基于微孔阵列芯片的便携式核酸检测仪

技术领域

本发明涉及一种高通量快速便携式核酸检测仪，集成了核酸自动提取、 等温扩增检测以及定量读取功能，可用于包括新冠病毒、疟疾等在内的多 种病原体的现场检测，能够真正实现“样本进-结果出”。基于自研的高通 量微孔阵列芯片，该便携式检测仪可以实现高通量同步检测，检测结果可 定量显示在便携仪的液晶显示屏上。

背景技术

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndromecoronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)在全球内快速爆发。公共卫生领域已经付出了巨大努力， 取得了技术进步，但从全球范围看，新冠肺炎疫情的防控工作仍是人类面 临的重大挑战。快速准确诊断COVID-19对控制病毒感染和进行早期治疗 具有重要的意义。

根据检测原理的不同，目前商用的新冠病毒检测方法主要分为两种： 基于免疫分析的血清抗体间接检测方法和基于咽拭子样本直接进行新冠 病毒核酸检测的方法。免疫检测技术例如酶联免疫吸附试验(ELISA)、免 疫荧光、以及侧流免疫测定试纸条(LFI)，是对血液中产生的新冠病毒抗体， 包括免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)。该方法检测成本低， 对检测环境和检测设备的要求不高，可实现现场的快速定性检测。然而， 由于病毒抗体的产生通常需要3～7天，因此，该方法更适合新冠肺炎的预 后检测。而基于分子诊断的核酸检测技术，包括经典的普通聚合酶链式反 应(PCR)的扩增技术和新兴的恒温扩增技术，由于其特异性好、准确度 高、灵敏度强等特点，是新冠病毒检测的金标准，在新冠肺炎的早期诊断 和疑似患者的排查中发挥了重要的作用。

然而，在进行包括新冠病毒在内的多种传染性病原体检测时，传统的 核酸检测技术需要在生物安全二级以上的实验室中，由专门的操作人员进 行。检测主要流程包括咽拭子样本的灭活、基于磁珠法的核酸样本富集提 取以及核酸扩增检测，对环境要求高、操作复杂且设备昂贵，限制了其大 规模的筛查和现场快速检测方面的应用，极大的促进了分子诊断即时检测 设备的发展。

目前，已有报道的研发或上市的分子诊断即时检测设备，例如集成了 微流控芯片和恒温扩增检测技术的核酸检测仪(CN 107043697)，其采用 微流控芯片作为检测耗材，成本高，且只能进行单通量检测；或是移动“PCR 检测实验室”的便携式核酸检测箱(CN207276621)，仪器成本高昂，不适 用于偏远地区的现场快速检测。因此，能够同时集成核酸自动提取、高通 量检测和定量读取的低成本、便携式核酸检测仪，目前在国内市场上非常少，对于包括新冠病毒在内的多种病原体的现场快速检测和大规模筛查， 具有重要的意义。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提出一种基于微孔阵列芯片 的便携式核酸检测仪，能够实现高通量检测并降低成本。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于微孔阵列芯片的便携式核酸检测仪，包括：核酸提取模块、 核酸扩增模块和检测模块；其中，所述核酸扩增模块包括微孔阵列芯片放 置槽和温控组件，所述微孔阵列芯片放置槽用于放置微孔阵列芯片，所述 温控组件位于所述微孔阵列芯片放置槽的下方。

在一些实施例中，所述微孔阵列芯片中微孔上直径小于微孔下直径。

在一些实施例中，所述微孔阵列芯片的厚度为2cm～5cm(例如2.5mm、 3.0mm、3.5mm、4.0mm或4.5mm)。

在一些实施例中，所述微孔上直径为500μm～2mm(例如800μm、 1.0mm、1.2mm、1.5mm或1.8mm)，所述微孔下直径为1mm～5mm(例 如1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或4.5mm)。

