微纳生物颗粒热泳检测装置及方法

技术领域

本发明属于生物分析领域，具体涉及一种微纳生物颗粒热泳检测装置及方法。

背景技术

微纳生物颗粒如病毒、细菌、细胞外囊泡、脂蛋白等包含丰富的生物信息，其中表面蛋白和核酸等具有重要的检测价值。现有的检测手段通过检测微纳生物颗粒大小、形状、浓度、活性等，已广泛应用于血液学、免疫学、分子生物学、临床医学等学科。现有的微纳生物颗粒检测手段如流式细胞技术可以对生物颗粒进行多参数的定量分析，但是所需样本量大，需要复杂的前处理，分辨率较低，且无法满足纳米生物颗粒的检测需求。此外例如酶联免疫吸附测定，即ELISA，指将可溶性的抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合特异性进行免疫反应的定性和定量检测方法。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体)和酶标抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原起反应；用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。然而这种方案一方面对样本进行复杂前处理、分离及提纯、繁重操作步骤，需采用特殊的设备及方法；另一方面，检测方法需要采用大量的样品，往往针对血清进行癌变检测的过程不具有适应性。

热泳是指颗粒在温度梯度下的定向迁移，利用热泳技术可以快速的对微纳生物颗粒进行汇聚检测，但是这依赖于生物颗粒的性质如尺寸，表面电荷等。目前本领域中缺乏通用的微纳生物颗粒的快速富集和检测手段。

发明内容

因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种微纳生物颗粒热泳检测装置及方法。

在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：

术语“DiI”是指：1,1’-双二十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚碳菁高氯酸盐。

术语“PEG”是指：聚乙二醇。

术语“EMCCD”是指：电子倍增的电荷耦合器件相机。

术语“PSMA”是指：前列腺特异性膜抗原。

为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种微纳生物颗粒热泳检测装置，所述装置包括芯片和热泳体系；

其中，所述芯片包括自下而上依次设置的载玻片、微腔和蓝宝石片。

根据本发明第一方面的检测装置，其中，所述芯片的微腔为圆柱形微腔；

优选地，所述圆柱形微腔的直径为2～2000mm，优选为10～200mm，最优选为70mm；和/或

所述圆柱形微腔高度为10～200μm，优选为50～120μm，最优选为80μm。

根据本发明第一方面的检测装置，其中，所述热泳体系包括荧光显微镜、激光器和EMCCD。

本发明的第二方面提供了一种微纳生物颗粒热泳检测方法，所述方法包括使用第一方面所述的微纳生物颗粒热泳检测装置进行检测；

优选地，所述微纳生物颗粒选自以下一种或多种：病毒、细菌、细胞外囊泡、脂蛋白。

根据本发明第二方面的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

(1)将微纳生物颗粒与荧光标记物混合，得到荧光标记的微纳生物颗粒；优选地，所述微纳生物颗粒与荧光标记物混合后进一步包括孵育步骤；

(2)将步骤(1)中得到的荧光标记的微纳生物颗粒与PEG溶液混合得到待测溶液；

(3)将步骤(2)得到的待测溶液加入所述微纳生物颗粒热泳检测装置芯片的微腔内，盖上蓝宝石片，放置在荧光显微镜的载物台上；

(4)打开激光器照射芯片，汇聚微纳生物颗粒，汇聚前后使用EMCCD拍摄；

(5)计算汇聚前后的荧光强度值之差，得到微纳生物颗粒汇聚所得荧光强度值。

根据本发明第二方面的方法，其中，步骤(1)中，所述荧光标记物选自以下一种或多种：小分子荧光染料、荧光核酸适体、荧光标记抗体；

优选地，所述小分子荧光染料为DiI。

根据本发明第二方面的方法，其中，步骤(2)中，所述待测溶液中PEG的质量分数为6％以上，优选为6％～12％，最优选为9％。根据本发明第二方面的方法，其中，步骤(4)中，所述激光照射波长为1000～100000nm，优选为1200～20000nm，最优选为1480nm。

