一种固态大曲中尿素含量的检测方法

技术领域

本申请涉及化学检测领域，更具体涉及一种固态大曲中尿素含量的检测方法。

背景技术

白酒固态发酵过程中氨基甲酸乙酯的形成机理和调控措施是白酒领域研究热点，通过研究发酵过程酒醅中的氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)及其相关前体物质，发现尿素是EC的主要前体物质。

目前，国内外关于大曲中尿素含量的研究较少，关于尿素的检测方法主要有直接比色法，间接比色法和色谱法。直接比色法操作简便，易于实现，但容易受色素等物质影响且灵敏度较低，如二乙酰肟比色法、对二甲氨基苯甲醛比色法、邻苯二甲醛比色法、亚硝酸盐-格里斯试剂法等；间接比色法简单快速，但是检测成本高，受样品内源性物质影响较大，如酶偶联法、脲酶-波氏比色法、酶电极法、甲酚红法、邻甲酚酞络合剂法、ATP水解法等。色谱法具有选择性好，灵敏度高，准确性高等特点，运用液相色谱法检测葡萄酒、黄酒、白酒和尿液中尿素含量均取得了理想的结果。

但该研究过程研究对象主要集中在酒醅和酒中，无法解析大曲发酵过程中有氨基甲酸乙酯的生成机理。另外，对大曲等固态基质样品的前处理方法通常操作复杂，精确度较差。

发明内容

本申请的目的是提供一种能够在白酒固态发酵过程中对固态基质中的尿素进行操作简单、定量准确的检测的固态大曲中尿素含量的检测方法。

为达成上述目的，本申请所采用的技术方案如下：

在一些实施例中，本申请的检测方法，包括如下步骤：提取固态大曲样品中的尿素组分得到尿素提取液；基于尿素提取液配制得到尿素样品液；配制一系列具有浓度梯度的尿素标准液，采用高效液相色谱荧光检测法对各尿素标准液进行分析，绘制表征峰面积与尿素浓度之间关系的标准曲线；采用高效液相色谱荧光检测法对尿素样品液进行分析，并根据标准曲线确定尿素样品液中的尿素浓度。

在一些实施例中，使用提取试剂对固态大曲样品进行提取。在一些实施例中，提取试剂为水、甲醇溶液、乙腈溶液和乙醇溶液中的至少一种。在一些实施例中，提取试剂为乙醇溶液。

在一些实施例中，乙醇溶液的体积浓度在40％到100％之间。在一些实施例中，乙醇溶液的体积浓度为40％、60％、80％和100％中的至少一种。在一些实施例中，乙醇溶液的体积浓度为80％。

在一些实施例中，尿素提取液经过超声波萃取处理。在一些实施例中，超声波萃取的时间在15分钟到60分钟之间。在一些实施例中，超声波萃取的时间为15分钟、30分钟、45分钟和60分钟中的至少一种。在一些实施例中，超声波萃取的时间为45分钟。在一些实施例中，超声波萃取的温度在30℃到70℃之间。在一些实施例中，超声波萃取的温度为60℃。

在一些实施例中，尿素提取液经过净化处理。在一些实施例中，净化处理包括使用活性炭进行色素脱除处理。在一些实施例中，每2毫升的未脱色尿素提取液中加入0.1克到0.6克的活性炭进行色素脱除处理。在一些实施例中，每2毫升的未脱色尿素提取液中加入0.1克、0.2克、0.4克、0.6克中的至少一种质量的活性炭进行色素脱除处理。在一些实施例中，每2毫升的未脱色尿素提取液中加入0.2克的活性炭进行色素脱除处理。

在一些实施例中，基于尿素提取液配制得到尿素样品液，包括：在尿素提取液中加入衍生化试剂和盐酸溶液进行衍生得到尿素样品液。在一些实施例中，每1毫升所述尿素提取液，加入所述衍生化试剂的量在0.2毫升到1.0毫升之间，加入所述盐酸溶液的量在0.1毫升到0.5毫升之间。在一些实施例中，每1毫升所述尿素提取液，加入所述衍生化试剂的量为0.5毫升，加入所述盐酸溶液的量为0.1毫升。

在一些实施例中，衍生化试剂为9-羟基吨衍生试剂。在一些实施例中，衍生化试剂为以正丙醇为溶剂配制的9-羟基吨衍生试剂。

在一些实施例中，衍生化反应的时间在20分钟到120分钟之间。在一些实施例中，衍生化反应的时间为40分钟。

在一些实施例中，衍生化反应的温度在20℃到50℃之间。在一些实施例中，衍生化反应的温度为40℃。

在一些实施例中，对尿素样品液采用高效液相色谱荧光检测法进行分析的洗脱程序为梯度洗脱，洗脱程序中使用的流动相为乙酸钠溶液和乙睛溶液。

本申请一些的实施例的检测方法，能够有效地对固体大曲中的尿素进行提取，并且利用高效液相色谱荧光检测法对大曲中尿素浓度进行相对准确地定量检测。本申请采用的检测方法操作便捷、成本低，仪器分析时间短，检出界限可以低到0.024mg/kg，在尿素浓度为0.2mg/kg到20.0mg/kg的范围内检测的线性关系良好，线性相关系数为0.9997，回收率为92.9％到104.0％，相对标准偏差小于等于8.4％，精确性高。说明大曲中的痕量尿素可以利用本方法检测进行检测，且利用该检测方法可以解析白酒固态发酵过程中氨基甲酸乙酯的形成途径，从而便于更好地管控白酒品质的安全性。

