具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐

技术领域

本发明涉及具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐等。

背景技术

近年来，进行了大量抗体药物偶联物(Antibody Drug Conjugation:ADC)的研究开发。如其名称所示，ADC是在抗体上偶联药物(例如抗癌剂)而得的药剂，对于癌细胞等具有直接的细胞杀伤活性。作为代表性的ADC，有免疫原公司(Immunogene)和罗氏公司(Roche)共同开发的T-DM1(商品名：Kadcyla(注册商标))(非专利文献1～3)。

以T-DM1为代表的ADC从开发初期就存在其不均一性的问题。即，由于使低分子药物随机与抗体中存在70～80个左右的Lys残基反应，因此药物抗体比(Drug Antibody Ratio:DAR)和偶联位置不确定。已知通常如果是这样的随机偶联法，则DAR在0～8的范围内，产生药物的结合数不同的多种药剂。近年来，有报道称，如果改变ADC的药物的结合数和结合位置，则体内动力学和药物的释放速度、效果会发生变化。基于这些情况，对于下一代的ADC，要求控制偶联的药物的个数和位置。一般认为如果个数和位置确定，则符合期待的功效、偶联药剂的多样性、批次差异即所谓标准化(regulation)的问题得到解决(非专利文献4)。

全球都在研究抗体的位置选择性(regioselectively，区域选择性)修饰方法，但几乎全都是使用基因工程手段或酶的修饰方法。关于基因工程修饰方法，虽然可以控制位置选择性、个数选择性，但被指出存在抗体本身的表达效率下降(制备ADC时的总收率下降)等问题。此外，抗体表达体系的构建等需要较长的时间也成为问题(非专利文献5～7)。

此外，近年来报道有利用小分子探针在细胞内这样混杂的环境下对蛋白质进行化学修饰的方法。本方法在进行成像或低分子药物的重新定位方面被用于受体的鉴定等。此外，生化领域中，使用合成小分子探针的有机化学蛋白质修饰方法受到关注(非专利文献8～10)。

最近，开发出了C-CAP(亲和肽化学偶联，Chemical Conjugation by AffinityPeptide)法。本方法通过使在亲和肽(Affinity Peptide)上连接了NHS活性酯和药物的肽试剂与抗体反应的方法(即，介以含肽部分的连接体(linker)的ADC的制作方法)，成功地实现了抗体的位置选择性修饰。本方法是世界上首次通过化学合成手段用药物成功地对抗体Fc区域进行位置选择性修饰的方法，而且实际使用中也确认了良好的效果[反应时间30分钟，收率70％(D AR1的情况)，位置选择性100％]。证实了可通过加入5当量(equivalents)左右的肽试剂而将DAR控制为2，还可控制修饰位置，这方面是划时代的(专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2016/186206号。

非专利文献

非专利文献1：Reichert JM等,Nat Biotechnol 2005；23:1073-8

非专利文献2：Kubota T等,Cancer Sci 2009；100:1566-72

非专利文献3：Wu AM等,Nat Biotechnol 2005；23:1137-46

非专利文献4：Junutula JR等,Nat Biotechnol 2008；26:925-32

非专利文献5：Shen BQ等,Nat Biotechnol 2012；30:184-9

非专利文献6：Hofer T等,Biochemistry 2009；48:12047-57

非专利文献7：Liu W等,Nat Methods 2007；4:239-44

非专利文献8：S.T.Laughlin等,Science 2008；320,664

非专利文献9：A.E.Speers等,ChemBioChem 2004；5,41

非专利文献10：Y.Takaoka等,Angew.Chem.Int.Ed.2013；52,4088。

发明内容

发明所要解决的技术问题

本发明的目的在于开发可实现抗体的修饰、特别是抗体的位置选择性修饰的技术。

解决技术问题所采用的技术方案

本发明人等进行了认真研究，结果发现，具有(1)针对抗体的亲和性物质(与抗体具有亲和性的物质)、及(2)针对构成该抗体的氨基酸残基的反应性基团、以及(3)在该亲和性物质与该反应性基团之间包含切割性部分、(4)可通过在切割性部分的切割而生成在反应性基团侧具生物正交性官能团的结构单元(即，包含生物正交性官能团及反应性基团的结构单元)这样的结构性特征的、基于独创性的新的设计思想开发的化合物，可用于抗体的位置特异性修饰(例如图1-1、图1-2、图1-3、图2)。

本发明人等还发现，通过使用这样的化合物，可制备不含肽部分作为连接体且位置选择性地具有功能性物质(例如药物)的抗体(例如抗体药物偶联物(ADC))等。在ADC的临床应用上理想的是避免使用具有潜在的免疫原性且包含血中易水解的肽部分的连接体。即，本发明人等开发的方法，在全球首次能够成功地通过化学合成手段，且不使用含肽部分的连接体，用药物对抗体Fc区域进行位置选择性修饰。如果采用这样的方法，则具备如上述(1)～(4)的结构性特征的各种化合物的开发等成为可能(例如，图1-1、图1-2、图1-3、图2)。

此外，本发明人等还发现，通过使用在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽作为针对抗体的亲和性物质，可藉由N末端的谷氨酰胺残基(Q)中的氨基(-NH

此外，本发明人等还发现，为了简便且大量地制备在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽，将棒状杆菌型(coryneform)细菌用作宿主的多肽的分泌生产方法(国际公开第2013/062029号)是有用的。如果采用本发明，通过在目标多肽的N末端添加Csp成熟蛋白质的N末端三残基Gln-Glu-Thr(QET)，可获得该多肽分泌生产方法的优点，因而适合于在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽(针对抗体的亲和性物质)的制备。

即，本发明如下。

第一实施方式中，本发明提供一种具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐，以及包含该化合物或其盐的、抗体的位置选择性修饰试剂；

[1]一种具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐，其中，所述化合物以下述式(I)表示，

A-L-B-R (I)

式中，

A为针对抗体的亲和性物质，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

R为针对所述抗体的反应性基团(对所述抗体具有反应性的基团)；

并且，针对抗体的亲和性物质为在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽；

[2]根据[1]的化合物或其盐，其中，所述多肽为在N末端包含由谷氨酰胺残基(Q)-谷氨酸(E)-苏氨酸残基(T)形成的三肽(QET)的多肽；

[3]根据[1]或[2]的化合物或其盐，其中，谷氨酰胺残基被焦谷氨酰化(pyroglutamylation)；

[4]根据[1]～[3]中任一项的化合物或其盐，其中，所述多肽为具有16个以上且123个以下的氨基酸残基数的多肽；

[5]根据[1]～[3]中任一项的化合物或其盐，其中，所述多肽为具有20个以上且70个以下的氨基酸残基数的多肽；

[6]根据[1]～[5]中任一项的化合物或其盐，其中，所述多肽选自以下的(1)～(4)：

[化学式1]

Q为N末端的谷氨酰胺残基，E为谷氨酸残基，T为苏氨酸残基，实线为结合键，间隔区(sp acer)部分为由1个以上且50个以下的氨基酸残基形成的部分，针对抗体的亲和性物质为由15个以上且70个以下的氨基酸残基形成的部分；

[7]根据[6]的化合物或其盐，其中，针对抗体的亲和性多肽部分选自：蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白Z、及它们的与抗体具有亲和性的片段、以及它们的与抗体具有亲和性的突变体；

[8]根据[6]或[7]的化合物或其盐，其中，针对抗体的亲和性多肽部分包含：在(a)FNMQCQR RFYEALHDPNLNEEQRNAXIXSIRDDC(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列(2个X分别独立为选自精氨酸残基、谷氨酸残基及谷氨酰胺残基中的1个氨基酸残基)中，任一氨基酸残基被赖氨酸残基取代、且与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列；

[9]根据[6]～[8]中任一项的化合物或其盐，其中，针对抗体的亲和性多肽部分包含：在(a)FN MQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列中，任一氨基酸残基被赖氨酸残基取代、且与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列；

[10]根据[1]～[9]中任一项的化合物或其盐，其中，针对抗体的亲和性物质包含选自下述(1)～(11)中的氨基酸序列：

(1)QETNPTENLYFQQKNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(SEQ ID NO:7)；

(2)QTADNQKNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDCSQSANLLAEAQQLNDAQA PQA(SEQID NO:8)；

(3)QETKNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(SEQ ID NO:9)；

(4)QETFNKQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(SEQ ID NO:10)；

(5)QETFNMQCQRRFYEALHDPNLNKEQRNARIRSIRDDC(SEQ ID NO:22)；

(6)QETFNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC(SEQ ID NO:23)；

(7)QETMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC(SEQ ID NO:51)；

(8)QETQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC(SEQ ID NO:52)；

(9)QETCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC(SEQ ID NO:53)；

(10)QETRGNCAYHKGQLVWCTYH(SEQ ID NO:24)；及

(11)QETRGNCAYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:25)；

[11]根据[1]～[10]中任一项的化合物或其盐，其中，L为：

(i)切割性连接体，该切割性连接体是包含切割性部分的二价基团，该切割性部分具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力；或者

(ii)切割性连接体，该切割性连接体是包含切割性部分的二价基团，该切割性部分不具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力；

[12]根据[11]的化合物或其盐，其中，L为所述(i)的切割性连接体；

[13]根据[11]或[12]的化合物或其盐，其中，L为所述(i)的切割性连接体，且B为所述(b)的二价基团；

[14]根据[11]的化合物或其盐，其中，L为所述(ii)的切割性连接体，且B为所述(a)的二价基团；

[15]根据[1]～[14]中任一项的化合物或其盐，其中，所述多肽为针对单克隆抗体的Fc区域的结合性肽；

[16]根据[15]的化合物或其盐，其中，所述多肽为针对IgG的Fc区域的结合性肽；

[17]根据[1]～[16]中任一项的化合物或其盐，其中，所述亲和性物质是针对抗体的亲和性物质，所述抗体包含选自下述(A)～(C)中的任一种Fc区域蛋白质、且具有抗原结合能力：

(A)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的Fc区域蛋白质；

(B)包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中插入、添加、缺失或取代1个或数个氨基酸残基而形成的氨基酸序列的Fc区域蛋白质；或者

(C)包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列显示90％以上的同一性的氨基酸序列的Fc区域蛋白质；

