一种高效水酶的克隆技术应用方法

技术领域

本发明涉及一种克隆技术应用方法，具体为一种高效水酶的克隆技术应用方法，属于克隆技术应用方法应用技术领域。

背景技术

克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体，通常是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因的个体或种群；克隆，原意是指以幼苗或嫩枝插条，以无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物，如扦插和嫁接，译为“无性繁殖”，“复制”，“转殖”或“群殖”，中文也有更加确切的词表达克隆，“无性繁殖”、“无性系化”以及“纯系化”，克隆，是指通过无性生殖而产生的遗传上均一的生物群，即具有完全相同的遗传组成的一群细胞或者生物的个体，克隆在希腊语中是“小树枝叶”的意思，用以指无性增殖物，现在则指个体、细胞、基因等不同水平上的无性增殖物，个体水平：在植物的无性增殖中，植物的发芽、插条等由同一个体通过无性生殖而增长的个体群均被视为克隆。采用组织培养方法可使植物细胞培养发育成完全的个体(愈伤组织)，采用这种方法得到的具有相同基因型的个体群，也被称为克隆，现在，克隆这个词还包括单个自主遗传因子的分离与保存，细胞生物的克隆只需要营养培养基，而基因的克隆则需要某种载体复制子、特定的寄主细胞和营养培养基。

而在高效水酶的克隆过程中存在很多问题，如现有克隆操作较为复杂，影响高效水酶的克隆效果，同时不便于挑选较好水解效果的重组蛋白酶，容易影响重组蛋白酶的克隆效果，不便于使用。因此，针对上述问题提出一种高效水酶的克隆技术应用方法。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种高效水酶的克隆技术应用方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种高效水酶的克隆技术应用方法，所述克隆技术应用方法包括如下步骤：

(1)根据工业霉菌和细菌的基因组分析，挑选出不同蛋白酶和几丁质酶的基因，放置在准备容器中备用；

(2)盐析，将基因的水溶液中加入中性盐中，随着盐浓度增大而使重组酶沉淀出来，然后通过离子交换技术以及亲和层析的技术对重组酶的分离纯化；

(3)水解效果测试，将重组蛋白酶与商品化蛋白酶对虾加工废弃物进行水解比较，判断重组蛋白酶对虾加工废弃物的水效果和商品化蛋白酶对虾加工废弃物水解效果差距，工作者并筛选出水解效果好的重组酶，备用；

(4)制备线性化克隆载体，采用PCR或RT-PCR将挑选出的对基因克隆，在枯草芽孢杆菌或毕赤酵母表达系统进行异源表达，转化细胞进行培养，并进行克隆鉴定，首先经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段，RT—PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。

优选的，所述步骤(1)中的容器为避免外源核酸酶的污染，所有容器物品需要高压灭菌。

优选的，所述步骤(2)中的中性盐添加需要采用定量勺进行定量称取，所述定量勺表面干净。

优选的，所述步骤(2)中的亲和层析过程中需要采用洗涤缓冲液和洗脱缓冲液对层析柱进行洗脱，所述亲和层析一般指亲和色谱，是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法，凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分子，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离，亲和色谱可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去除或减少混合物中某一分子的含量。

优选的，所述步骤(4)中RT—PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术，首先经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段，RT—PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。

优选的，所述步骤(2)中离子交换是溶液中的离子与某种离子交换剂上的离子进行交换的作用或现象，是借助于固体离子交换剂中的离子与稀溶液中的离子进行交换，以达到提取或去除溶液中某些离子的目的，是一种属于传质分离过程的单元操作。

优选的，所述步骤(3)中需要在研究过程中考虑加酶、量料液比、温度、pH和水解时间等因素。

优选的，所述步骤(4)在克隆过程中需要加入克隆缓冲液。

优选的，所述步骤(1)中工业霉菌和细菌的基因组分析中采用离心分离过程中进行挑选出不同蛋白酶和几丁质酶的基因。

优选的，所述步骤(3)中重组蛋白酶与商品化蛋白酶定量设置，相应的所述虾加工废弃物等量设置。

本发明的有益效果是：该种高效水酶的克隆技术应用方法，操作方便，便于挑选较高水解效果的重组蛋白酶，便于对重组蛋白酶的水解效果进行对比判断，方便工作者进行重组蛋白酶的克隆，方便使用者进行操作，具有广阔的市场前景，适合推广使用。

附图说明

图1为本发明的方法流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

一种高效水酶的克隆技术应用方法，所述克隆技术应用方法包括如下步骤：

(1)根据工业霉菌和细菌的基因组分析，挑选出不同蛋白酶和几丁质酶的基因，放置在准备容器中备用；

(2)盐析，将基因的水溶液中加入中性盐中，随着盐浓度增大而使重组酶沉淀出来，然后通过离子交换技术以及亲和层析的技术对重组酶的分离纯化；

(3)水解效果测试，将重组蛋白酶与商品化蛋白酶对虾加工废弃物进行水解比较，判断重组蛋白酶对虾加工废弃物的水效果和商品化蛋白酶对虾加工废弃物水解效果差距，工作者并筛选出水解效果好的重组酶，备用；

