HBB基因CD17突变细胞及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，具体而言，涉及一种HBB基因CD17突变细胞及其制备方法与应用。

背景技术

β-地中海贫血(β-thalassemia)是最常见的单基因遗传病，且分布范围广泛，是遍布全球的遗传性疾病之一。这种病的主要致病机制是β-珠蛋白合成障碍，β-珠蛋白表达量缺乏或严重减少，使α/β-珠蛋白链比率失衡，不能合成具有正常生物功能的血红蛋白四聚体，造成贫血。严重的β-地中海贫血患者体内无效的红细胞生成增多，出现慢性溶血性贫血，代偿性造血机制被激活，代偿性造血功能亢进，出现在骨髓以外的造血点，如肝脏或脾脏，也可以出现在具有造血潜力的任何器官组织，会增加髓外假性肿瘤形成的风险。在无效红系细胞生成的过程中，红系细胞暴露于衰老抗原如磷脂酰丝氨酸，使其容易形成血栓。地中海贫血患者常出现血小板和凝血系统异常，血液呈高凝状态，且出现相关的血管临床症状如静脉血栓和肺动脉高压等，特别是脾切除的患者。此外，无效红细胞生成导致铁吸收增加，出现由肝脏激素介导的原发性铁超负荷。或由于长期输血引起的铁沉积，可使临床表型进一步复杂化，累及多个器官系统。β-地中海贫血纯合子患者依赖于定期输血和铁螯合剂生存。一个多世纪以来，β-地中海贫血一直是研究的重点，虽然其遗传学分子机制已经得到明确的探讨，但β-地中海贫血的治疗策略在很大程度上仍然只是降低临床症状的严重性，主要治疗手段是定期输血。目前，唯一可使患者痊愈的治疗方法是造血干细胞移植。然而大多数β-地中海贫血患者无法获得人类白细胞抗原匹配的供体，且患者使其面临着严重的异体移植排斥反应，以及免疫抑制手段带来的感染性并发症的风险。

β-地中海贫血的致病基因HBB通常为单个碱基突变或几个碱基的缺失，极少发生大片段缺失，碱基突变常发生在1号外显子区，1号内含子区和2号外显子区，2号内含子区。现有的根治方案是骨髓移植，但骨髓移植存在来源范围窄、配型限制、供体不足等困难之处。因此近几十年研究者们之前致力寻找可替代骨髓移植的β-地中海贫血的治疗方法，如有研究采用携带HBB基因的过表达类型慢病毒进行HBB基因的过表达，让β-珠蛋白表达水平上升，或CRISPR-Cas9基因编辑技术加上寡核苷酸单链诱导HDR发生的方式，进行HBB基因单个突变位点或几个碱基的缺失的修复，从而达到在细胞或动物模型中让β-珠蛋白表达量上升达到缓解疾病表型的目的，但是在这些研究过程中，关于地贫细胞模型的获取主要来源是地贫病人的造血干细胞，即CD34

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的缺点和不足，提供一种相对简易可行的构建β-地中海贫血CD17 A＞T模型细胞株，为后续β-地中海贫血治疗或药物筛选提供可靠细胞实验模型的方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明的第一方面涉及制备HBB基因CD17突变细胞的方法，包括：