[18]根据[1]～[17]中任一项的化合物或其盐，其特征在于，所述多肽可与人IgG结合；

[19]根据[1]～[18]中任一项的化合物或其盐，其中，切割性部分为可通过下述(a)～(c)中的任一种处理进行切割的部分，

(a)采用选自酸性物质、碱性物质、还原剂、氧化剂、酶中的1种以上的物质进行的处理；

(b)采用选自光的物理化学刺激进行的处理；或者

(c)在使用包含可自体分解的切割性部分的切割性连接体的情况下进行的放置；

[20]根据[1]～[19]中任一项的化合物或其盐，其中，所述切割性部分选自二硫残基、缩醛残基、缩酮残基、酯残基、氨甲酰基残基、烷氧基烷基残基、亚胺残基、叔烷基氧基氨基甲酸酯残基、硅烷残基、含有腙的残基、氨基磷酸酯残基、乌头酰基残基、三苯甲基残基、偶氮残基、邻二醇残基、硒残基、含有具有吸电子基团的芳环的残基、含有香豆素的残基、含有砜的残基、含有不饱和键的链残基、糖基残基；

[21]根据[11]～[20]中任一项的化合物或其盐，其中，所述(i)的切割性部分选自二硫残基、酯残基、缩醛残基、缩酮残基、亚胺残基、邻二醇残基；

[22]根据[11]～[20]中任一项的化合物或其盐，其中，所述(ii)的切割性部分选自酯残基、氨甲酰基残基、烷氧基烷基残基、亚胺残基、叔烷基氧基氨基甲酸酯残基、硅烷残基、含有腙的残基、氨基磷酸酯残基、乌头酰基残基、三苯甲基残基、偶氮残基、邻二醇残基、硒残基、含有具有吸电子基团的芳环的残基、含有香豆素的残基、含有砜的残基、含有不饱和键的链残基、糖基残基；

[23]根据[1]～[22]中任一项的化合物或其盐，其中，切割性部分对应于选自下述组中的任一化学结构；

[化学式2]

在此，与键正交的波浪线表示切割部位，

多个R

(i)氢原子或卤素原子，

(ii)一价烃基，

(iii)芳烷基，

(iv)一价杂环基，

(v)R

(vi)NR

J为-CH

r为1～4的任意的整数，

○(白色圆)表示与A结合的键，●(黑色圆)表示与B结合的键，

化学结构以切割部位为中心呈不对称的情况下，可以是●表示与A结合的键，○表示与B结合的键；

[24]根据[11]～[19]、[21]、[23]中任一项的化合物或其盐，其中，所述(i)的切割性部分对应于选自以下组的任一化学结构；

[化学式3]

在此，与键正交的波浪线表示切割部位，

R

○(白色圆)表示与A结合的键，●(黑色圆)表示与B结合的键，

化学结构以切割部位为中心呈不对称的情况下，可以是●表示与A结合的键，○表示与B结合的键；

[25]根据[11]～[19]、[22]、[23]中任一项的化合物或其盐，其中，所述(ii)的切割性部分对应于选自以下组的任一化学结构；

[化学式4]

在此，与键正交的波浪线表示切割部位，

R

○(白色圆)表示与A结合的键，●(黑色圆)表示与B结合的键，

化学结构以切割部位为中心呈不对称的情况下，可以是●表示与A结合的键，○表示与B结合的键；

[26]根据[1]～[25]中任一项的化合物或其盐，其中，L以下述式(L1)～(L3)中的任一个表示；La-C-Lb (L1)

La-C (L2)

C-Lb (L3)

式中，

La和Lb分别为二价基团，

C为切割性部分；

[27]根据[26]的化合物或其盐，其中，所述La和Lb分别以下述(La')和(Lb')表示；

[化学式5]

式中，

p和p'相同或不同，为0～10的任意的整数，

q和q'相同或不同，为0～10的任意的整数，

X和X'相同或不同，为碳原子、氮原子或单键(在此，X为氮原子的情况下，R

R

[28]根据[1]～[27]中任一项的化合物或其盐，其中，包含生物正交性官能团的二价基团为：在主链中包含选自叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮(Sydnone)残基、硒残基中的生物正交性官能团的二价基团；

[29]根据[1]～[27]中任一项的化合物或其盐，其中，包含生物正交性官能团的二价基团为：在侧链中包含选自叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基中的生物正交性官能团的二价基团；

[30]根据[1]～[29]中任一项的化合物或其盐，其中，生物正交性官能团为以下述式表示的任一个；

[化学式6]

式中，

R

·表示结合键；

[31]根据[1]～[30]中任一项的化合物或其盐，其中，所述(b)的二价基团选自可取代的亚烷基、可取代的亚环烷基、可取代的芳基、可取代的二价杂环基、-NR

[32]根据[1]～[31]中任一项的化合物或其盐，其中，B以下述式(B-1)表示；

[化学式7]

式(B-1)中，

Y为-NH-、-O-、-CH

[化学式8]

(式(B-2)中，

V和V'相同或不同，为-NH-、-O-、-CH

V1为包含生物正交性官能团的二价基团，

s为0～10的任意的整数，

式(B-2)中的○和●的取向分别为与式(B-1)中的○和●的取向相同)，

Z为氧原子、硫原子或氢原子(Z为氢原子的情况下，-C(＝Z)-表示-CH

式(B-1)中的○(白色圆)表示与L侧的部分结合的键，●(黑色圆)表示与R侧的部分结合的键；

[33]根据[1]～[32]中任一项的化合物或其盐，其中，反应性基团为对于赖氨酸残基、酪氨酸残基或色氨酸残基中的任一残基的侧链具有特异性的反应性基团；

[34]根据[33]所述的化合物或其盐，其中，反应性基团为对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团；

[35]根据[1]～[34]中任一项的化合物或其盐，其中，反应性基团对应于选自下述组中的任一化学结构；

[化学式9]

在此，

R

R

j为1～5的任意的整数，

k为1～4的任意的整数；

[36]根据[1]～[35]中任一项的化合物或其盐，其中，连结A和R的主链的原子数为4～20个；

[37]根据[1]～[36]中任一项的化合物或其盐，其中，连结A和R的主链不含环结构；

[38]根据[1]～[37]中任一项的化合物或其盐，其中，以L-B表示的部分结构不含肽部分；

[39]根据[1]～[38]中任一项的化合物或其盐，其中，以所述式(I)表示的化合物为以下述式(I')表示的化合物；

A-B2-L'-B1-R (I')

式中，

A和R与所述式(I)中相应符号的含义相同，

L'为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，B1和B2相同或不同，为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

B1和B2可具有以L'为中心的对称结构；

[40]根据[39]的化合物或其盐，其中，以所述式(I')表示的化合物以下述式(I")表示；

[化学式10]

式中，

A和R与[1]所述的式(I)中相应符号的含义相同，

C为切割性部分，

p、p'、q、q'、X、X'、R

Y和Y'相同或不同，与[32]所述的式(B-1)中的Y相同，

Z和Z'相同或不同，与所述式(B-1)中的Z相同；

[41]一种抗体的位置选择性修饰试剂(较好是包含上述[2]～[40]中任一项的化合物或其盐)，所述化合物以下述式(I)表示且包含具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐，

A-L-B-R (I)

式中，

A为针对抗体的亲和性物质，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

R为针对所述抗体的反应性基团；

并且，针对抗体的亲和性物质为在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽；

[42]一种具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐，其中，所述化合物以下述式(I)表示，

A-L-B-R (I)

式中，

A为针对抗体的亲和性物质，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

R为对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团；

并且，针对抗体的亲和性物质为在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽；

[43]一种抗体的位置选择性修饰试剂，其中，

以下述式(I)表示且包含具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐，

A-L-B-R (I)

式中，

A为针对抗体的亲和性物质，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

R为对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团；

并且，针对抗体的亲和性物质为在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽。

第二方面，本发明提供具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐、以及其制造方法；

(具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐)

[1]一种具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐，其中，

以下述式(II)表示，

A-L-B-R'-T (II)

式中，

A为针对抗体的亲和性物质，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，

T为抗体；

并且，针对抗体的亲和性物质为在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽；

[2]根据[1]的抗体或其盐，其中，抗体为单克隆抗体；

[3]根据[1]或[2]的抗体或其盐，其中，抗体为IgG抗体；

[4]根据[1]～[3]中任一项的抗体或其盐，其中，抗体来源于人；

[5]根据[1]～[4]中任一项的抗体或其盐，其中，抗体为包含选自下述(A)～(C)中的任一种Fc区域蛋白质，且具有抗原结合能力的抗体：

(A)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的Fc区域蛋白质；

(B)包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中插入、添加、缺失或取代1个或数个氨基酸残基而形成的氨基酸序列的Fc区域蛋白质；或者

(C)包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列显示90％以上的同一性的氨基酸序列的Fc区域蛋白质；

[6]根据[1]～[5]中任一项的抗体或其盐，其中，抗体在由连续的1～50个氨基酸残基形成的靶区中包含1个以上的特定氨基酸残基，且在除所述靶区以外的非靶区中包含5个以上的所述特定氨基酸残基，

以A-L-B-R'表示的结构单元与所述靶区中所含的1个以上的特定氨基酸残基以30％以上的位置选择性结合；

[7]根据[6]的抗体或其盐，其中，所述靶区为由连续的1～10个氨基酸残基形成的区域；

[8]根据[7]的抗体或其盐，其中，所述靶区为由连续的1～3个氨基酸残基形成的区域；

[9]根据[8]的抗体或其盐，其中，所述靶区为由人IgG Fc区域中的第246～248位的氨基酸残基形成的区域；

[10]根据[6]～[9]中任一项的抗体或其盐，其中，所述位置选择性为50％以上；

[11]根据[10]的抗体或其盐，其中，所述位置选择性为70％以上；

[12]根据[10]的抗体或其盐，其中，所述位置选择性为90％以上；

[13]根据[6]～[12]中任一项的抗体或其盐，其中，所述特定氨基酸残基在以存在于特定位置的特定氨基酸为中心时分别从N末端侧和C末端侧起到相隔a个氨基酸残基的位置为止的区域中，除所述存在于特定位置的特定氨基酸残基以外，不含与特定氨基酸残基同种的氨基酸残基；在此，a为1～10的任意的整数；

[14]根据[1]～[13]中任一项的抗体或其盐，其中，所述抗体为包含多个重链的抗体，T在多个重链中的对应的多个靶区中具有以A-L-B-R'表示的结构单元，因而所述抗体具有多个以A-L-B-R'表示的结构单元；

[15]根据[14]的抗体或其盐，其中，重链的个数为2个；

[16]根据[1]～[15]中任一项的抗体或其盐，其中，通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分为：通过赖氨酸残基、酪氨酸残基或色氨酸残基与对于赖氨酸残基、酪氨酸残基或色氨酸残基中的任一残基的侧链具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分；

