌剂对另一处理槽使用相同的接种量进行喷淋处理，进行对比，并每1小时翻动一次，每6小时检测一次餐厨垃圾的有机质降解率，检测结果如表1所示，

表1：两组菌剂不同时间的有机质降解率(％)

经检测，本申请的复合菌剂在24小时餐厨垃圾的降解率即可达到52.3％，48小时后，餐厨垃圾的降解率可达到87.2％。而且，本实施例的复合菌剂在24小时之后依旧保持较高的降解效率，48小时降解率较现有菌剂提高了近15％，效果提升明显。

实施例4

将实施例3制得的液体复合菌剂与固体载料混合构成降解堆，固体载料包括40％的秸秆、20％的稻壳壳、30％的麸皮、10％的鱼粉。液体菌剂与固体载料的混合比例为1：500，加水充分混匀，水分含量40％左右，进行发酵处理。

将1吨左右的畜禽粪污与40m

本发明实施例制作的复合菌剂经浓缩、喷雾、真空冷冻干燥后可制成菌剂冻干粉，进行长期保存，方便运输，使用时使用水进行溶解即可。

上述内容仅为本发明创造的较佳实施例而已，不能以此限定本发明创造的实施范围，即凡是依本发明创造权利要求及发明创造说明内容所做出的简单的等效变化与修饰，皆仍属于本发明创造涵盖的范围。

序列表

<110> 江苏欧尔润生物科技有限公司

<120> 一种有机废物处理用复合菌及其应用

<141> 2021-03-08

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 617

<212> DNA

<213> Bacillus sp.

<400> 1

gccgtcccga aggttacccc acctacttct tttgttacac actcccatgg gtgtgacggg 60

cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgtggcatt ctgatccacg attactagcg 120

attccgactt catggagtcg agttgcagac tccaatccga actacgaacc actttatgag 180

atcagcttgc tctcgcgagg tcgcttccct ttgtatgctc cattgtagca cgtgtgtagc 240

cctggtcata aggggcatga tgacttgacg tcatccccac cttcctccgg tttatcaccg 300

gcagtctcct ttgagtgccc ggccgaacga tggcaactaa aagaaaaggg tgcgctcgtt 360

gcgggacttt aacccacatc ttcacacacg aactgaacaa caccatgcac cacctgtcat 420

cgtagccccc gaaggggaaa ctatatctct acagtggtca acggaatgtc aagacatggt 480

aaggttcttc gcgttgcttc aaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt 540

caattccttt gagtttcact cttgcgaccg tactccccaa gccgtcgtgc ttaatgcgtt 600

agctccaaag ctaacgc 617