AIBP在治疗或抑制血管瘤中的应用

技术领域

本发明属于生物医疗技术领域，具体涉及AIBP在治疗或抑制血管瘤中的应用。

背景技术

血管瘤（Hemangioma）是来源于血管的一种良性肿瘤，常发生于婴幼儿时期，可出现在身体的各个组织器官，包括内脏器官，常见于面部、头皮、胸部和背部皮肤。发生在皮肤的血管瘤呈亮红色，多余的血管突出在皮肤上如同一个海绵状或橡胶状隆起。婴幼儿血管瘤多数到5岁最多到10岁会自然消退，因此，一般情况下不处理，然而，如果血管瘤妨碍呼吸、视力等功能或出现破溃出血等症状，那么，就需要进行治疗。

血管瘤在临床上具有增殖期和消退期的病理特征。在增殖期，血管瘤摄的血流量迅速增加并伴有不成熟的血管形成，瘤体增长迅速，体积明显增大，从而会对周围组织器官造成压迫等症状。在消退期，血管瘤内皮趋于成熟，习惯了停止生长甚至萎缩，并自发消退。然而，约5-10%的婴幼儿血管瘤具有破坏性，会形成瘢痕、溃疡，且增殖期的血管瘤会出现破溃、出血等并发症，严重时甚至会危及生命安全。目前，婴幼儿血管瘤的治疗方法有激光手术、抗肿瘤药物治疗、激素治疗、干扰素治疗和口服普萘洛尔等。然而，由于血管瘤的发病机制目前还未研究清楚，因此在治疗方面还存在局限性，进一步研究血管瘤的发病机理，将会为血管瘤的临床治疗提供新的方案。

AIBP全名是apoA1结合蛋白，广泛表达于多种组织，类固醇生成的器官如肝脏、肾脏、乳腺、睾丸等中表达丰富。在健康人的脑脊液和尿液中也可以检测到其表达，因此，被认为是一个分泌蛋白。目前研究表明AIBP在血管生成、造血、动脉粥样硬化和炎症中发挥一定的作用。然而，AIBP在血管瘤中的作用目前还没有研究。因此，AIBP是否能够在血管瘤发挥作用是本发明所要解决的问题。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在问题或不足，本发明提供一种AIBP在治疗血管瘤中的应用。

为实现上述发明目的，本发明的实施例提供过表达AIBP在治疗或抑制血管瘤方面的应用。

本发明的实施例还提供过表达AIBP在制备治疗或抑制血管瘤药物方面的应用。

本发明的实施例还提供一种治疗或抑制血管瘤的药物，其特征在于，所述药物至少含有重组人AIBP蛋白。

具体的，重组人AIBP蛋白的剂型为药学上允许的口服剂型、注射液剂型、粉剂型、膏剂型或透皮贴型。

本发明的实施例另外还提供AIBP所制备的治疗或抑制血管瘤的药物的药效验证方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）重组人AIBP蛋白，在人血管瘤内皮细胞中，进行成管实验及损伤-愈合实验，验证AIBP抑制HemECs的迁移能力；（2）构建了AIBP过表达质粒，进而建立了AIBP稳定过表达HemECs细胞，利用这些细胞，进行了成管实验和损伤-愈合实验；（3）HemECs中稳定敲除AIBP后，损伤后愈合能力验证；（4）通过裸鼠实验，体内验证AIBP稳定过表达的HemECs细胞的成瘤能力验证。

进一步的，所述步骤（3）中，采用Crisp-cas9技术成功构建AIBP稳定敲除细胞。

进一步的，所述步骤（4），具体包括以下步骤：

（4-1）成功构建敲除AIBP及过表达AIBP的稳转血管瘤细胞株；

（4-2）取5-6周裸鼠20只，称重，统计学无差异，将裸鼠分成4组，分别注射表达缺失对照HemEC细胞（sg-vector stable cells）、AIBP敲除的HemEC细胞（sg-NAXE stablecells）和过表达对照HemEC细胞（Flag-vector stable cells）、AIBP多表达的HemEC细胞（Flag-NAXE stable cells），每组五只裸鼠；

（4-3）将肿瘤细胞按照6 ×10

（4-4）4周后，取瘤，观察大小并称重。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明寻找了治疗或抑制血管瘤的新靶点，为血管瘤病人提供一种新的治疗方法或治疗药物可能性，本发明的实施例通过验证分泌蛋白AIBP能够抑制人血管瘤内皮细胞成管和迁移，验证过表达AIBP抑制人血管瘤内皮细胞成管和迁移，验证敲除AIBP促进人血管瘤内皮细胞成管和迁移，通过建立裸鼠模型，验证AIBP显著抑制血管瘤的成瘤能力，从而，本发明通过临床血管瘤组织和血管瘤内皮细胞中，通过一系列体内外实验，证实了AIBP能强烈抑制血管瘤的发生。因此，AIBP可以治疗血管瘤，成为治疗血管瘤的新靶点，可应用性强。

附图说明

图1为本发明的实施例中重组蛋白AIBP抑制人血管瘤内皮细胞成管和迁移图；其中，图1A为血管瘤内皮细胞成管实验结果图，分泌蛋白AIBP抑制血管瘤内皮细胞HemECs的成管能力；图1B为损伤-愈合实验结果图，AIBP抑制HemECs的迁移能力。

图2为本发明的实施例中过表达AIBP抑制人血管瘤内皮细胞成管和迁移图；其中，图2A为成管实验结果图，稳转AIBP的HemECs的成管能力比对照组减弱；图2B为损伤-愈合实验结果图，稳转AIBP的HemECs的愈合能力减弱；图2C为成功构建AIBP稳转的HemECs细胞。