(4)制备线性化克隆载体，采用PCR或RT-PCR将挑选出的对基因克隆，在枯草芽孢杆菌或毕赤酵母表达系统进行异源表达，转化细胞进行培养，并进行克隆鉴定。

优选的，所述步骤(1)中的容器为避免外源核酸酶的污染，所有容器物品需要高压灭菌。

优选的，所述步骤(2)中的中性盐添加需要采用定量勺进行定量称取，所述定量勺表面干净。

优选的，所述步骤(2)中的亲和层析过程中需要采用洗涤缓冲液和洗脱缓冲液对层析柱进行洗脱，所述亲和层析一般指亲和色谱，是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法，凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分子，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离，亲和色谱可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去除或减少混合物中某一分子的含量。

优选的，所述步骤(4)中RT—PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术，首先经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段，RT—PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。

优选的，所述步骤(2)中离子交换是溶液中的离子与某种离子交换剂上的离子进行交换的作用或现象，是借助于固体离子交换剂中的离子与稀溶液中的离子进行交换，以达到提取或去除溶液中某些离子的目的，是一种属于传质分离过程的单元操作。

优选的，所述步骤(3)中需要在研究过程中考虑加酶、量料液比、温度、pH和水解时间等因素。

优选的，所述步骤(4)在克隆过程中需要加入克隆缓冲液。

优选的，所述步骤(1)中工业霉菌和细菌的基因组分析中采用离心分离过程中进行挑选出不同蛋白酶和几丁质酶的基因。

优选的，所述步骤(3)中重组蛋白酶与商品化蛋白酶定量设置，相应的所述虾加工废弃物等量设置。

上述方法操作方便，便于挑选较高水解效果的重组蛋白酶，便于对重组蛋白酶的水解效果进行对比判断。

实施例二：

一种高效水酶的克隆技术应用方法，所述克隆技术应用方法包括如下步骤：

(1)根据工业霉菌和细菌的基因组分析，挑选出不同蛋白酶和几丁质酶的基因，放置在准备容器中备用；

(2)盐析，将基因的水溶液中加入中性盐中，随着盐浓度增大而使重组酶沉淀出来，然后通过离子交换技术以及亲和层析的技术对重组酶的分离纯化；

(3)水解效果测试，将重组蛋白酶与商品化蛋白酶对虾加工废弃物进行水解比较，判断重组蛋白酶对虾加工废弃物的水效果和商品化蛋白酶对虾加工废弃物水解效果差距，工作者并筛选出水解效果好的重组酶，备用；

(4)制备线性化克隆载体，采用PCR或RT-PCR将挑选出的对基因克隆，在枯草芽孢杆菌或毕赤酵母表达系统进行异源表达，转化细胞进行培养，并进行克隆鉴定。

优选的，所述步骤(1)中的容器为避免外源核酸酶的污染，所有容器物品需要高压灭菌。

优选的，所述步骤(2)中的中性盐添加需要采用定量勺进行定量称取，所述定量勺表面干净。

优选的，所述步骤(2)中的亲和层析过程中需要采用洗涤缓冲液和洗脱缓冲液对层析柱进行洗脱，所述亲和层析一般指亲和色谱，是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法，凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分子，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离，亲和色谱可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去除或减少混合物中某一分子的含量。

优选的，所述步骤(4)中RT—PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术，首先经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段，RT—PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。

优选的，所述步骤(2)中离子交换是溶液中的离子与某种离子交换剂上的离子进行交换的作用或现象，是借助于固体离子交换剂中的离子与稀溶液中的离子进行交换，以达到提取或去除溶液中某些离子的目的，是一种属于传质分离过程的单元操作。

优选的，所述步骤(3)中需要在研究过程中考虑加酶、量料液比、温度、pH和水解时间等因素。

优选的，所述步骤(4)在克隆过程中需要加入克隆缓冲液。

优选的，所述步骤(1)中工业霉菌和细菌的基因组分析中采用离心分离过程中进行挑选出不同蛋白酶和几丁质酶的基因。

优选的，所述步骤(3)中重组蛋白酶与商品化蛋白酶定量设置，相应的所述虾加工废弃物等量设置。

上述方法操作方便，便于挑选较高水解效果的重组蛋白酶，便于对重组蛋白酶的水解效果进行对比判断，方便工作者进行重组蛋白酶的克隆，方便使用者进行操作，具有广阔的市场前景，适合推广使用。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。