[17]根据[1]～[16]中任一项的抗体或其盐，其中，通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分为：通过赖氨酸残基与对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分；

[18]根据[1]～[17]中任一项的抗体或其盐，其中，所述通过反应而生成的部分对应于选自下述组中的任一化学结构；

[化学式11]

在此，●(黑色圆)表示与T侧的部分结合的键，○(白色圆)表示与B侧的部分结合的键，与键正交的直线表示通过反应而生成的键；

[19]根据[1]～[18]中任一项的抗体或其盐，其中，连结A和R'的主链的原子数为4～20个；[20]根据[1]～[19]中任一项的抗体或其盐，其中，连结A和R的主链不含环结构；

[21]根据[1]～[20]中任一项的抗体或其盐，其中，以L-B表示的部分结构不含肽部分；

[22]根据[1]～[21]中任一项的抗体或其盐，其中，以所述式(II)表示的化合物为以下述式(II')表示的化合物；

A-B2-L'-B1-R'-T (II')

式中，

A、R'和T与所述式(II)中相应符号的含义相同，

L'为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，B1和B2相同或不同，为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

B1和B2可具有以L'为中心的对称结构；

[23]根据[22]所述的抗体或其盐，其中，以所述式(II')表示的化合物以下述式(II")表示；

[化学式12]

式中，

A、R'和T与上述式(II)中相应符号的含义相同，

C为切割性部分，

p和p'相同或不同，为0～10的任意的整数，

q和q'相同或不同，为0～10的任意的整数，

X和X'相同或不同，为碳原子、氮原子或单键(在此，X为氮原子的情况下，R

R

(ii)一价烃基，

(iii)芳烷基，

(iv)一价杂环基，

(v)R

(vi)NR

Y和Y'相同或不同，与上述式(B-1)中的Y相同，

Z和Z'相同或不同，与所述式(B-1)中的Z相同；

[24]一种具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐，其中，

以下述式(II)表示，

A-L-B-R'-T (II)

式中，

A为针对抗体的亲和性物质，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，R'为通过抗体与对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分，T为抗体，

并且，针对抗体的亲和性物质为在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽。

(具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的制造方法)

[25]一种具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的制造方法，其中，包括：使以下述式(I)：

A-L-B-R (I)

表示的具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐与抗体反应，生成以下述式(II)：

A-L-B-R'-T (II)

表示的具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐，

式(I)中，

A为针对抗体的亲和性物质，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

R为针对所述抗体的反应性基团；

式(II)中，

A、L和B与所述式(I)中相应符号的含义相同，

R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，

T为抗体；

并且，针对抗体的亲和性物质为在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽；

[26]根据[25]的方法，其中，反应性基团为对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团。

第三实施方式中，本发明提供具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐、以及其制造方法；

(具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐)

[1]一种具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐，其中，

所述复合物以下述式(III)表示，

A-L-B'(-F)-R'-T (III)

式中，

A为针对抗体的亲和性物质，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，

F为功能性物质，

R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，

T为抗体，

并且，针对抗体的亲和性物质为在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽；

[2]根据[1]的复合物或其盐，其中，抗体为单克隆抗体；

[3]根据[1]或[2]的复合物或其盐，其中，抗体为IgG抗体；

[4]根据[1]～[3]中任一项的复合物或其盐，其中，抗体来源于人；

[5]根据[1]～[4]中任一项的复合物或其盐，其中，抗体为包含选自下述(A)～(C)中的任一种F c区域蛋白质，且具有抗原结合能力的抗体：

(A)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的Fc区域蛋白质；

(B)包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中插入、添加、缺失或取代1个或数个氨基酸残基而形成的氨基酸序列的Fc区域蛋白质；或者

(C)包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列显示90％以上的同一性的氨基酸序列的Fc区域蛋白质；

[6]根据[1]～[5]中任一项的复合物或其盐，其中，抗体在由连续的1～50个氨基酸残基形成的靶区中包含1个以上的特定氨基酸残基，且在除所述靶区以外的非靶区中包含5个以上的所述特定氨基酸残基，

以A-L-B'(-F)-R'表示的结构单元与所述靶区中所含的1个以上的特定氨基酸残基以30％以上的位置选择性结合；

[7]根据[6]的复合物或其盐，其中，所述特定氨基酸残基在以存在于特定位置的特定氨基酸为中心时分别从N末端侧和C末端侧起到相隔a个氨基酸残基的位置为止的区域中，除所述存在于特定位置的特定氨基酸残基以外，不含与特定氨基酸残基同种的氨基酸残基；在此，a为1～10的任意的整数；

[8]根据[1]～[7]中任一项的复合物或其盐，其中，所述抗体为包含多个重链的抗体，T在多个重链中对应的多个靶区中具有以A-L-B'(-F)-R'表示的结构单元，因而所述抗体具有多个以A-L-B'(-F)-R'表示的结构单元；

[9]根据[1]～[8]中任一项的复合物或其盐，其中，所述功能性物质具有易与生物正交性官能团反应的官能团或者以具有易与生物正交性官能团反应的官能团的方式衍生物化的情况下，所述易与生物正交性官能团反应的官能团为选自叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基中的基团；

[10]根据[1]～[9]中任一项的复合物或其盐，其中，所述功能性物质具有易与生物正交性官能团反应的官能团或者以具有易与生物正交性官能团反应的官能团的方式衍生物化的情况下，所述易与生物正交性官能团反应的官能团为选自以下所示基团中的基团；

[化学式13]

式中，

R

[11]根据[1]～[10]中任一项的复合物或其盐，其中，通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分为：通过赖氨酸残基、酪氨酸残基或色氨酸残基与对于赖氨酸残基、酪氨酸残基或色氨酸残基中的任一残基的侧链具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分；

[12]根据[1]～[11]中任一项的复合物或其盐，其中，通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分为：通过赖氨酸残基与对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分；

[13]根据[1]～[12]中任一项的复合物或其盐，其中，所述通过反应而生成的部分对应于选自下述组中的任一化学结构；

[化学式14]

在此，●(黑色圆)表示与T侧的部分结合的键，○(白色圆)表示与B侧的部分结合的键；

[14]根据[1]～[13]中任一项的复合物或其盐，其中，功能性物质为药物或标记物质；

[15]根据[1]～[13]中任一项的复合物或其盐，其中，功能性物质为低分子化合物；

[16]根据[14]或[15]所述的复合物或其盐，其中，药物为抗癌剂；

[17]根据[1]～[16]中任一项的复合物或其盐，其中，连结A和R'的主链的原子数为4～20个；

[18]根据[1]～[17]中任一项的复合物或其盐，其中，连结A和R的主链不含环结构；

[19]根据[1]～[18]中任一项的复合物或其盐，其中，以L-B表示的部分结构不含肽部分；

[20]根据[1]～[19]中任一项的复合物或其盐，其中，以所述式(III)表示的化合物以下述式(III')表示；

A-B2'(-F2)-L'-B1'(-F1)-R'-T (III')

式中，

A、R'和T与所述式(II)中相应符号的含义相同，

L'为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，B1'和B2'相同或不同，为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，

F1和F2相同或不同，为功能性物质，

B1'(-F1)和B2'(-F2)可具有以L'为中心的对称结构；

[21]根据[20]所述的复合物或其盐，其中，以所述式(III')表示的化合物以下述式(III")表示；

[化学式15]

式中，

A、R'和T与上述式(III)中相应符号的含义相同，

C为切割性部分，

p和p'相同或不同，为0～10的任意的整数，

q和q'相同或不同，为0～10的任意的整数，

X和X'相同或不同，为碳原子、氮原子或单键(在此，X为氮原子的情况下，R

R

Y和Y'相同或不同，为从上述式(B-1)的Y除去1个氢原子而得的残基，

Z和Z'相同或不同，与所述式(B-1)中的Z相同，

F和F'相同或不同，为功能性物质；

[22]一种具有亲和性物质、功能性物质及抗体的复合物或其盐，其中，

所述复合物以下述式(III)表示，

A-L-B'(-F)-R'-T (III)

式中，

A为针对抗体的亲和性物质，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，

F为功能性物质，

R'为通过抗体与对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分，T为抗体，

并且，针对抗体的亲和性物质为在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽。

(具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的制造方法)

[23]一种具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的制造方法，其中，包括：

使以下述式(II)：

A-L-B-R'-T (II)

表示的具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐与功能性物质反应，生成以下述式(III)：

A-L-B'(-F)-R'-T (III)

表示的具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐，式(II)中，

A为针对抗体的亲和性物质，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团，

R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，

T为抗体；

式(III)中，

A、L、R'和T与所述式(II)中相应符号的含义相同，

B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，

F为功能性物质；

并且，针对抗体的亲和性物质为在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽；

[24]根据[23]的方法，其中，反应性基团为对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团；

[25]一种具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的制造方法，其中，包括：

(A)使以下述式(I)：

A-L-B-R (I)

表示的化合物或其盐与抗体反应，

生成以下述式(II)：

A-L-B-R'-T (II)

表示的具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐，

式(I)中，

A为针对抗体的亲和性物质，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团，

R为针对所述抗体的反应性基团，

式(II)中，

A、L和B与所述式(I)中相应符号的含义相同，

R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，

T为抗体；

以及

(B)使所述具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐与功能性物质反应，生成以下述式(III)：

A-L-B'(-F)-R'-T (III)

表示的具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐，式(III)中，

A和L与所述式(I)中相应符号的含义相同，

R'和T与所述式(II)中相应符号的含义相同，

B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，

F为功能性物质；

并且，针对抗体的亲和性物质为在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽。

第四实施方式中，本发明提供具有生物正交性官能团的抗体的制造方法；

[1]一种具有生物正交性官能团的抗体或其盐的制造方法，其中，包括：

对以下述式(II):

A-L-B-R'-T (II)

表示的具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的切割性部分进行切割，生成以下述式(IV):

L1-B-R'-T(IV)

表示的具有生物正交性官能团的抗体或其盐；

式(II)中，

A为针对抗体的亲和性物质，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，

T为抗体；

式(IV)中，

B、R'和T与所述式(II)中相应符号的含义相同，

L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团；并且，针对抗体的亲和性物质为在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽；

[2]根据[1]的方法，其中，L为：

(i)切割性连接体，该切割性连接体是包含切割性部分的二价基团，该切割性部分具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力；或者

(ii)切割性连接体，该切割性连接体是包含切割性部分的二价基团，该切割性部分不具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力；