在一些实施例中，加样后，所述微孔阵列芯片利用封口膜封闭。

在一些实施例中，所述检测模块包括图像采集单元，所述图像采集单 元位于所述微孔阵列芯片的上方。

在一些实施例中，所述便携式核酸检测仪包括上盖，所述图像采集单 元设置在所述上盖的内侧。

在一些实施例中，所述检测模块还包括显示屏，用于检测核酸检测结 果。

在一些实施例中，所述核酸扩增模块采用环介导等温扩增技术进行核 酸扩增。

在一些实施例中，所述便携式核酸检测仪还包括样本保存模块，用于 放置待测样本。

与现有技术相比，本发明上述基于微孔阵列芯片的便携式核酸检测仪 的有益效果是：

(1)所述的便携式核酸检测仪及配套高通量微孔阵列芯片，可以同 时对多样本多指标的样本进行同时核酸提取处理及恒温扩增检测，且可以 在35分钟内完成样本RNA提取、磁珠富集、等温检测和数据分析，大大 缩短了检测时间；

(2)该便携式核酸检测仪，集成了全自动的核酸提取功能和检测功 能，无需其他辅助设备，便可实现现场快速检测，且对检测结果自动定量 分析，肉眼可读，对操作者无特殊专业要求。

(3)所述的便携式核酸检测仪结构简单，将样品前处理系统、微孔 阵列芯片、恒温扩增核酸检测设备集成化，减少了操作步骤，实现了核酸 提取、扩增、检测一体化，具有体积小、重量轻、携带方便的特点，是一 种高效率的高通量芯片式恒温扩增核酸检测设备。

(4)该便携式核酸检测仪和高通量微孔阵列芯片制备成本低，其中 便携式核酸检测仪的加工成本在1万元/台，而微孔阵列芯片的成本为10 元/片，大大降低了制备和检测成本。

附图说明

以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的 范围。其中：

图1为本发明实施例中便携式核酸检测仪的结构示意图；

图2为本发明实施例中便携式核酸检测仪的侧视图；

图3为本发明实施例中便携式核酸检测仪的外观；

图4为本发明实施例中便携式检测仪的电路结构示意图；

图5为本发明实施例中检测系统的最低检测限验证；

图6为本发明实施例中微孔阵列芯片和商用八连管检测时间比较。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实 施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

在本发明的说明书中，提及“一个实施例”时均意指在该实施例中描 述的具体特征、结构或者参数、步骤等至少包含在根据本发明的一个实施 例中。因而，在本发明的说明书中，若采用了诸如“根据本发明的一个实 施例”、“在一个实施例中”等用语并不用于特指在同一个实施例中，若采 用了诸如“在另外的实施例中”、“根据本发明的不同实施例”、“根据本发 明另外的实施例”等用语，也并不用于特指提及的特征只能包含在特定的 不同的实施例中。本领域的技术人员应该理解，在本发明说明书的一个或 者多个实施例中公开的各具体特征、结构或者参数、步骤等可以以任何合 适的方式组合。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术 语“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可 拆卸连接，或一体地连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相 连。对于本领域的普通技术人员而言，可以视具体情况理解上述术语在本 发明中的具体含义。

本发明的便携式核酸检测仪以环介导等温扩增技术为检测技术，结合 高通量微孔阵列芯片，设计了咽拭子样本保存模块、核酸提取模块，温控 面积小、低能耗的核酸扩增模块以及检测模块。本发明的便携式核酸检测 仪，无需其他实验室设备辅助，用户操作简单，在便携的基础上做到多指 标多样本的检测，检测结果可直接显示在液晶显示屏上，非常适合检验检 疫、现场快检等领域使用。

如图1和2所示，本发明的便携式核酸检测仪包括上盖1和主体2， 上盖1设置有检测模块，包括上盖外侧顶部的显示屏3(例如液晶显示屏) 和内侧的图像采集单元，例如摄像组件4。主体2上设置有咽拭子样本保 存模块5、核酸提取模块6和核酸扩增模块，咽拭子样本保存模块5和核 酸提取模块6位于核酸扩增模块的周围，咽拭子样本保存模块5包括多个 插槽，可放置用于保存样本的离心管等容器，基于核酸保存溶液，可以同 时保存3～16个不同的咽拭子样本。