i)使用RNP复合体靶向切割细胞的基因组DNA的HBB基因，所述RNP复合体包括核苷酸如SEQ ID NO:1的sgRNA和Cas9蛋白；

ii)使用含有CD17 A＞T突变位点位的外源DNA与处理后的基因组DNA进行同源介导修复。

可选的，如上所述的方法，所述外源DNA通过rAAV递送至所述细胞以进行同源介导修复。

可选的，如上所述的方法，所述rAAV血清型是Ⅵ号血清型。

可选的，如上所述的方法，所述外源DNA的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示。

可选的，如上所述的方法，所述RNP复合体中，所述sgRNA与所述Cas9蛋白的摩尔比为(2～3):1。

可选的，如上所述的方法，所述sgRNA与所述Cas9蛋白以电转染的方式导入所述细胞，转染体系中比例，1nmol Cas9蛋白对应(0.5～1.5)×10

可选的，如上所述的方法，电转的条件为1500V～1700V，8ms～12ms，2pulse～4pulse。

可选的，如上所述的方法，所述细胞为红系细胞。

可选的，如上所述的方法，所述细胞为HUDEP-2细胞。

本发明的第二方面涉及如上方法制备得到的HBB基因CD17突变细胞。

本发明的第三方面涉及如上所述的HBB基因CD17突变细胞在鉴别和/或测试药物中的用途；

所述药物用于预防和/或治疗β-地中海贫血和/或β-地中海贫血相关的并发症。

本发明的第四方面涉及组合产品，其包括核苷酸如SEQ ID NO:1的sgRNA、Cas9蛋白或编码其的核酸片段，以及含有CD17 A＞T突变位点位的外源DNA。

可选的，如上所述的组合产品，所述外源DNA包装于Ⅵ号血清型rAAV中。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明通过诱发细胞进行同源重组修复，使HBB基因正常序列被突变位点替代，使HBB基因不能正常合成β-珠蛋白，构建的细胞株呈现β-地中海病人的细胞学特性，且鉴定了细胞的成熟分化能力和表达β-珠蛋白的能力；该方法构建的细胞模型不依赖于病人自体细胞，制备和培养方便，有助于疾病的临床治疗和再生医学研究。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中HBB基因1号外显区设计的sgRNA切割位点；以及rAAV的组成元件设计，包括左右同源臂及携带的CD17 A＞T突变位点；经RNP复合物对靶目标DNA序列进行切割后诱导HDR的发生能有效地使HBB基因进行突变模型的建立；

图2为本发明一个实施例中引物识别位置示意图；

图3为本发明一个实施例中2条候选sgRNA的切割效率；结果可见sgRNA1和sgRNA2都可以切割目的带，而候选的sgRNA2表现出具有最高的切割效率；

图4为本发明一个实施例中sgRNA1和sgRNA2最高打靶效率TIDE分析图；

图5为本发明一个实施例中Cas9蛋白与sgRNA电转后混合rAAV共同作用于HUDEP-2HBB

A为PCR产物的Sanger测序结果，表示成功挑选出HUDEP-2β

B为本来能发出绿色EGFP荧光的细胞群在基因编辑及HDR后，失去了EGFP基因，不能表达绿色荧光，表明HDR的成功发生；

C为RT-qPCR结果，表示HBB基因经位点突变后，分化前实验组HUDEP-2β

D进行为期8天的分化培养后通过流式细胞术检测红系细胞成熟分化表面标记物CD71/CD235a，表明经HDR修复的HDR后的HUDEP-2β

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明涉及制备HBB基因CD17突变细胞的方法，包括：

i)使用RNP复合体靶向切割细胞的基因组DNA的HBB基因，所述RNP复合体包括核苷酸如SEQ ID NO:1的sgRNA和Cas9蛋白；

ii)使用含有CD17 A＞T突变位点位的外源DNA与处理后的基因组DNA进行同源介导修复。

本发明通过诱发细胞进行同源重组修复，使HBB基因正常序列被突变位点替代，使HBB基因不能正常合成β-珠蛋白，构建的细胞株呈现β-地中海病人的细胞学特性，且鉴定了细胞的成熟分化能力和表达β-珠蛋白的能力；该方法构建的细胞模型不依赖于病人自体细胞，制备和培养方便，有助于疾病的临床治疗和再生医学研究。

如本领域技术人员所显而易见得知的，与SEQ ID NO：1所示核酸片段实质上相同的核酸片段也在本申请的保护范围内。“实质上相同的核酸片段”是指在严格条件下能够与SEQ ID NO：1所对应的靶序列杂交的核酸片段。这样的核酸片段可以相较于SEQ ID NO：1替换、增加或减少1、2、3或更多个核酸碱基或碱基类似物【例如4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、吖丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、Q核苷等】，或者是部分碱基具有某些修饰(通常这种修饰对引导序列与靶核酸的杂交是无关紧要的)，长度可以控制在18bp～35bp，优选为23bp以上。本发明中使用的“严格条件”是公知的，包括诸如在含400mM NaCl、40mM PIPES(pH6.4)和1mM EDTA的杂交液中于65℃杂交12～16小时，然后在65℃下用含0.1％SDS、和0.1％SSC的洗涤液洗涤15～60分钟。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。实质上相同的核酸片段仍然保留与靶核酸特异性结合的功能。