[3]根据[2]的方法，其中，L为所述(i)的切割性连接体，

L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团，

B为所述(a)或(b)的二价基团；

[4]根据[2]或[3]的方法，其中，

L为所述(i)的切割性连接体，

L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团，

B为所述(b)的二价基团；

[5]根据[2]的方法，其中，

L为所述(ii)的切割性连接体，

L1为(i')不含生物正交性官能团的一价基团，

B为所述(a)的二价基团；

[6]根据[1]～[5]中任一项的方法，其中，反应性基团为对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团；

[7]一种具有生物正交性官能团的抗体或其盐的制造方法，其中，包括：

(A)使以下述式(I)：

A-L-B-R (I)

表示的化合物或其盐与抗体反应，

生成以下述式(II)：

A-L-B-R'-T (II)

表示的具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐，

式(I)中，

A为针对抗体的亲和性物质，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

R为针对所述抗体的反应性基团，

式(II)中，

A、L和B与所述式(I)中相应符号的含义相同，

R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，

T为抗体；

以及

(B)对所述具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的切割性部分进行切割，生成以下述式(IV):

L1-B-R'-T (IV)

表示的具有生物正交性官能团的抗体或其盐，

式(IV)中，

B、R'和T与所述式(II)中相应符号的含义相同，

L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团；并且，针对抗体的亲和性物质为在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽。

第五实施方式中，本发明提供具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法；

[1]一种具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法，其中，包括：

对以下述式(III):

A-L-B'(-F)-R'-T (III)

表示的具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的切割性部分进行切割，

生成以下述式(V1)：

L1-B'(-F)-R'-T (V1)

表示的具有功能性物质的抗体或其盐，

式(III)中，

A为针对抗体的亲和性物质，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，

F为功能性物质，

R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，

T为抗体；

式(V1)中，

L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团，

B'、F、R'和T与所述式(III)中相应符号的含义相同；

并且，针对抗体的亲和性物质为在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽；

[2]根据[1]的方法，其中，反应性基团为对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团；

[3]一种具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法，其中，包括：

(A)对以下述式(II)：

A-L-B-R'-T (II)

表示的具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐与功能性物质反应，生成以下述式(III)：

A-L-B'(-F)-R'-T (III)

表示的具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐，式(II)中，

A为针对抗体的亲和性物质，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团，

R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，

T为抗体；

式(III)中，

A、L、R'和T与所述式(II)中相应符号的含义相同，

B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，F为功能性物质；

以及

(B)对所述具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的切割性部分进行切割，

生成以下述式(V1)：

L1-B'(-F)-R'-T (V1)

表示的具有功能性物质的抗体或其盐，

式(V1)中，

L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团，

B'、F、R'和T与所述式(III)中相应符号的含义相同；

并且，针对抗体的亲和性物质为在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽；

[4]一种具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法，其中，包括：

(A)使以下述式(I)：

A-L-B-R (I)

表示的具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐与抗体反应，生成以下述式(II)：

A-L-B-R'-T (II)

表示的具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐，

式(I)中，

A为针对抗体的亲和性物质，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团，

R为针对所述抗体的反应性基团，

式(II)中，

A、L和B与所述式(I)中相应符号的含义相同，

R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，

T为抗体；

(B)使所述具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐与功能性物质反应，生成以下述式(III)：

A-L-B'(-F)-R'-T (III)

表示的具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐，式(III)中，

A和L与所述式(I)中相应符号的含义相同，

R'和T与所述式(II)中相应符号的含义相同，

B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，

F为功能性物质；

以及

(C)对所述具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的切割性部分进行切割，

生成以下述式(V1)：

L1-B'(-F)-R'-T (V1)

表示的具有功能性物质的抗体或其盐，

式(V1)中，

L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团，B'、F、R'和T与所述式(III)中相应符号的含义相同；

并且，针对抗体的亲和性物质为在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽；

[5]一种具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法，其中，包括：

(A)对以下述式(II):

A-L-B-R'-T (II)

表示的具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的切割性部分进行切割，生成以下述式(IV):

L1-B-R'-T (IV)

表示的具有生物正交性官能团的抗体或其盐，

式(II)中，

A为针对抗体的亲和性物质，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，

T为抗体；

式(IV)中，

B、R'和T与所述式(II)中相应符号的含义相同，

L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团；以及

(B)使所述具有生物正交性官能团的抗体或其盐与1种或2种以上的功能性物质反应，生成以下述式(V2)：

F-L1'-B-R'-T (V2)

或下述式(V3)：

Fa-L1'-B'(-Fb)-R'-T (V3)

表示的具有功能性物质的抗体或其盐，

式(V2)中，

B、R'和T与所述式(IV)中相应符号的含义相同，

L1'为包含通过功能性物质与(i')包含生物正交性官能团的一价基团之间的反应而生成的部分的二价基团，

F为功能性物质，

式(V3)中，

R'和T与所述式(IV)中相应符号的含义相同，

L1'与所述式(V2)中相应符号的含义相同，

B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的二价基团，

Fa和Fb分别为相同或不同的功能性物质；

并且，针对抗体的亲和性物质为在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽；

[6]一种具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法，其中，包括：

(A)使以下述式(I)：

A-L-B-R (I)

表示的化合物或其盐与抗体反应，

生成以下述式(II)：

A-L-B-R'-T (II)

表示的具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐，

式(I)中，

A为针对抗体的亲和性物质，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

R为针对所述抗体的反应性基团，

式(II)中，

A、L和B与所述式(I)中相应符号的含义相同，

R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，

T为抗体；

(B)对所述具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的切割性部分进行切割，生成以下述式(IV):

L1-B-R'-T (IV)

表示的具有生物正交性官能团的抗体或其盐，

式(IV)中，

B、R'和T与所述式(II)中相应符号的含义相同，

L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团；以及

(C)使所述具有生物正交性官能团的抗体或其盐与1种或2种以上的功能性物质反应，生成以下述式(V2)：

F-L1'-B-R'-T (V2)

或下述式(V3)：

Fa-L1'-B'(-Fb)-R'-T (V3)

表示的具有功能性物质的抗体或其盐，

式(V2)中，

B、R'和T与所述式(IV)中相应符号的含义相同，

L1'为包含通过功能性物质与(i')包含生物正交性官能团的一价基团之间的反应而生成的部分的二价基团，

F为功能性物质，

式(V3)中，

R'和T与所述式(IV)中相应符号的含义相同，

L1'与所述式(V2)中相应符号的含义相同，

B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，

Fa和Fb分别为相同或不同的功能性物质；

并且，针对抗体的亲和性物质为在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽。

发明的效果

(I)具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的本发明的化合物或其盐可用于例如抗体的位置选择性修饰；

(I)本发明的化合物或其盐、(II)(位置选择性地)具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的本发明的抗体或其盐、(III)(位置选择性地)具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的本发明的复合物或其盐可用作例如用于制备(位置选择性地)具有生物正交性官能团的抗体或其盐、以及(位置选择性地)具有功能性物质的抗体或其盐的中间体。(位置选择性地)具有功能性物质的抗体或其盐可用作例如药物或者试剂(例如诊断药物、研究用试剂)。(位置选择性地)具有生物正交性官能团的抗体或其盐可用作用于制备(位置选择性地)具有功能性物质的抗体或其盐的中间体。因此，(I)本发明的化合物或其盐、(II)本发明的抗体或其盐、以及(III)本发明的复合物或其盐可用作例如药物或试剂的合成中间体；

此外，通过使用在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽作为针对抗体的亲和性物质，可藉由N末端的谷氨酰胺残基(Q)中的氨基(-NH

进而，如果采用将棒状杆菌型细菌用作宿主的多肽的分泌生产方法(CspB融合法)，通过在目标多肽的N末端添加CspB成熟蛋白质的N末端三残基Gln-Glu-Thr(QET)，可享受该多肽分泌生产方法的优点，因而适合于在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽(针对抗体的亲和性物质)的制备。

附图的简单说明

图1-1是表示采用本发明的化合物[具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物:A-L-B-R(I)]的抗体的位置选择性修饰的概念(构思)的示意图(其一)。首先，本发明的化合物介以针对抗体的亲和性物质(A)而与抗体(T)缔合。接着，本发明的化合物介以反应性基团(R)(图中为活性酯)而与存在于亲和性物质和抗体的缔合部位附近的靶区中的特定氨基酸残基的侧链(图中为赖氨酸残基的侧链)反应，生成本发明的化合物与抗体的偶联物[位置选择性地具有包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的结构单元的抗体:A-L-B-R'-T(II)]；图1-2是表示采用本发明的化合物的抗体的位置选择性修饰的概念的示意图(其二)。通过连接体(L)中的切割性部分的切割，生成以生物正交性官能团位置选择性地进行了修饰的抗体；

图1-3是表示采用本发明的化合物的抗体的位置选择性修饰的概念的示意图(其三)。通过生物正交性官能团与功能性物质(例如药物)的反应，生成以功能性物质位置特异性地进行了修饰的抗体；

图2是表示本发明的各发明的相关性的图(关于盐的表记省略)。反应(1)中，使具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物与抗体反应，生成具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体。反应(2)中，使具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体与功能性物质反应，生成具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物。反应(3)中，对具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物的切割性部分进行切割，生成具有功能性物质的抗体(这时，作为副产物生成亲和性物质的含有部分)。反应(4)中，对具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体的切割性部分进行切割，生成具有生物正交性官能团的抗体(这时，作为副产物生成亲和性物质的含有部分)。反应(5)中，使具有生物正交性官能团的抗体与功能性物质反应，生成具有功能性物质的抗体。反应(2)和(5)可同样地进行。此外反应(3)和(5)也可同样地进行；

图3是表示曲妥珠单抗(Trastuzumab)的重链中的Fc区域、及IgG1 Fc区域的共有氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的图；

图4是表示(1)曲妥珠单抗的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)、(2)将糖链用PNGase切割后的IgG1 Fc区域的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)、及(3)曲妥珠单抗的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)的图；

图5是表示谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)中的各修饰蛋白A的分泌表达的图。泳道1:分子量标记物，泳道2:被推测为CspB6Tev-QZ34C的蛋白质条带，泳道3:被推测为QZ34C-60的蛋白质条带，泳道4:被推测为QET-Z34C1的蛋白质条带，泳道5:被推测为QET-Z34C2的蛋白质条带；

图6是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC(Hydrophobic InteractionChromatography，疏水相互作用层析)-UPLC分析的结果(检测波长:UV280nm)的图(实施例3)。纵轴的AU表示吸光度(以下的附图中同样)；