根据本发明的一个实施例，核酸提取模块6包括多个插槽，可放置容 纳核酸裂解液的离心管等容器。核酸提取模块6还可以包括多通道移液器 7。核酸扩增模块包括微孔阵列芯片放置槽8和温控组件9，微孔阵列芯片 放置槽8用于放置进行核酸扩增的微孔阵列芯片，温控组件9位于微孔阵 列芯片放置槽8的下方，用于加热微孔阵列芯片。

在本发明的实施例中，可以采用磁珠法和数控机械手臂结合的方式实 现核酸的提取。控制数控机械手臂，移动到样本保存模块5，吸取一定量 样本，自动转移到核酸裂解液中进行裂解，吸取的样本量可以为200～1000 μL。该核酸提取模块可同时对3～16个样本进行处理。采用磁珠，对裂解 后的核酸样本进行富集。最后，自动吸取一定量的核酸裂解液，转移到微 孔阵列芯片中，吸取的样本量可以为5～20μL。

本发明实施例中便携式核酸检测仪的工作原理为环介导等温扩增技 术，基于核酸扩增模块的高通量微孔阵列芯片，实现3～16个样本的同时 恒温扩增检测。检测过程中，加入显色剂，显色剂包括但不限于颜色指示 和荧光反应，利用摄像组件4可以获取检测区域的彩色图像，通过与对照 区域定标，自动提取、判别颜色或荧光强度，自动分析后给出判读结果， 并最终显示在显示屏3上。

环介导等温扩增相较于普通PCR需要变温进行扩增的技术，能在等 温(60-65℃)条件下，利用链置换型DNA聚合酶对特定核酸序列在15～60 分钟内实现10

为了对新型冠状病毒等样品进行低成本、高通量的检测，本发明设计 了适用于所述便携式核酸检测仪的高通量微孔阵列芯片。

在一些实施例中，微孔阵列芯片的微孔采用激光刻蚀技术，在聚甲基 丙烯酸甲酯等材料的基片上进行刻蚀制备。微孔结构可采用锥形结构，即 微孔上直径小于微孔下直径，可以有效降低恒温扩增反应时的溶液蒸发， 降低了核酸气凝胶产生的可能性，避免出现交叉污染导致的假阳性结果。 加样结束后，在芯片上表面利用单面封口膜进行封闭，避免不同检测位点 之间的相互串扰，有效提高检测准确度。

该微孔阵列芯片的检测通量可以根据实际需求进行调整，可同时检测 3～16个样本。在微孔阵列芯片中还可设计阳性对照(P)和阴性对照(N)， 阳性对照避免“假阴性”的检测结果；阴性对照避免环境污染造成的“假阳性” 结果。

微孔体积大小根据检测的样本量和相应扩增所需试剂的体积进行设 计和调整，在一些实施例中，承载核酸检测试剂样本量为20～50μL，芯片 厚度可以为2cm～5cm(例如2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或4.5mm)， 微孔上直径可以为500μm～2mm(例如800μm、1.0mm、1.2mm、1.5mm 或1.8mm)，微孔下直径可以为1mm～5mm(例如1.5mm、2.0mm、2.5mm、 3.0mm、3.51nm、4.0mm或4.5mm)。

如图3所示，该微孔阵列芯片可以放置在便携式核酸检测仪的芯片放 置槽里，温控组件9会对微孔阵列芯片进行加热，并获取扩增检测区的图 像，主控板上的软件对图像进行自动分析并判定检测结果，显示在显示屏 3上。目前，已在华西医院开展130例临床样本测试，检测灵敏度为95.4％， 检测特异性为95.35％。

如图4所示，本发明所述便携式核酸检测仪的电路结构包括主控板、 液晶显示屏、主控电路、摄像组件、温控元件、控制电路板、电源、电机 及驱动器组件、风扇、电源接口、电源开关。所述主控电路分别与温控元 件、摄像组件、电机及驱动器组件和主控计算机连接，并由控制电路板进 行控制。所述主控计算机和电源连接，所述主控计算机与摄像组件连接。