根据本发明第二方面的方法，其中，步骤(4)中，荧光显微镜的物镜的放大倍数为5～100倍；

EMCCD的曝光时间为2～1000ms；和/或

EMCCD的增益为10～100。

本发明的第三方面提供了一种微纳生物颗粒检测系统，所述微纳生物颗粒检测系统包括第一方面所述的微纳生物颗粒热泳检测装置。

本发明提出了一种通用的微纳生物颗粒检测装置和检测方法，不依赖于生物颗粒的性质，利用热泳将生物颗粒汇聚检测，实现微纳生物颗粒低成本、快速、灵敏的检测。

现有技术微纳粒子检测方法，依赖热泳与对流的耦合进行富集，热泳微腔内上层为载玻片、下层为蓝宝石，利用激光加热，在热泳微腔内形成上下温度梯度，引起微腔内液体对流，在微纳粒子热泳与对流平衡状态下，微纳生物粒子将汇聚于微腔温度较低的一侧，即微纳生物粒子将最终汇聚于冷端；现有技术依赖于微纳生物粒子热泳与对流的耦合平衡，因此对于不同微纳生物粒子，装置改动差异较大，且对于部分热泳性质本身较弱的微纳生物粒子，可能无法实现汇聚。

与现有技术相比，本发明专利则依赖聚乙二醇PEG热泳实现微纳生物粒子富集。本发明热泳微腔下层为载玻片，上层为蓝宝石片，体系内存在聚乙二醇PEG。利用激光照射微腔，在微腔内形成温度梯度，聚乙二醇分子快速热泳扩散，并在微腔内形成浓度梯度分布。在聚乙二醇浓度梯度作用下，微纳生物粒子反向运动，并最终在微腔内温度较高的位置实现快速富集。现有技术依赖热泳与对流的耦合，本发明不依赖对流作用，因此本发明所使用的热泳微腔上层为蓝宝石片、下层为载玻片，目的为减小上下层温差，且本发明所使用微腔高度为80μm，此高度可以进一步抑制对流的发生，实现聚乙二醇浓度梯度作用下微纳生物粒子高效汇聚。本发明依赖聚乙二醇浓度梯度作用下微纳生物粒子反向热泳，最终汇聚于微腔内热端。本发明依赖聚乙二醇浓度梯度作用下微纳生物粒子反向热泳汇聚，对微纳生物粒子自身热泳性质要求较低，可通过调节聚乙二醇浓度范围实现不同微纳生物粒子的汇聚。

本发明的方法不需要借助微纳颗粒对DNA、蛋白等生物分子进行汇聚检测，本发明专利检测对象为微纳生物粒子，仅需加入荧光标记探针。

本发明的方法可以具有但不限于以下有益效果：

本发明提出了一种通用的微纳生物颗粒检测方法，不依赖于生物颗粒的性质，利用热泳将生物颗粒汇聚检测，实现微纳生物颗粒低成本、快速、灵敏的检测。可用于多种微纳生物颗粒如病毒、细菌、细胞外囊泡、脂蛋白的快速汇聚和检测。本方法操作简单且成本很低，不依赖于微纳生物颗粒的性质，适用于不同的微纳生物颗粒汇聚检测。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1示出了本发明热泳微腔结构示意图。

图2示出了本发明所述热泳体系示意图。

图3示出了试验例1中慢病毒颗粒的汇聚图；其中，图3a为荧光检测图；图3b为荧光统计图。

图4示出了试验例2中新冠病毒颗粒随时间变化的汇聚图；其中，图4a为荧光检测图；图4b为荧光统计图。

图5示出了试验例3中细胞外囊泡的汇聚图；其中，图5a为荧光检测图；图5b为荧光统计图。

附图标记说明：

1、蓝宝石片；2、双面胶带；3、载玻片；4、热泳微腔；5、激光器；6、荧光显微镜；7、EMCCD。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