图7是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长:UV280nm)的图(实施例4)；

图8是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长:UV280nm)的图(实施例5)；

图9是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长:UV280nm)的图(实施例6)；

图10是表示曲妥珠单抗的经胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化(Carbamidomethylation)的巯基(thiol)引入体(+145.019Da))的由33个氨基酸残基形成的肽THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(SEQ IDNO:26)的肽片段的MS谱(实测值:m/z 952.23196，理论值:952.22900，四价)的图(实施例7)；

图11-1是表示显示EU numbering中的人IgG重链的第246/248位的赖氨酸残基的修饰的与二价的y12对应的m/z 764.68(理论值:764.40)的产物离子的CID谱的图(实施例7)；

图11-2是表示对于曲妥珠单抗的胰蛋白酶消化产物，用Proteome Discoverer(赛默飞世尔科技公司)检索包含对赖氨酸残基的修饰(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的肽片段而得到的结果的图(实施例7)。横轴表示所鉴定的赖氨酸残基，纵轴表示肽匹配图谱(PSM，Peptide Spectrum Match)。其中，关于赖氨酸残基的残基编号，对于重链VH结构域和轻链上用序列中的编号(即，将N末端的氨基酸作为第1位，下同)表示，对于重链CH1、CH2、CH3结构域上用EU numbering表示；

图12是表示曲妥珠单抗的经胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的由33个氨基酸残基形成的肽THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(SEQ ID NO:26)的肽片段的MS谱(实测值:m/z952.23227，理论值:952.22900，四价)的图(实施例8)；

图13-1是表示显示EU numbering中的人IgG重链的第246/248位的赖氨酸残基的修饰的与二价的y13对应的m/z 838.23(理论值:837.94)的产物离子的CID谱的图(实施例8)；

图13-2是表示对于曲妥珠单抗的胰蛋白酶消化产物，用Proteome Discoverer(赛默飞世尔科技公司)检索包含对赖氨酸残基的修饰(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的肽片段而得到的结果的图(实施例8)。横轴表示所鉴定的赖氨酸残基，纵轴表示肽匹配图谱(PSM，Peptide Spectrum Match)。其中，关于赖氨酸残基的残基编号，对于重链VH结构域和轻链上用序列中的编号表示，对于重链CH1、CH2、CH3结构域上用EU numbering表示；

图14是表示曲妥珠单抗的经胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的由33个氨基酸残基形成的肽THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(SEQ ID NO:26)的肽片段的MS谱(实测值:m/z952.23032，理论值:952.22900，四价)的图(实施例9)；

图15-1是表示显示EU numbering中的人IgG重链的第246/248位的赖氨酸残基的修饰的与二价的y13对应的m/z 838.29(理论值:837.94)的产物离子的CID谱的图(实施例9)；

图15-2是表示对于曲妥珠单抗的胰蛋白酶消化产物，用Proteome Discoverer(赛默飞世尔科技公司)检索包含对赖氨酸残基的修饰(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的肽片段而得到的结果的图(实施例9)。横轴表示所鉴定的赖氨酸残基，纵轴表示肽匹配图谱(PSM，Peptide Spectrum Match)。其中，关于赖氨酸残基的残基编号，对于重链VH结构域和轻链上用序列中的编号表示，对于重链CH1、CH2、CH3结构域上用EU numbering表示；

图16是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长:UV280nm)的图；

图17是表示参考例1的用结合肽(binder peptide)进行了修饰的曲妥珠单抗的经胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的VVSVLTVLHQDWLNGKEYK(SEQ ID NO:47)的肽片段的MS谱(m/z791.74872，三价)的图；

图18是表示参考例1的用结合肽进行了修饰的曲妥珠单抗的经胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的VVSVLTVLHQDWLNGKEYK(SEQ ID NO:47)的肽片段的CID谱的图；

图19是表示参考例1的用结合肽进行了修饰的曲妥珠单抗的经胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的EEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK(SEQ ID NO:48)的肽片段的MS谱(m/z886.93408，四价)的图；

图20是表示参考例1的用结合肽进行了修饰的曲妥珠单抗的经胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的EEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK(SEQ ID NO:48)的肽片段的CID谱的图；

图21是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长:UV280nm)的图(参考例3)；

图22是表示参考例3的用结合肽进行了修饰的曲妥珠单抗的经胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的FNWYVDGVEVHNAKTKPR(SEQ ID NO:50)的肽片段的MS谱(m/z 769.04688，三价)的图；

图23是表示参考例3的用结合肽进行了修饰的曲妥珠单抗的经胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的FNWYVDGVEVHNAKTKPR(SEQ ID NO:50)的肽片段的CID谱的图；

图24是表示关于谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)中的各修饰蛋白A(QET-Z34C3和QET-Z34C4)的分泌表达的SDS-PAGE的图；

图25是表示关于谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)中的各修饰Fc-III(CspBss-QET-LV和CspBss-QET-II)的分泌表达的SDS-PAGE的图；

图26是表示曲妥珠单抗的经胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的由18个氨基酸残基形成的肽、FNWYVDGVEVHNAKTKPR(SEQ ID NO:50)的肽片段的MS谱(实测值:m/z 769.04353，理论值:769.04482，三价)的图；

图27-1是表示显示EU numbering中的人IgG重链的第288/290位的赖氨酸残基的修饰的与二价的y16对应的m/z 1022.73(理论值:1022.51)的产物离子的CID谱的图(实施例12)；

图27-2是表示对于曲妥珠单抗的胰蛋白酶消化产物，用BioPharma Finder检索包含对赖氨酸残基的修饰(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的肽片段而得到的结果的图(实施例12)。横轴表示所鉴定的赖氨酸残基，纵轴表示强度(Intensity)。其中，关于赖氨酸残基的残基编号，对于重链VH结构域和轻链上用序列中的编号(即，将N末端的氨基酸作为第1位，下同)表示，对于重链CH1、CH2、CH3结构域上用EUnumbering表示；

图28是表示曲妥珠单抗的特异性修饰体的基于ESI-TOFMS分析的确认的图(实施例13)；

图29是表示曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析的结果(检测波长:UV280nm)的图(实施例13)；

图30是表示曲妥珠单抗的经胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的由33个氨基酸残基形成的肽THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(SEQ ID NO:26)的肽片段的MS谱(实测值:m/z952.23425，理论值:952.22942，四价)的图(实施例14)；

图31是表示曲妥珠单抗的经胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的由33个氨基酸残基形成的肽THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(SEQ ID NO:26)的肽片段的MS谱(实测值:m/z952.23425，理论值:952.22942，四价)的图(实施例14)；

图32-1是表示显示EU numbering中的人IgG重链的第246/248位的赖氨酸残基的修饰的与二价的y20对应的m/z 1166.99(理论值:1166.61)的产物离子的CID谱的图(实施例14)；

图32-2是表示对于曲妥珠单抗的胰蛋白酶消化产物，用BioPharma Finder检索包含对赖氨酸残基的修饰(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的肽片段而得到的结果的图(实施例14)。横轴表示所鉴定的赖氨酸残基，纵轴表示强度(Intensity)。其中，关于赖氨酸残基的残基编号，对于重链VH结构域和轻链上用序列中的编号(即，将N末端的氨基酸作为第1位，下同)表示，对于重链CH1、CH2、CH3结构域上用EUnumbering表示。

具体实施方式

1.包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐1-1.概要

本发明提供以式(I)表示的包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐；

A-L-B-R (I)

式中，

A为针对抗体的亲和性物质，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

R为针对所述抗体的反应性基团。

关于本发明所示出的式(I)及其他式中，-(连字符)表示存在于其两侧的2个单元共价结合(共价键合)。因此，式(I)中，A与L共价结合，L与A及B共价结合，B与L及R共价结合，R与B共价结合。

1-2.针对抗体的亲和性物质(A)

式(I)中，A为针对抗体的亲和性物质。亲和性物质是指对于抗体具有基于非共价结合的结合能力的物质。

本发明中所用的亲和性物质以抗体为目标。抗体可以是经生物分子(例如糖)修饰的蛋白质(例如糖蛋白)，也可以是未经生物分子修饰的蛋白质。作为抗体，可使用针对来源于生物的成分、来源于病毒的成分和环境中所发现的成分等任意的成分的任意的抗体，但较好是针对来源于生物的成分或来源于病毒的成分的抗体。作为来源于生物的成分，可列举例如来源于哺乳动物、鸟类(例如鸡)等动物、昆虫、微生物、植物、菌类及鱼类的成分(例如蛋白质)。来源于生物的成分较好是来源于哺乳动物的成分。作为哺乳动物，可列举例如灵长类(例如人、猴、黑猩猩)、啮齿类(例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔)、玩赏动物(例如狗、猫)、家畜(例如牛、猪、山羊)、役用动物(例如马、绵羊)。来源于生物的成分更好是来源于灵长类或啮齿类的成分(例如蛋白质)，从本发明的临床应用的观点来看，进一步更好是来源于人的成分(例如蛋白质)。作为来源于病毒的成分，可列举例如来源于流感病毒(例如禽流感病毒、猪流感病毒)、艾滋病病毒、埃博拉病毒、噬菌体病毒的成分(例如蛋白质)。

此外，抗体为多克隆抗体或者单克隆抗体，较好是单克隆抗体。作为单克隆抗体，可列举例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、添加了规定糖链的抗体(例如以具有N型糖链结合共有序列等糖链结合共有序列的方式进行了改造的抗体)、双特异性抗体、scFv抗体、Fab抗体、F(ab')

作为亲和性物质的目标的抗体还可由任意的氨基酸残基构成，较好是由通常构成蛋白质的天然的20种L-α-氨基酸残基构成。作为这样的氨基酸残基，可列举例如L-丙氨酸(A)、L-天冬酰胺(N)、L-半胱氨酸(C)、L-谷氨酰胺(Q)、L-异亮氨酸(I)、L-亮氨酸(L)、L-甲硫氨酸(M)、L-苯丙氨酸(F)、L-脯氨酸(P)、L-丝氨酸(S)、L-苏氨酸(T)、L-色氨酸(W)、L-酪氨酸(Y)、L-缬氨酸(V)、L-天冬氨酸(D)、L-谷氨酸(E)、L-精氨酸(R)、L-组氨酸(H)、或L-赖氨酸(K)、及L-甘氨酸(G)(以下省略L的表记)。抗体例如可由100个以上、较好是120个以上、更好是150个以上、进一步更好是180个以上、特别好是200个以上的氨基酸残基构成。抗体还可以是例如1000个以下，较好是900个以下，更好是800个以下，进一步更好是700个以下，特别好是600个以下。更具体来说，抗体例如可由100～1000个、较好是120～900个、更好是150～800个、进一步更好是180～700个、特别好是200～600个的氨基酸残基构成。抗体为抗体(例如上述的单克隆抗体)的情况下，上述个数的氨基酸残基可以相当于抗体的重链的氨基酸残基。