外源DNA可通过载体递送到所述细胞中，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用于外源DNA转移的常规的基于病毒的系统包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关和单纯疱疹病毒载体；上述病毒通常是复制缺陷的。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。在优选的实施方案中，所述外源DNA通过rAAV递送至所述细胞以进行同源介导修复。

rAAV血清型可以在rAAV1～13中选出，腺相关病毒(AAV)是一种由单链DNA组成的非病原性病毒，因其不具有包膜蛋白衣壳，不引起感染对象的强烈免疫反应，免疫原性低。从而作为一种有效且安全的基因转移载体而受到广泛关注。重组型AAV载体(RecombinantAAV vectors,rAAV)是指保留ITR组件，但将cap和rep基因替换成目的基因或片段的人工设计合成型单链AAV(single-strand AAV，ssAAV)。优选的，所述rAAV血清型是Ⅵ号血清型。Ⅵ号血清型是对于红系细胞具有最高感染效率的rAAV血清型。进一步优选的，外源DNA的大小应当适合载体的载量，优选外源DNA包装长度在4.5kb范围内。

在此基础上，利用CRISPR-Cas9技术引起正常的HBB基因发生DSB，在携带单碱基突变位点的HBB基因片段的rAAV作为donor的情况下，使正常的HBB基因与携带突变位点的HBB基因片段之间发生同源重组，达到构建地贫细胞株模型的目的。

CRISPR-Cas9是一种可以精确地破坏、插入或替换基因组中特定基因的DNA序列的基因编辑技术，成为了遗传病的生物学研究和临床治疗应用的可靠工具。通过设计特异性的向导RNA(Single guide RNA,sgRNA)，靶向结合目的DNA片段，进一步利用特异性核酸内切酶Cas9使DNA发生双链断裂(double strands break，DSB)，触发胞内DNA修复机制，出现同源介导修复(homologous directed repair，HDR)或非同源末端连接(non-homologousend joining，NHEJ)。DSB位点NHEJ引起随机的碱基插入和缺失，因此可能会导致基因敲除，引起靶向基因的阅读框发生移位或使编码蛋白的关键区域发生突变。与之相反，HDR的发生过程是当具有同源组分的DNA模板donor，接近断裂的DNA双链时，它们之间发生联会配对，碱基互补配对部分会形成一个DNA复制起始区，随着DNA复制的进行，以donor为模板进行精确的原位基因修复。而HDR的发生的前提条件是donor的存在，才能引导基因组DNA发生同源重组。

在一些实施方式中，所述外源DNA的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示。

本发明所采用的此HBB基因序列可覆盖多种HBB基因突变，此技术方法能构建多种β-地中海贫血患者突变类型细胞株。

在一些实施方式中，所述RNP复合体中，所述sgRNA与所述Cas9蛋白的摩尔比为(2～3):1，例如2.5:1

在一些实施方式中，所述sgRNA与所述Cas9蛋白以电转染的方式导入所述细胞，转染体系中比例，1nmol Cas9蛋白对应(0.5～1.5)×10

在一些实施方式中，所述sgRNA与所述Cas9蛋白以电转染的方式导入所述细胞，转染体系中比例，1nmol Cas9蛋白对应(0.7～1.2)×10

在一些实施方式中，所述sgRNA与所述Cas9蛋白以电转染的方式导入所述细胞，转染体系中比例，1nmol Cas9蛋白对应1×10

所述sgRNA与所述Cas9蛋白可以先转入细胞再组装为RNP复合体，也可以先组装为RNP复合体再转入细胞，此处不做特别限定。

在一些实施方式中，当所述sgRNA与所述Cas9蛋白可以先转入细胞再组装为RNP复合体时，其可以通过包装如载体的方式转入；在一些实施方式中，所述Cas核酸酶包含至少一个核定位信号；进一步的，其中编码所述Cas核酸酶的核苷酸片段经密码子优化以在真核细胞中表达。