附图说明

图1为实施例1的大曲中尿素含量检测的标准曲线图；

图2为实施例1的尿素样品液的高效液相色谱图；

图3为实施例2的不同乙醇浓度对提取效果的影响；

图4为实施例3的不同提取时间对提取效果的影响；

图5为实施例4的添加活性炭对样品净化处理的效果图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容的进一步限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所做的等同替换或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。

实施例1样品测定及检测方法验证

一种固态大曲中尿素含量的检测方法，包括如下步骤：

(1)试剂准备：用水和无水乙醇配制体积浓度在40％到100％(V/V)之间的乙醇水溶液，现配现用，用体积浓度在40％到100％(V/V)的乙醇水溶液为溶剂配制1000.0mg/L的尿素标准使用液，-4℃避光保存，有效期1个月。优选地，用水和无水乙醇配制80％(V/V)的乙醇水溶液，现配现用，用80％(V/V)的乙醇为溶剂配制1000.0mg/L的尿素标准液，-4℃避光保存，有效期1个月。用水配制1.5mol/L的盐酸溶液。用正丙醇为溶剂配制0.02mol/L的9-羟基吨衍生剂作为衍生化试剂，-4℃避光保存。用水配制0.02mol/L的乙酸钠溶液，过0.45μm的水系微孔滤膜后作为流动相A；配制乙睛溶液作为流动相B；实验用水可以为超纯水。

(2)固态大曲样品前处理：称取2.0g到10.0g大曲于50mL离心管中，加入5mL到25mL体积浓度为80％(V/V)的乙醇作为提取溶剂，优选地，称取5.0g固体大曲于50mL的离心管中；加入25mL的80％(V/V)乙醇水溶液作为提取溶剂；涡旋振荡2min，混匀后在30℃到70℃下超声辅助萃取30min到60min，优选地，在60℃下超声辅助萃取45min；萃取完成后离心(转速6000r/min)10min，取上清液2mL于离心管中；加入0.1g到0.6g活性炭，优选地，加入0.2g活性炭；涡旋振荡2min后经过0.45μm微孔滤膜；取过滤液1mL，在避光的条件下，依次加入0.2mL到1.0mL的衍生化试剂，0.1mL到0.5mL盐酸溶液，涡旋振荡2min后置于暗处20℃到50℃衍生20min到120min，优选地，依次加入0.5mL步骤(1)配制的9-羟基吨衍生剂、0.1mL盐酸溶液，涡旋振荡2min后置于暗处40℃衍生40min；衍生后过0.45μm微孔滤膜，将其作为尿素样品液，以备后续HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱)检测所用。

(3)高效液相色谱法定量检测固态大曲中尿素含量：采用高效液相色谱荧光检测法来定量白酒固态发酵大曲中微量尿素浓度；尿素的定性定量方法为保留时间定性，采用峰面积外标法定量。

HPLC色谱条件参数如下：

a)色谱柱选择X

b)柱温40℃；

c)进样量10μL；

d)荧光检测器激发波长213nm，发射波长308nm。

尿素检测的洗脱程序为梯度洗脱，定量检测尿素浓度的HPLC洗脱梯度见表1。

表1

(4)标准曲线的建立：用40％到100％(V/V)的乙醇水溶液为溶剂，优选地，用80％(V/V)的乙醇水溶液为溶剂，使用该溶剂将尿素标准使用液稀释成一系列梯度的尿素标准液；取上述各梯度的尿素标准液各1mL，分别向其中加入0.2mL到1.0mL衍生化试剂，0.1mL到0.5mL盐酸溶液，涡旋振荡2min后置于暗处20℃到50℃衍生20min到120min，优选地，分别向其中加入0.5mL的9-羟基吨衍生化试剂，并加入0.1mL的1.5mol/L盐酸溶液，漩涡震荡2min，然后在暗处室温下进行衍生化反应40min；衍生化反应结束后过0.45μm微孔滤膜，进入高效液相色谱分析，荧光检测法定量固态发酵大曲中的尿素含量，以峰面积为横坐标，尿素含量为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线如图1所示，从图中可以看出，尿素含量在0.2mg/kg到20.0mg/kg的浓度范围内与其峰面积呈良好的线性关系，相关系数为0.9997。

(5)大曲样品的测定：对步骤(2)配制得到的尿素样品液用高效液相色谱-荧光检测法检测，比对步骤(4)中绘制的标准曲线定量固态大曲样品中的尿素含量，大曲中尿素的色谱图见图2所示，不同发酵程度大曲的尿素定量结果见表2所示，大曲中尿素含量为7.6mg/k到14.2mg/kg，发酵前期大曲中尿素含量略高于发酵中后期大曲，发酵中期与发酵后期大曲中尿素的含量相差不大，可能是微生物的代谢及生产工艺导致。