作为亲和性物质的目标的抗体还可以是在1个位置或多个位置(较好是多个位置)包含具有能与如后所述的反应性基团反应的侧链或末端(N末端和/或C末端)、较好是侧链的特定氨基酸残基的蛋白质。作为这样的特定氨基酸残基，可列举例如如后所述的14种氨基酸残基，较好是选自赖氨酸残基、酪氨酸残基、色氨酸残基及半胱氨酸残基中的氨基酸残基。这样的特定氨基酸残基更好是选自赖氨酸残基、酪氨酸残基及色氨酸残基中的氨基酸残基。如果考虑到本发明的化合物可位置选择性地修饰抗体，则较好是在多个位置包含这样的特定氨基酸残基的抗体。作为多个位置，只要是2个以上的位置即可，无特别限定，例如可以是3个以上的位置，较好是5个以上的位置，更好是10个以上的位置，进一步更好是20个以上的位置，特别好是30个以上的位置。多个位置还例如可以是200个以下的位置，较好是180个以下的位置，更好是150个以下的位置，进一步更好是120个以下的位置，特别好是100个以下的位置。更具体来说，多个位置例如可以是3～200个位置，较好是5～180个位置，更好是10～150个位置，进一步更好是20～120个位置，特别好是30～100个位置。即使是这样的在多个位置包含特定氨基酸残基的抗体，本发明的化合物也可对存在于特定的一个位置的特定氨基酸残基位置选择性地进行修饰。例如，人IgG1的赖氨酸残基数，也根据可变区中的氨基酸组成而不同，一般被认为是70～90个左右。本发明中，成功实现了这样的对存在于人IgG1的特定位置的赖氨酸残基的位置选择性修饰。

更具体来说，本发明中，从维持抗体的功能的同时(即，在不使抗体变性的情况下维持天然折叠的同时)、对存在于抗体中的特定位置的氨基酸残基进行修饰的观点来看，较好是露出于抗体表面的氨基酸残基的位置选择性修饰。例如，人IgG1等人IgG中，露出赖氨酸残基及露出酪氨酸残基存在于以下的位置(基于EU numbering，参照http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html)。其中，本申请中，为了便于说明，对于重链CH1、CH2、CH3结构域上用EU numbering表示，对于重链VH结构域和轻链上用序列中的编号(即，将N末端的氨基酸作为第1位)表示；

(1)露出赖氨酸残基

CH2结构域(246位、248位、274位、288位、290位、317位、320位、322位、338位)CH3结构域(360位、414位、439位)

(2)露出酪氨酸残基

CH2结构域(278位、296位、300位)

CH3结构域(436位)

因此，人IgG1等人IgG在赖氨酸残基或酪氨酸残基被修饰的情况下，较好是位于上述位置的修饰。

较好的是，人IgG1等人IgG在赖氨酸残基或酪氨酸残基被修饰的情况下，上述(1)及(2)的位置中，可以是存在于在表面的露出性高的以下的位置的赖氨酸残基或酪氨酸残基被修饰；

(1')露出赖氨酸残基

CH2结构域(246位、248位、274位、288位、290位、317位、320位、322位)

CH3结构域(360位、414位、439位)

(2')露出酪氨酸残基

CH2结构域(278位、296位、300位)

CH3结构域(436位)

因此，人IgG1等人IgG在赖氨酸残基或酪氨酸残基被修饰的情况下，更好是位于上述位置的修饰。

更好的是，人IgG1等人IgG在赖氨酸残基被修饰的情况下，上述(1)的位置中，可以是存在于本发明中可有效进行修饰的CH2结构域中的规定位置(例如246位、248位、288位、290位、317位)的赖氨酸残基被修饰。

特定的实施方式中，作为亲和性物质的目标的抗体，在如上所述在多个位置包含特定氨基酸残基的情况下，可以是在由连续的1～50个氨基酸残基形成的靶区中包含1个以上的特定氨基酸残基，且在除所述靶区以外的非靶区中包含5个以上的特定氨基酸残基。靶区可以由较好是1～30个、更好是1～20个、进一步更好是1～10个、1～5个、或1～3个(即1个、2个或3个)氨基酸残基形成。特别好是，靶区可以是由存在于特定位置的特定氨基酸残基形成的区域。这样的特定位置也根据目标蛋白质及亲和性物质的种类等而变动，例如可以是抗体的恒定区中的特定区域(例如CH1、CH2、CH3)中的特定位置，较好是抗体的CH2中的位置。更具体来说，靶区可以是人IgG Fc中的基于EU numbering的下述残基：

(1)Lys248残基(以下，本说明书中也简记为“Lys248”，相当于人IgG CH2区域(SEQID NO:1)的第18位残基)或者Lys246残基(以下，本说明书中也简记为“Lys246”，相当于人IgG CH2区域(SEQ ID NO:1)的第16位残基)；

(2)Lys288残基(以下，本说明书中也简记为“Lys288”，相当于人IgG CH2区域(SEQID NO:1)的第58位残基)或者Lys290残基(以下，本说明书中也简记为“Lys290”，相当于人IgG CH2区域(SEQ ID NO:1)的第60位残基)；

(3)Lys317残基(以下，本说明书中也简记为“Lys317”，相当于人IgG CH2区域(SEQID NO:1)的第87位残基)。

如果采用本发明，可对上述靶区中的特定氨基酸残基高度位置选择性地进行修饰。这样的位置选择性例如可以是30％以上，较好是40％以上，更好是50％以上，进一步更好是60％以上，特别好是70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、或100％以上。

靶区还可以是：存在于特定位置的特定氨基酸残基以该特定位置为中心时分别从N末端侧和C末端侧起到相隔a个(在此，a为1～10的任意的整数)氨基酸残基的位置为止的区域中，除存在于该特定位置的特定氨基酸残基以外，不含与特定氨基酸残基同种的氨基酸残基。a较好是1～5的整数，更好是1～3的整数，进一步更好是1或2，特别好是1。

优选的实施方式中，抗体为单克隆抗体。作为单克隆抗体等抗体的同型，可列举例如IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgD、IgE和IgY。单克隆抗体为全长抗体或者抗体片段(例如F(ab')

抗体是针对任意抗原的抗体。例如，这样的抗原可以是如上所述的生物或病毒中所发现的成分。作为这样的抗原，还可列举例如蛋白质[包括寡肽、多肽。可以是经糖等生物分子修饰的蛋白质(例如糖蛋白)]、糖链、核酸、低分子化合物。

较好是抗体可为以蛋白质为抗原的抗体。作为蛋白质，可列举例如细胞膜受体、除细胞膜受体以外的细胞膜蛋白质(例如细胞外基质蛋白质)、配体、可溶性受体。

更具体来说，作为抗体的抗原的蛋白质可以是疾病靶向蛋白质。作为疾病靶向蛋白质，可列举例如以下的蛋白质。

(1)癌症领域

PD-L1、GD2、PDGFRα(血小板衍生生长因子受体)、CD22、HER2、磷脂酰丝氨酸(PS)、EpCAM、纤维连接蛋白、PD-1、VEGFR-2、CD33、HGF、gpNMB、CD27、DEC-205、叶酸受体、CD37、CD19、Trop2、CEACAM5、S1P、HER3、IGF-1R、DLL4、TNT-1/B、CPAAs、PSMA、CD20、CD105(内皮因子)、ICAM-1、CD30、CD16A、CD38、MUC1、EGFR、KIR2DL1,2,、NKG2A、肌腱蛋白C(tenascin-C)、IGF(胰岛素样生长因子，Insulin-like growth factor)、CTLA-4、间皮素(mesothelin)、CD138、c-Met、Ang2、VEGF-A、CD79b、ENPD3、叶酸受体α、TEM-1、GM2、Glypican-3、巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage inhibitory factor)、CD74、Notch1、Notch2、Notch3、CD37、TLR-2、CD3、CSF-1R、FGFR2b、HLA-DR、GM-CSF、EphA3、B7-H3、CD123、gpA33、Frizzled7受体、DLL4、VEGF、RSPO、LIV-1、SLITRK6、结合素4(Nectin-4)、CD70、CD40、CD19、SEMA4D(CD100)、CD25、MET、组织因子(Tissue Factor)、IL-8、EGFR、cMet、KIR3DL2、Bst1(CD157)、P-钙粘蛋白、CEA、GITR、TAM(肿瘤相关巨噬细胞，tumor associated macrophage)、CEA、DLL4、Ang2、CD73、FGFR2、CXCR4、LAG-3、GITR、Fucosyl GM1、IGF-1、血管生成素2(Angiopoietin 2)、CSF-1R、FGFR3、OX40、BCMA、ErbB3、CD137(4-1BB)、PTK7、EFNA4、FAP、DR5、CEA、Ly6E、CA6、CEACAM5、LAMP1、组织因子(tissue factor)、EPHA2、DR5、B7-H3、FGFR4、FGFR2、α2-PI、A33、GDF15、CAIX、CD166、ROR1、GITR、BCMA、TBA、LAG-3、EphA2、TIM-3、CD-200、EGFRvIII、CD16A、CD32B、PIGF、Axl、MICA/B、Thomsen-Friedenreich、CD39、CD37、CD73、CLEC12A、Lgr3、转铁蛋白受体、TGFβ、IL-17、5T4、RTK、免疫抑制蛋白(Immune Suppressor Protein)、NaPi2b、路易斯血型B抗原、A34、赖氨酰氧化酶(Lysil-Oxidase)、DLK-1、TROP-2、整合素α9、TAG-72(CA72-4)、CD70。

(2)自身免疫疾病-炎症性疾病

IL-17、IL-6R、IL-17R、INF-α、IL-5R、IL-13、IL-23、IL-6、ActRIIB、整合素β7(β7-Integrin)、IL-4αR、HAS、嗜酸性粒细胞趋化因子1(Eotaxin-1)、CD3、CD19、TNF-α、IL-15、CD3ε、纤维连接蛋白(Fibronectin)、IL-1β、IL-1α、IL-17、TSLP(胸腺基质淋巴细胞生成素，Thymic Stromal Lymphopoietin)、LAMP(整合素α4β7)、IL-23、GM-CSFR、TSLP、CD28、CD40、TLR-3、BAFF-R、MAdCAM、IL-31R、IL-33、CD74、CD32B、CD79B、IgE(免疫球蛋白E)、IL-17A、IL-17F、C5、FcRn、CD28、TLR4、MCAM、B7RP1、CXCR1,2配体、IL-21、钙粘蛋白11(Cadherin-11)、CX3CL1、CCL20、IL-36R、IL-10R、CD86、TNF-α、IL-7R、Kv1.3、整合素α9、LIFHT。