在一些实施方式中，其中编码所述Cas核酸酶的核苷酸片段经密码子优化以在人细胞中表达。

密码子的优化可根据宿主的密码子偏好进行操作，其对本领域技术人员是容易的。

根据现有技术，在一些实施方式中，所述方法还包含将增强所述Cas核酸酶活性的辅助蛋白转入细胞。

在一些实施方式中，所述辅助蛋白为csx28蛋白。

在一些实施方式中，所述方法还包含将抑制所述Cas核酸酶活性的辅助蛋白转入细胞。

在一些实施方式中，所述辅助蛋白为csx27蛋白。

Cas核酸酶可以与上述辅助蛋白来自相同或不同的生物体。

在一些实施方式中，电转的条件为1500V～1700V，8ms～12ms，2pulse～4pulse。

在一些实施方式中，电转的条件为1550V～1650V，9ms～11ms，2pulse～4pulse。

在一些实施方式中，电转的条件为1600V，10ms，3pulse。

上述电转条件能够保持最优的细胞活性。

在一些实施方式中，电转采用Neon电转系统。

在一些实施方式中，所述细胞为真核细胞。

在一些实施方式中，所述细胞为非人的哺乳动物细胞。

在一些实施方案中，所述细胞非限制性地包括牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡等。

在一些实施方式中，所述细胞为人类细胞。

在一些实施方式中，所述细胞非人类的生殖细胞、受精卵或单细胞胚胎。

在一些实施方式中，所述细胞选自全能干细胞、多能干细胞以及单能干细胞中的至少一种。

在一些实施方式中，所述多能干细胞选自间充质干细胞。

在一些实施方式中，所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、胎盘间充质干细胞以及肝脏间充质干细胞中的至少一种。

在一些实施方式中，所述细胞为红系细胞；

红系细胞可以选自有核细胞，例如：红系定向祖细胞、原红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞和网织红细胞

在一些实施方式中，所述细胞为HUDEP-2细胞。

根据本发明的再一方面，还涉及如上所述方法制备得到的HBB基因CD17突变细胞。

根据本发明的再一方面，还涉及如上所述的HBB基因CD17突变细胞在鉴别和/或测试药物中的用途；

所述药物用于预防和/或治疗β-地中海贫血和/或β-地中海贫血相关的并发症。

本发明的还涉及组合产品，其包括核苷酸如SEQ ID NO:1的sgRNA、Cas9蛋白或编码其的核酸片段，以及含有CD17 A＞T突变位点位的外源DNA。

在一些实施方式中，所述外源DNA包装于如上所定义的载体中，优选Ⅵ号血清型rAAV中。

在一些实施方式中，所述sgRNA和/或编码所述Cas9蛋白的核酸片段包装于如上所述的载体中。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例

本实施例提供了一种新的技术手段：携带HBB基因1号外显子CD17 A＞T突变位点的重组腺病毒rAAV联合基因编辑技术CRISPR/Cas9对表达EGFP绿色荧光的HUDEP-2红系细胞株进行基因编辑，使HBB基因1号外显子形成CD17A＞T突变位点，β-珠蛋白表达水平下降，以达到地贫细胞株模型建立的目的。

步骤如下：

1.获取HBB基因片段上携带EGFP绿色荧光的HUDEP-2HBB

2.利用CCTop在线设计平台针对HBB基因1号外显子合适的位置设计sgRNA，gRNA序列的设计原则是5’-N(N＝20)NGG-3’，根据设计网站推荐的得分靠前的sgRNA作为候选目标，其中gRNA具体序列如下：sgRNA1，GAGGAGAAGTCTGCCGTTAC；sgRNA2，TTACTGCCCTGTGGGGCAAG(SEQ ID NO:1)；