表2

检测方法的验证：

加标回收率验证：在大曲样品中分别按照5.00mg/kg、10.00mg/kg、20.00mg/kg 3个不同添加水平进行尿素加标回收率实验，每个添加水平做3次平行实验，按照优化的方法检测尿素含量，计算平均回收率，结果如表3所示，表3示出了大曲中尿素的加标回收率(n＝3)。大曲中尿素在不同浓度下的加标回收率为92.9％到104.0％，RSD均≤8.4％，说明该方法的准确性好，可以保证检测结果的可靠性。

表3

衍生稳定性验证：将衍生结束后的大曲样品分别放置0h，6h，12h，18h，24h，测定其尿素含量，验证衍生效果的稳定性，结果如表4所示。结果表明，随存放时间的延长，衍生后样品在仪器中响应逐渐降低，其24h内衰减幅度≤6.5％，可见本方法衍生化效果稳定。

表4

精密度与重复性实验：分别配制浓度为0.5mg/L，10.0mg/L，20.0mg/L的尿素标准溶液，采用优化的前处理条件重复测定6次进行精密度实验。同时准确称取同一份大曲样品6份进行测定，验证方法的重复性，结果如表5所示，表5示出了不同尿素质量浓度下的精密度、重复性实验结果(n＝6)，测定结果相对标准偏差不大于2.5％。可见本方法测定大曲中尿素含量精密度较高，稳定性较好。

表5

本文建立了一种通过衍生化反应，利用高效液相色谱测定大曲中微量尿素含量的方法。该方法系首次运用HPLC-FLD(High Performance Liquid Chromatography-fluorescence Detector，高效液相色谱-荧光检测器)检测酿酒过程中大曲的尿素含量，通过稳定性，精密度，加标回收实验并对不同大曲中尿素含量的测定，验证了方法的可靠性和实用性。本方法在衍生后24h内反应物质稳定性好，在0.2mg/L到20.0mg/L的浓度范围内线性相关性较好，回收率在92.9％到104.0％范围内，RSD小于8.4％，适用于大曲样品中微量尿素的测定。

实施例2提取试剂的选择

尿素为极性化合物，分别选取水、甲醇、乙腈、乙醇作为提取溶剂，对比不同溶剂对提取效率的影响。准确称取5.0g大曲于50mL离心管中，分别加入25mL水、甲醇、乙腈、乙醇等溶液作为提取液，其余步骤参照实施例1。结果表明乙醇提取效果最好，进一步优化乙醇浓度。准确称取5.0g大曲于50mL离心管中，加入25mL体积浓度为40％、60％、80％、100％乙醇作为提取液溶液作为提取液，其余步骤参照实施例1，实验结果见图3，结果显示尿素提取效果随乙醇浓度的增加先上升后下降，最适合的乙醇浓度为80％(v/v)。

实施例3超声波萃取时间的选择

为提高提取效率，采用超声波辅助加速提取方式提取大曲中尿素，准确称取5.0g大曲于50mL离心管中，加入25mL 80％(V/V)的乙醇水溶液作为提取液，涡旋振荡2min，混匀后在60℃下分别超声辅助提取15min、30min、45min、60min，其余步骤参照实施例1，实验结果见图4，结果显示超声萃取45min后，溶液中尿素的含量趋于稳定，考虑到经济效益最终选择超声萃取时间为45min。

实施例4色素的脱除

大曲基质复杂，含有大量的淀粉、蛋白质、脂类、色素以及微生物代谢产物。采用80％(V/V)的乙醇提取后，大曲的提取液中仍含有大量色素、脂肪等物质，会干扰测定结果，污染检测仪器，因此样品的色素脱除、净化是前处理重要步骤，传统净化方式有固相萃取、超临界萃取、QuEChERS技术等，但要不操作复杂、稳定性差，要不就成本较高，不适合大规模测定。准确称取5.0g大曲于50mL离心管中，加入25mL 80％(V/V)的乙醇水溶液作为提取液，涡旋振荡2min，混匀后在60℃下超声辅助提取45min，提取完成后离心(转速6000r/min)10min，取上清液2mL于离心管中，溶液分别加入0g、0.1g、0.2g、0.4g、0.6g的活性炭，其余步骤参照实施例1，结果如图5所示。结果表明，随着活性炭使用量的增加，溶液的颜色逐渐变浅，活性炭加入量为0.2g时溶液微黄，增加到0.4g时，溶液已呈无色透明。将活性炭处理后的样品进行衍生化处理，并利用仪器分析。结果表明：利用0.2g活性炭处理大曲得到的色谱图峰型较好、峰面积最大，所以选取加入0.2g活性炭脱除色素。

上述实施方式仅为本申请的优选实施方式，不能以此来限定本申请保护的范围，本领域的技术人员在本申请的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本申请所要求保护的范围。