(3)脑神经疾病

CGRP、CD20、β-淀粉样蛋白、β-淀粉样蛋白原纤维、降钙素基因相关肽受体(Calcitonin Gene-Related Peptide Receptor)、LINGO(Ig Domain Containing1)、α突触核蛋白(synuclein)、细胞外tau、CD52、胰岛素受体、tau蛋白、TDP-43、SOD1、TauC3、JC病毒。

(4)传染病

艰难梭菌毒素B(Clostridium Difficile toxin B)、巨细胞病毒、RS病毒、LPS、金黄色葡萄球菌α毒素(S.Aureus Alpha-toxin)、M2e蛋白、Psl、PcrV、金黄色葡萄球菌毒素(S.Aureus toxin)、甲型流感、藻蛋白酸盐(Alginate)、金黄色葡萄球菌、PD-L1、乙型流感、不动杆菌、F蛋白、Env、CD3、病原性大肠杆菌、克雷白氏杆菌、肺炎球菌。

(5)遗传性-罕见疾病

淀粉样蛋白AL、SEMA4D(CD100)、胰岛素受体、ANGPTL3、IL4、IL13、FGF23、促肾上腺皮质激素、甲状腺素转运蛋白(transthyretin)、亨廷顿舞蹈病(huntingtin)。

(6)眼部疾病

D因子、IGF-1R、PGDFR、Ang2、VEGF-A、CD-105(内皮因子，Endoglin)、IGF-1R、β淀粉样蛋白。

(7)骨科-整形外科领域

硬骨素(Sclerostin)、肌抑素(Myostatin)、Dickkopf-1、GDF8、RNAKL、HAS、Siglec-15。

(8)血液疾病

vWF、IXa因子、X因子、IFNγ、C5、BMP-6、铁转运蛋白(Ferroportin)、TFPI。

(9)其他疾病

BAFF(B细胞活化因子，B cell activating factor)、IL-1β、PCSK9、NGF、CD45、TLR-2、GLP-1、TNFR1、C5、CD40、LPA、催乳素受体、VEGFR-1、CB1、内皮因子(Endoglin)、PTH1R、CXCL1、CXCL8、IL-1β、AT2-R、IAPP。

更优选的实施方式中，针对抗体的亲和性物质为针对单克隆抗体的亲和性物质。单克隆抗体的同型，与关于抗体的上述内容相同，较好是IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。较好是单克隆抗体为全长单克隆抗体。

进一步更优选的实施方式中，针对抗体的亲和性物质为针对作为全长单克隆抗体的嵌合抗体、人源化抗体、或人抗体(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等IgG)的亲和性物质。

特别优选的实施方式中，针对抗体的亲和性物质为针对下述抗体的亲和性物质，所述抗体包含选自下述(A)～(C)中的任一种Fc区域蛋白质，且具有抗原结合能力：

(A)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的Fc区域蛋白质；

(B)包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中插入、添加、缺失或取代1个或数个氨基酸残基而形成的氨基酸序列的Fc区域蛋白质；或者

(C)包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列显示90％以上的同一性的氨基酸序列的Fc区域蛋白质。

SEQ ID NO:1的氨基酸序列为Fc区域蛋白质。已知这样的Fc区域蛋白质具有分泌能力。因此，上述(A)～(C)的Fc区域蛋白质可具有分泌能力。此外，包含这样的Fc区域蛋白质的抗体可具有抗原结合能力。SEQ ID NO:1中的18位的氨基酸残基为任意的氨基酸残基，较好是中性氨基酸残基，更好是如后所述的具有非极性侧链的氨基酸残基，进一步更好是亮氨酸、异亮氨酸或丙氨酸，特别好是亮氨酸或丙氨酸。SEQ ID NO:1中的19位的氨基酸残基为任意的氨基酸残基，较好是中性氨基酸残基或酸性氨基酸残基，更好是具有非极性侧链的氨基酸残基或酸性氨基酸残基，进一步更好是亮氨酸或谷氨酸。SEQ ID NO:1中的21位的氨基酸残基为任意的氨基酸残基，较好是中性氨基酸残基，更好是具有非极性侧链的氨基酸残基，进一步更好是甘氨酸或丙氨酸。SEQ ID NO:1中的140位的氨基酸残基为任意的氨基酸残基，较好是酸性氨基酸残基，更好是谷氨酸或天冬氨酸。SEQ ID NO:1中的142位的氨基酸残基为任意的氨基酸残基，较好是中性氨基酸残基，更好是具有非极性侧链的氨基酸残基，进一步更好是甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，特别好是甲硫氨酸或亮氨酸。SEQ IDNO:1中的177位的氨基酸残基为任意的氨基酸残基，较好是中性氨基酸残基，更好是如后所述的具有不带电的极性侧链的氨基酸残基或具有非极性侧链的氨基酸残基，进一步更好是苏氨酸、丙氨酸或甘氨酸，特别好是苏氨酸或丙氨酸。

优选的实施方式中，SEQ ID NO:1的氨基酸序列可以是由SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的第220～449位的氨基酸残基形成的氨基酸序列。

另一优选的实施方式中，SEQ ID NO:1的氨基酸序列可以是由SEQ ID NO:3的氨基酸序列中的第7～236位的氨基酸残基形成的氨基酸序列。

特定的实施方式中，包含“含有如上所述的氨基酸序列的Fc区域蛋白质”的抗体，可以是：包含“含有如上所述的氨基酸序列的Fc区域蛋白质”及“抗体的恒定区”的抗体。作为这样的抗体的恒定区，可以是嵌合抗体、人源化抗体、或人抗体(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等IgG)的恒定区。

Fc区域蛋白质(B)中，1个或数个氨基酸残基可通过选自氨基酸残基的缺失、取代、添加及插入中的1、2、3或4种突变而改变。氨基酸残基的突变可被引入至氨基酸序列中的1个区域，也可被引入至多个不同的区域。术语“1个或数个”表示不会大幅破坏蛋白质活性的个数。术语“1个或数个”所示的数量例如为1～100个，较好是1～80个，更好是1～50个、1～30个、1～20个、1～10个或1～5个(例如1个、2个、3个、4个或5个)。

Fc区域蛋白质(C)中，与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的同一性％可以是70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上。本发明中，肽或多肽(蛋白质)的同一性％的计算可通过算法blastp进行。更具体来说，多肽的同一性％的计算可使用NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI)所提供的算法blastp中默认设定的评分参数(Matrix:BLOSUM62；Gap Costs:Existence＝11Extension＝1；CompositionalAdjustments:Conditional compositional score matrix adjustment)进行。此外，多核苷酸(基因)的同一性％的计算可通过算法blastn进行。更具体来说，多核苷酸的同一性％的计算可使用NCBI所提供的算法blastn中默认设定的评分参数(Match/Mismatch Scores＝1,-2；Gap Costs＝Linear)进行。

分泌能力中的分泌是与分泌蛋白的分泌(所谓的可溶性)同样的含义。因此，“具有分泌能力”是指与通常的抗体同样，作为抗体发挥作用。

上述包含Fc区域蛋白质的抗体，只要保持目标特性(例如分泌能力、抗原结合能力)，则可在特定的部位引入有变异。可保持目标特性的可引入变异的氨基酸残基的位置对本领域技术人员不言自明。具体来说，对于本领域技术人员而言，1)比较具有同种特性的多种蛋白质的氨基酸序列，2)明确相对保守(保存)的区域和相对不保守的区域，接着3)由相对保守的区域和相对不保守的区域可分别预测对于功能可发挥重要的作用的区域和对于功能不能发挥重要的作用的区域，所以能够识别结构及功能的相关性。因此，本领域技术人员能够对上述包含Fc区域蛋白质的抗体的氨基酸序列中可引入变异的氨基酸残基的位置进行特定。

氨基酸残基通过取代而突变的情况下，氨基酸残基的取代可以是保守性取代。本说明书中使用的情况下，术语“保守性取代”是指，将规定的氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基进行取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在该领域中周知。例如，作为这样的家族，可列举具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β位分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)、具有含羟基(例如醇性、酚性)的侧链的氨基酸(例如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)、及具有含硫的侧链的氨基酸(例如半胱氨酸、甲硫氨酸)。较好是氨基酸的保守性取代可以是天冬氨酸与谷氨酸之间的取代，精氨酸与赖氨酸与组氨酸之间的取代，色氨酸与苯丙氨酸之间的取代，苯丙氨酸与缬氨酸之间的取代，亮氨酸与异亮氨酸与丙氨酸之间的取代，以及甘氨酸与丙氨酸之间的取代。

作为包含选自上述(A)～(C)中的任一种Fc区域的抗体，可列举例如：嵌合抗体(例如利妥昔单抗(Rituximab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、英夫利昔单抗(Infliximab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、司妥昔单抗(Siltuximab)、达妥昔单抗(Dinutuximab)、奥塔昔单抗(altertoxaximab))、人源化抗体(例如达利珠单抗(Daclizumab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、阿伦单抗(Alemtuzumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、依法利珠单抗(Efalizumab)、贝伐珠单抗(Bevacizumab)、那他珠单抗(Natalizumab)(IgG4)、托珠单抗(Tocilizumab)、依库珠单抗(Eculizumab)(IgG2)、莫加木珠单抗(Mogamulizumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、奥滨尤妥珠单抗(Obinutuzumab)、维多珠单抗(Vedolizumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)(IgG4)、美泊利单抗(Mepolizumab)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)、达雷木单抗(Daratumumab)、依奇珠单抗(Ixekizumab)(IgG4)、瑞利珠单抗(Reslizumab)(IgG4)、阿特珠单抗(Atezolizumab))、人抗体(例如阿达木单抗(Adalimumab)(IgG1)、帕尼单抗(Panitumumab)、戈利木单抗(Golimumab)、优特克单抗(Ustekinumab)、卡纳单抗(Canakinumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、地诺单抗(Denosumab)(IgG2)、伊匹单抗(Ipirimumab)、贝利木单抗(Belimumab)、雷昔库单抗(Raxibacumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、纳武单抗(Nivolumab)(IgG4)、苏金单抗(Secukinumab)、依伏库单抗(Evolocumab)(IgG2)、阿利珠单抗(Alirocumab)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)、布洛鲁单抗(Brodalumab)(IgG2)、奥拉单抗(Olaratumab))(未提及IgG亚型的情况下表示是IgG1)。