在公司订购具有最高切割效率的sgRNA的化学修饰成熟品，通过T7E1酶切实验及TIDE平台分析sgRNA切割效率。切割效率通过如下方法进行检测：RNP复合物电转细胞24小时后，利用台盼蓝计数收取1×10

3.Donor所设计的左侧同源臂片段617bp和右侧同源臂片段569bp，CD17A＞T突变位点位于右侧同源臂，总共1186bp的DNA片段由公司(派真公司)直接化学合成。合成好后连接到含有回文重复序列(Inverted Terminal Repeat,ITR)的VB190904-1213cwg质粒载体中，该目的质粒命名为ssAAV-hHBB-5ARM.K18TAG.3ARM。rAAV6病毒包装主要在广州派真生物技术有限公司完成；

4.Cas9蛋白和经化学修饰的sgRNA组成的复合体RNP，cas9蛋白和sgRNA摩尔比为1:2.5，RNP复合物混匀后瞬时离心，室温孵育10-30min。收集1×10

5.在电转RNP复合物和感染rAAV后的第4天，采用流式细胞术将EGFP-的细胞群分选至96孔板中，进行为期2周的单克隆细胞增殖培养，增殖后的单克隆细胞提取DNA进行PCR及Sanger测序，Sanger测序是将细胞DNA进行PCR后将PCR产物送到公司进行测序。PCR产物长度为433bp，野生细胞群的PCR产物测序位点碱基类型为AA，杂合细胞群测序结果为AT，纯合突变细胞群测序结果为TT，挑取HUDEP-2βCD17/βCD17纯合细胞株进行为期8天的分化。分化前后的细胞均收取细胞进行RT-qPCR验证β-珠蛋白表达量的变化、证明HBB基因上存在βCD17/βCD17突变。其中RT-qPCR的检测基因为HBB,GAPDH作为内参。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院）

<120> HBB基因CD17突变细胞及其制备方法与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

ttactgccct gtggggcaag 20

<210> 2

<211> 1186

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

cttaccagaa ggttttaatc caaataagga gaagatatgc ttagaaccga ggtagagttt 60

tcatccattc tgtcctgtaa gtattttgca tattctggag acgcaggaag agatccatct 120

acatatccca aagctgaatt atggtagaca aaactcttcc acttttagtg catcaacttc 180

ttatttgtgt aataagaaaa ttgggaaaac gatcttcaat atgcttacca agctgtgatt 240

ccaaatatta cgtaaataca cttgcaaagg aggatgtttt tagtagcaat ttgtactgat 300

ggtatggggc caagagatat atcttagagg gagggctgag ggtttgaagt ccaactccta 360

agccagtgcc agaagagcca aggacaggta cggctgtcat cacttagacc tcaccctgtg 420

gagccacacc ctagggttgg ccaatctact cccaggagca gggagggcag gagccagggc 480

tgggcataaa agtcagggca gagccatcta ttgcttacat ttgcttctga cacaactgtg 540

ttcactagca acctcaaaca gacaccatgg tgcatctgac tcctgaagaa aaatccgcag 600

tcactgccct gtggggcgtg aacgtggatg aagttggtgg tgaggccctg ggcaggttgg 660

tatcaaggtt acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa ctgggcatgt ggagacagag 720

aagactcttg ggtttctgat aggcactgac tctctctgcc tattggtcta ttttcccacc 780

cttaggctgc tggtggtcta cccttggacc cagaggttct ttgagtcctt tggggatctg 840

tccactcctg atgctgttat gggcaaccct aaggtgaagg ctcatggcaa gaaagtgctc 900

ggtgccttta gtgatggcct ggctcacctg gacaacctca agggcacctt tgccacactg 960

agtgagctgc actgtgacaa gctgcacgtg gatcctgaga acttcagggt gagtctatgg 1020

gacgcttgat gttttctttc cccttctttt ctatggttaa gttcatgtca taggaagggg 1080

ataagtaaca gggtacagtt tagaatggga aacagacgaa tgattgcatc agtgtggaag 1140

tctcaggatc gttttagttt cttttatttg ctgttcataa caattg 1186