如图3所示，在一些实施例中，本发明的便携式核酸检测仪采用翻盖 设计，其上翻盖不仅起到封闭设备、遮挡外界的灰尘和异物的作用，而且 内部装配了主控计算机，分别与电源、摄像组件连接，由四个螺丝钉密封。 摄像组件位于微孔阵列芯片上方，能够获取扩增反应区的彩色图像，并将 图像反馈给主控板，主控板上的软件对图像进行自动分析并判定检测结果， 显示在显示屏上；显示屏可以为触摸屏，用于响应操作人员的触控操作并 输出信号。

主体内部设置有多个隔板，用于摆放耗材的定位槽，包括样本保存模 块和核酸提取模块的离心管插槽，以及核酸扩增模块的微控阵列芯片放置 槽。箱体底部安装控制电路板，负责对设备的电源管理、主控板通讯、温 控组件、加热控制电路板、摄像组件、核酸提取模块的运行。温控组件用 于对微孔阵列芯片的加热和恒温控制，温度可为30℃～100℃。其他配件如 风扇用于给设备内部的器件散热；电源接口的作用是外部电源适配器通过 此接口给设备供电；电源开关用于控制整个设备开和关。

固定平台、支架、摄像组件固定架、导热板、电机架、加热管这些零 件采用铝合金材质。导热板的表面处理采用本色氧化，表面为磨砂效果， 干净均匀的细磨砂效果会提升检测图像的质量。芯片放置槽、导热板固定 架、加热膜盖板、电池压板采用聚甲醛(POM)材质，其中芯片放置槽、 导热板固定架需要采用黑色的POM材质，芯片放置槽由于外观可见，所 以其表面需要平整光滑。在一个实施例，该便携式检测仪的尺寸为 25×15×15cm。

在检测过程中，采取的咽拭子样本保存在样本保存模块，标本在56℃ 灭活处理5min。

基于便携式核酸检测仪中的扩增和检测模块对检测样本中的RNA进 行提取，具体的提取步骤为：利用数控机械手臂，自动移取800ul的样本 溶液加入含有20ul核酸裂解酶的提取液中(磁珠法)，提取核酸。设备运 行参数设定：磁珠混合1min；裂解5min；洗涤I：1min；洗涤II：1min； 核酸洗脱：3min；磁珠吸弃：1min。自动提取结束后，收集RNA，用于 后续实验。

然后将提取出的RNA作为模板添加到环介导等温扩增的反应体系中， 25μL的反应体系包含：12.5μL反应缓冲液，0.5μL染料，染料包括但不 限于显色指示和荧光指示剂，3.4μL引物以及3.4μL双蒸水。然后向控制 区域的阴性对照中加入5μL双蒸水作为阴性对照，向阳性对照中加入5μL BRAC1基因作为阳性对照；向检测区域加入5μL提取的RNA模板。采 用单面封口膜对加入反应溶液的微孔阵列芯片进行封闭，从而形成密闭的 反应腔室，将上述的微孔阵列芯片放置在60℃的热板上，使样品发生扩增 反应。摄像组件对样品产生的色彩图像或荧光图像进行拍照，并传导到主 控计算机中进行处理并分析，最后判定检测结果，检测结果可直接肉眼定 性读取，也可定量显示在液晶显示屏上。

对于微孔阵列芯片的检测通量根据检测需求进行调整，可同时检测 3-16个样本。同时，在微孔阵列芯片中加入阳性对照和阴性对照，阳性对 照采用BRAC1基因作为对照，排除环境因素对扩增反应造成的影响，确 保扩增反应正常进行，避免传统核酸检测过程中易出现的“假阴性”检测结 果；阴性对照采用双蒸水作为对照，避免环境污染造成的恒温扩增检测“假 阳性”结果，提升检测准确度。

对于环介导等温扩增反应的引物设计，分别针对新冠病毒的 ORFlab/E/N/S基因区域，根据环介导等温扩增的需求，设计六条引物， 包括上游内部引物(FIP)、上游外部引物(F3)、下游内部引物(BIP)、 下游外部引物(B3)、Loop引物(LF、LB)。并对合成的不同浓度的基因 质粒进行检测，核酸扩增反应后，阳性样本的颜色将由粉红色变为黄色， 而阴性样本的颜色依旧保持粉红色。