以下实施例中使用的试剂和仪器如下：试剂：

慢病毒颗粒，购自上海复百澳生物科技有限公司，

新冠病毒颗粒，购自上海复百澳生物科技有限公司，

DiI，购自美国赛默飞世尔科技公司，

PEG，购自上海阿拉丁生物科技股份有限公司，

PSMA荧光核酸适体，购自生工生物工程(上海)股份有限公司，

新冠病毒刺突蛋白荧光核酸适体，购自生工生物工程(上海)股份有限公司，

MgCl

VCaP细胞来自北京绿源伯德生物科技有限公司，VCaP细胞外囊泡经超速离心VCaP细胞培养基得到。

仪器：

荧光显微镜，购自日本尼康公司、型号TI-E。

EMCCD，购自北爱尔兰安道尔公司、型号DU-987U-CS0-#BV。

激光器，购自长春飞秒科技有限公司。

本实施例用于说明本发明的微纳生物颗粒热泳检测装置。

本发明涉及一种通用的微纳生物颗粒检测装置，包括芯片和热泳体系两个部分。

如图1所示，芯片为三层结构，底层为载玻片，厚度为1mm，中间是直径为70mm，高度为80μm的圆柱形微腔，用于放置样本进行检测，上层为蓝宝石片，厚度为1mm。将待测样本与荧光标记物以及PEG混合之后加入到微腔中。

如图2所示，本发明热泳体系包括荧光显微镜、激光器和EMCCD，本实施例用激光器采用1480nm激光器。将芯片放置在显微镜的载物台上，利用激光器照射芯片，使芯片内产生温度梯度，PEG在浓度梯度场中向冷端热泳扩散，并形成浓度梯度分布。在PEG浓度作用下，微纳生物颗粒进行反向扩散泳，并最终在热端完成微纳生物颗粒的快速富集。此时通过圈取汇聚后与汇聚前激光照射区域灰度值并作差，即可完成对微纳生物颗粒的检测。

本试验例用于说明利用微纳生物颗粒热泳检测方法，使用不同浓度PEG对DiI标记的慢病毒进行汇聚检测。

1.将滴度为1×10

2.取DiI标记的慢病毒2.75μL，分别加入质量分数为30％的PEG溶液0μL,0.5μL,1μL,1.5μL，用PBS缓冲液定容至5μL，，使得PEG终浓度分别为0％，3％，6％，9％，得到待测溶液。

3.取4μL待测液加入到芯片的微腔中，盖上蓝宝石片，将芯片放置在荧光显微镜载物台上。

4.打开激光(λ＝1480nm，长春飞秒科技有限公司)照射15min，关闭激光，汇聚前后均使用EMCCD经40倍物镜拍摄，曝光时间为50ms，增益为15。

5.利用ImageJ软件圈取汇聚后与汇聚前激光照射区域灰度值并作差，得到慢病毒汇聚所得荧光强度值。

图3示出了试验例1中慢病毒颗粒的汇聚图。可以看出，质量分数为6％与9％的PEG可以实现慢病毒颗粒的高效汇聚。

本试验例用于说明利用微纳生物颗粒热泳检测方法，使用6％PEG对荧光核酸适体标记的新冠病毒颗粒进行汇聚检测。

1.将滴度为1×10

2.取4μL待测液加入到芯片的微腔中，盖上蓝宝石片，将芯片放置在荧光显微镜载物台上。

3.汇聚前使用EMCCD经40倍物镜拍摄，曝光时间为50ms，增益为15。随后打开激光(λ＝1480nm，长春飞秒科技有限公司)照射，并在照射后2.5min、5min、10min、15min、20min分别关闭激光，使用EMCCD经40倍物镜拍摄，曝光时间为50ms，增益为15。

4.利用ImageJ软件圈取汇聚后与汇聚前激光照射区域灰度值并作差，得到新冠病毒汇聚所得荧光强度值。

图4示出了试验例2中新冠病毒颗粒的汇聚图。可以看出，随着激光照射时间增加，新冠病毒汇聚效果逐渐增强。

本试验例用于说明利用微纳生物颗粒热泳检测方法，使用不同浓度PEG对细胞外囊泡进行汇聚与检测。

1.取浓度为1×10

2.取4μL待测液加入到芯片的微腔中，盖上蓝宝石片，将芯片放置在荧光显微镜载物台上。

3.打开激光(λ＝1480nm，长春飞秒科技有限公司)照射15min，关闭激光，汇聚前后均使用EMCCD经40倍物镜拍摄，曝光时间为50ms，增益为15。

4.利用ImageJ软件圈取汇聚后与汇聚前激光照射区域灰度值并作差，得到细胞外囊泡汇聚所得荧光强度值。

图5示出了试验例3中细胞外囊泡的汇聚图。可以看出，质量分数为9％的PEG可以实现细胞外囊泡的高效汇聚。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。