图3为本发明的实施例中敲除AIBP促进人血管瘤内皮细胞成管和迁移图；其中，图3A为成管实验结果图，HemECs中稳定敲除AIBP后，成管能力比对照组增强；图3B为损伤-愈合实验结果图，HemECs中稳定敲除AIBP后，损伤后愈合能力增强，HemECs中稳定敲除AIBP后，损伤后愈合能力增强；图3C为Western结果图，在HemECs中，用Crisp-cas9技术成功构建AIBP稳定敲除细胞。

图4为本发明的实施例中AIBP显著抑制血管瘤的成瘤能力图， HemECs中稳定过表达AIBP和稳定敲除AIBP，裸鼠体内成瘤实验表明AIBP抑制血管瘤的生长。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。

实施例一、实验材料

1、Matrigel购于BD bioscience公司；

2、rhAIBP购于北京义翘神州公司；

3、Heparin购于Sigma公司；

4、DMEM购于HyClone公司；

5、F12K购于Sciencell公司；

6、Phosphate Bufffered Saline（1×）购于HyClone公司；

7、Penicillin-Streptomycin Solution购于HyClone公司；

8、胎牛血清购于四季青公司。

实施例二、实验方法

1、Tube formation（成管实验）

（1）将人血管瘤内皮细胞（HemECs）种入六孔板中，3×10

（2）饥饿完成后细胞换液，将无血清培养基换成DMEM/F12K培养基,实验组加入人重组蛋白AIBP（rhAIBP）处理24个小时。

（3）取融化的matrigel，每孔50ul铺入96孔板中，放置37度培养箱孵育30分钟，待其凝固。

（4）将6孔板中的细胞液吸净，用PBS清洗后加入胰酶消化3分钟后终止消化，离心后使用新鲜DMEM /F12K完培重新悬浮细胞，并用血球计数板进行细胞计数，稀释至2.5×10

2. 损伤-愈合实验：

（1）在6孔板底部用黑色marker笔用直尺划线，每格0.5-1cm横穿过孔，每孔穿过3条线，每条黑线上下缘与划痕交叉点作为观察点。

（2）将HemECs细胞种入6孔板中，4×10

（3）取出6孔板，用200ul枪头垂直于细胞表面由一端划向另一端。

（4）用PBS洗细胞3次，去除漂浮的细胞，加入无血清培养基。

（5）放入37°C 、5%CO

3. Western blot

制胶，12%分离胶，5%浓缩胶，蛋白样品 100℃变性 5min，上样 50ug；恒压 80v 进胶，当溴酚蓝前沿刚进入分离胶后，恒压 120v 跑胶；用转移槽恒流转90min；用5%脱脂奶粉溶液在室温下封闭 2h；用含 3%牛血清蛋白的TBST 溶液稀释一抗（1:1000），与含目标蛋白的 PVDF 膜在 4℃孵育过夜；用PBS/t 浸泡膜 1 次，10min；用 TBST 浸泡液 2 次，每次10min；用 TBST 稀释辣根过氧化物酶标记的二抗（1:5000），室温孵育1.5h；用 TBST 浸泡膜 3 次，每次 10min，ECL 显色，扫描结果分析。

4. 异体移植瘤小鼠模型的构建

成功构建敲除AIBP及过表达AIBP的稳转血管瘤细胞株。

取5-6周裸鼠20只，称重，统计学无差异，将裸鼠分成sg-vector组、sg-NAXE组和Flag-vector组、Flag-NAXE组，每组五只裸鼠，将肿瘤细胞（6 ×10

AIBP作为分泌蛋白可以抑制斑马鱼和小鼠视网膜血管生成，血管瘤是婴幼儿常见肿瘤，其病理生理学机制是形成新的血管，所以，本发明提出AIBP可能在血管瘤的发生中也发挥重要作用。

为了证实该假说，本发明首先用重组人AIBP蛋白，在人血管瘤内皮细胞中进行成管实验。成管实验结果显示，相对于对照组（CTR），分泌蛋白AIBP处理组（AIBP+）的血管瘤内皮细胞HemECs的成管能力明显减弱，如图1A所示。同时，本发明检测了AIBP是否对HemECs的迁移能力是否有影响。通过损伤-愈合实验进行验证，损伤-愈合实验结果显示，相对于对照组（CTR），AIBP处理组（AIBP+）HemECs的迁移能力明显减弱，表明AIBP可以明显抑制HemECs的愈合能力，如图1B所示，这说明AIBP可能在血管瘤中发挥一定的抑制作用。

为了进一步研究AIBP在血管瘤中的作用，本发明构建了AIBP过表达质粒，进而建立了AIBP稳定过表达HemECs细胞，如图2C所示，成功构建AIBP稳转的HemECs细胞，然后利用这些细胞，进行了成管实验和损伤-愈合实验。本发明的结果显示，成管实验结果图表明，稳转AIBP（Flag-

接着，本发明利用crisp-cas9技术构建了sgAIBP质粒，并建立了AIBP稳定敲除的HemECs细胞，如图3C的Western结果图，在HemECs中，用Crisp-cas9技术成功构建AIBP稳定敲除细胞。于是，在这些细胞中进行成管实验和损伤-愈合实验。如图3A所示，HemECs中稳定敲除AIBP（sg

实施例三-实施例五的实验结果均是在体外进行，那么在体内，AIBP是否在血管瘤中也存在作用呢。

本发明分别用构建好的AIBP过表达和敲除稳定的HemECs细胞，进行了经典的裸鼠异体移植瘤模型。通过裸鼠异体移植瘤模型，通过对比图4A和图4C，结果显示AIBP稳定敲除的HemECs细胞（sgNAX

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。