本发明的便携式核酸检测仪可以适用于各种商购的试剂盒，例如成都 博奥晶芯生物科技有限公司的六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒(恒温扩增 芯片法)等。

该核酸检测仪的最低检测限通过两种方式进行确定：第一种方式是采 用便携式检测仪和微孔阵列芯片，从图5(A)中可以看出，控制区域中阳性 对照发生发应，而阴性对照没有发生发应，证明在检测过程中没有出现假 阳性和假阴性结果。而从检测区域中可以看出，该套引物的检测灵敏度能 达到1000拷贝/mL，样本量为5μL；第二种方式是采用实时荧光检测， 从图5(B)中可以看出，实时荧光曲线表面，该反应体系可以对1000拷贝 /mL浓度及以上的检测目标进行扩增检测，而100拷贝/mL浓度的检测目 标没有出现明显的反应，从而判定最低检测限为1000拷贝/mL。从而证 明了该便携式核酸检测仪和微孔阵列芯片可有效用于新冠病毒的高灵敏 度检测。

同时，将同样的反应溶液和检测目标分别加入到微孔阵列芯片和商用 八连管中，分别将其放置在电热板上。如图6可以看出，对于同样的检测 浓度，微孔阵列芯片检测所需的时间明显低于商用八连管。对于不同的检 测浓度，该芯片可在25min实现扩增检测。这是由于芯片在电热板上受热 更加均匀，导致反应速度更快。

在一个实施例中，利用本发明的新型便携式核酸检测仪和微孔阵列芯 片，在四川大学华西医院进行了130例临床样本测试，样本采用咽拭子。 所有的样本已经过RT-qPCR进行检测，并初步得到了阴性、阳性结果。采 用便携式核酸检测仪和微孔阵列芯片，对上述样本进行再次检测，将检测 结果与RT-qPCR检测结果对比，如果PCR检测呈阳性，而芯片检测为阴 性，判定为假阴性结果；而PCR呈阴性，芯片检测为阳性，则判定为假 阳性结果。从表2发现该体系的检测准确度可达94.7％。同时，对临床检 测结果的灵敏度和特异性进行了计算：

灵敏度＝真实阳性结果/(真实阳性结果+假阴性结果)；

特异性＝真实阴性结果/(真实阴性结果+假阳性结果)；

其中灵敏度表征能够真实检测出阳性结果的能力，而特异性表示能够 真实检测出阴性结果的能力，计算发现我们的引物系统的灵敏度能达到 95.4％，特异性达95.35％，证明所设计的便携式核酸检测仪对新冠病毒具 有较好的检测性能。

表2. 130例临床样本测试结果

本发明用于核酸快速检测的微孔阵列芯片和便携式检测仪可根据应 用场景不同，进行相应的调整，进行不同的设计和制备。因此，本发明的 便携式核酸检测仪不仅可以在大医院应用，还可推广至其他的应用场景， 包括：

1)家用检测场景；适用于该场景的便携式核酸检测仪，可在同一芯 片上针对同一样本的新冠病毒的ORF1ab基因、N基因和E基因三个参数 进行检测；或者是可以针对三个不同样本的ORF1ab基因区域进行检测， 其检测结果直接采用肉眼进行读取，尽量控制和降低成本；

2)飞机场、火车站等人流密集场景；适用于该场景的便携式核酸检 测仪，采用高通量微孔阵列芯片，提升检测通量，实现快速高通量检测， 快速定量检测设备将配备液晶显示屏，采用定量方式，对多个样本进行结 果读取；

3)社区医院应用场景：适用于该场景的便携式核酸检测仪，将根据 社区人数，配备不同检测通量的检测微孔芯片，快速读取设备配备液晶显 示屏，进行定量结果读取，减缓大型医疗机构的就诊压力；

4)海外应用场景：针对不同国家和地区，分别提供高成本定量读取 一体机和低成本直接读取设备。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本专利所作的进一步详细说 明，不能认定本专利的具体实施只局限于这些说明。此外，上述的相关检 测试剂不仅可以适用于该便携式核酸检测仪，也同时可以适用于其他自主 开发的快速检测系统，实现疫情的现场快检。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行 了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已， 并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。