本发明中，针对抗体的亲和性物质为在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽。通过使用在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽作为针对抗体的亲和性物质，可藉由N末端的谷氨酰胺残基(Q)中的氨基(-NH

作为在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽，可列举例如：对于针对抗体的亲和性多肽的N末端添加了“谷氨酸残基”或“在N末端含谷氨酸残基的肽”的多肽。作为针对抗体的亲和性多肽，报道了各种多肽(例如，国际公开第2016/186206号、国际公开第2013/027796号、国际公开第2008/054030号、国际公开第2001/045746号、Fassina G等，JOURNAL OFMOLECULAR RECOGNITION，1996，VOL.6，564-569；Ehrlich G.K等，J.Biochem.Biophys.Methods，2001，VOL.49，443-454；Ruvo M等，ChemBioChem，2005，VOL.6，1242-1253；Krook M等，Journal of Immunological Methods，1998，VOL.221，151-157；Jacobs J.M.等，Bio.Techniques，2003，VOL.34，132-141；Carbonell R.G.等，Journalof Chromatography A，2009，VOL.1216，910-918；Lund L.N.等，Journal ofChromatography A，2012，VOL.1225，158-167；Warren L.Delano等，Science，2000，VOL.287，1279-1283；Biochemical Engineering Journal，2013，VOL.79，33-40)。

作为在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽，较好是使用可通过将棒状杆菌型细菌用作宿主的多肽的分泌生产方法(国际公开第2013/062029号)制备的多肽。该方法能够在目标多肽的N末端添加Csp成熟蛋白质的N末端三残基Gln-Glu-Thr(QET)，且可简便且大量地制备在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽，所以适合于针对抗体的亲和性物质的制备。作为可在该方法中使用的棒状杆菌型细菌，可列举例如：棒状杆菌(Corynebacterium)属细菌(例如，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、停滞棒状杆菌(Corynebacterium stationis))和短杆菌(Brevibacterium)属细菌。

在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽的氨基酸残基数，无特别限定，从将棒状杆菌型细菌用作宿主的多肽的分泌生产方法中的分泌生产效率的观点来看，可以是16个以上且123个以下。优选地，这样的氨基酸残基数可以是20个以上、25个以上、30个以上、35个以上、37个以上、或40个以上。这样的氨基酸残基数还可以是73个以下、68个以下、64个以下、61个以下、58个以下、或53个以下。

特定的实施方式中，在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽可以是选自以下的(1)～(4)中的多肽；

[化学式16]

Q为N末端的谷氨酰胺残基，E为谷氨酸残基，T为苏氨酸残基，实线为结合键，间隔区部分为由1个以上且50个以下的氨基酸残基形成的部分，针对抗体的亲和性物质为由15个以上且70个以下的氨基酸残基形成的部分。

上述(1)～(4)的多肽中，间隔区部分的氨基酸残基数较好是1个以上且40个以下，更好是1个以上且30个以下，进一步更好是1个以上且20个以下，特别好是1个以上且10个以下。作为氨基酸残基，可采用任意的氨基酸残基，但较好是构成天然蛋白质的20种标准的L-α-氨基酸。

上述(1)～(4)的多肽中，针对抗体的亲和性多肽部分的氨基酸残基数为15个以上且70个以下，可以优选为15个以上、17个以上、20个以上、25个以上、30个以上、34个以上、35个以上、或40个以上，可以优选为65个以下、61个以下、60个以下、55个以下、或50个以下。上述(1)～(4)的多肽中，作为针对抗体的亲和性多肽部分，可采用针对抗体的任意的亲和性多肽(例如，上述已报道的多肽)，较好是选自蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白Z、及它们的与抗体具有亲和性的片段、以及它们的与抗体具有亲和性的突变体。

蛋白A是存在于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁的非糖基化蛋白质(Staphylococcus aureus Protein A(金黄色葡萄球菌蛋白A):SpA)。已知蛋白A的多个结构域(结构域A、B、C、D和E)分别具有针对抗体的亲和性(例如，Moks T等,Eur JBiochem.1986May 2；156(3):637-43)。因此，可将与这样的结构域对应的多肽用作蛋白A的片段。更具体来说，与这样的结构域对应的多肽具有以下的氨基酸序列(氨基酸残基数58～61个)；

(1)结构域A：ADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNESQAPK(SEQ ID NO:27)

(2)结构域B：ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK(SEQ ID NO:28)

(3)结构域C：ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK(SEQ ID NO:29)

(4)结构域D：ADAQQNKFNKDQQSAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK(SEQ ID NO:30)

(5)结构域E：AANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK(SEQ ID NO:31)。

蛋白G是存在于G群溶血性链球菌(group G streptococci)的细胞壁的蛋白质。已知蛋白G的多个结构域(结构域C2和C3)分别具有针对抗体的亲和性(例如，Sjobring UJ等,Biol Chem.1991Jan 5；266(1):399-405)。因此，可将与这样的结构域对应的多肽用作蛋白G的片段。更具体来说，与这样的结构域对应的多肽具有以下的氨基酸序列(氨基酸残基数60个)；

(1)结构域C2：TPAVTTYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE(SEQ ID NO:32)

(2)结构域C3：TPAVTTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE(SEQ ID NO:33)。

蛋白L是来源于大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)的蛋白质。已知蛋白L的多个结构域(结构域C、C1～C4、B1～B5)具有针对抗体的亲和性(例如，Graille M等,Struct ure.2001Aug；9(8):679-87)。因此，可将与这样的结构域对应的多肽用作蛋白L的片段。更具体来说，与这样的结构域对应的多肽具有以下的氨基酸序列(氨基酸残基数61个)；

(1)结构域C：EVTIKVNLIFADGKIQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKVNGEYTADLEDGGNHMNIKFA(SEQ ID NO:34)

(2)结构域C1：EVTIKANLIFADGSTQNAEFKGTFAKAVSDAYAYADALKKDNGEYTVDVADKGLTLNIKFA(SEQ ID NO:35)

(3)结构域C2：EVTIKVNLIFADGKTQTAEFKGTFEEATAKAYAYADLLAKENGEYTADLEDGGNTINIKFA(SEQ ID NO:36)

(4)结构域C3：EVTIKVNLIFADGKIQTAEFKGTFEEATAKAYAYANLLAKENGEYTADLEDGGNTINIKFA(SEQ ID NO:37)

(5)结构域C4：EVTIKVNLIFADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKVNGEYTADLEDGGYTINIKFA(SEQ ID NO:38)

(6)结构域B1：EVTIKANLIFANGSTQTAEFKGTFEKATSEAYAYADTLKKDNGEYTVDVADKGYTLNIKFA(SEQ ID NO:39)

(7)结构域B2：EVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADALKKDNGEYTVDVADKGYTLNIKFA(SEQ ID NO:40)

(8)结构域B3：EVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFA(SEQ ID NO:41)

(9)结构域B4：EVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFAEATAEAYRYADLLAKENGKYTADLEDGGYTINIRFA(SEQ ID NO:42)

(10)结构域B5：QVTIKENIYFEDGTVQTATFKGTFAEATAEAYRYADLLSKEHGKYTADLEDGGYTINIRFA(SEQ ID NO:43)。

蛋白Z是基于上述蛋白A设计的人工IgG结合多肽(例如，Nilsson B等,ProteinEng.1987Feb-Mar；1(2):107-13.)。蛋白Z具有以下的氨基酸序列(氨基酸残基数58个)。Z34C是与蛋白Z同样基于上述蛋白A设计的由全长34个的氨基酸残基形成的人工IgG结合多肽(例如，Starovasnik MA等,Proc Natl Acad Sci USA.1997Sep 16；94(19):10080-5)。关于Z34C而言，对于蛋白Z为了提高对抗体的亲和性而引入了多个氨基酸残基的取代，但因为氨基酸全长比蛋白Z短，所以也可认为相当于蛋白Z的片段。因此，可将蛋白Z的缩短型多肽(例如，由至少34个氨基酸残基形成的N末端和/或C末端缩短型多肽)和Z34C用作蛋白Z的片段；

(1)蛋白Z：VDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK(SEQ ID NO:44)

(2)Z34C：FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNAKIKSIRDDC(SEQ ID NO:45)。

具有针对抗体的亲和性的蛋白A、蛋白G、蛋白L、或蛋白Z的片段是使蛋白A、G、L或Z的N末端侧和/或C末端侧的氨基酸残基缺失而得的缩短型多肽。已知蛋白A、G、L或Z中，针对抗体的亲和性不需要构成其的所有氨基酸残基，即使缺失N末端侧和/或C末端侧的氨基酸残基，也具有针对抗体的亲和性(例如，具有上述的结构域的那些)。因此，只要是本领域的技术人员，就能够通过制作使蛋白A、G、L或Z的N末端侧和/或C末端侧的氨基酸残基缺失而得的缩短型多肽，再评价所制成的缩短型多肽是否具有针对抗体的亲和性，从而适当地制备具有针对抗体的亲和性的蛋白A、G、L或Z的片段(蛋白A、G、L或Z的具有针对抗体的亲和性的片段)。

作为具有针对抗体的亲和性的蛋白A、蛋白G、蛋白L、或蛋白Z、或者它们的片段的突变体，可列举例如与蛋白A、蛋白G、蛋白L、或蛋白Z、或者它们的片段具有60％以上的氨基酸序列同一性且具有针对抗体的亲和性的同源多肽。已知即使是具有这样的程度的氨基酸序列同一性的同源性多肽，也具有针对抗体的亲和性(例如，Starovasnik MA等,Proc NatlAcad Sci U S A.1997Sep 16；94(19):10080-5)。氨基酸序列同一性可以较好是70％以上，更好是80％以上，进一步更好是90％以上，特别好是95％以上(例如，96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上)。氨基酸序列同一性可与上述的多肽的同一性％同样地算出。

特定的实施方式中，针对抗体的亲和性多肽部分是具有针对抗体的亲和性的蛋白A的片段或其突变体(蛋白A的与抗体具有亲和性的片段或其突变体)。优选地，具有针对抗体的亲和性的蛋白A的片段或其突变体可以包含：在FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNAXIXSIRDDC(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列(2个X分别独立为选自精氨酸残基、谷氨酸残基及谷氨酰胺残基中的1个氨基酸残基)中，任一氨基酸残基被赖氨酸残基取代、且与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列(在与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列中，基于赖氨酸残基的取代被维持)。换言之，这样的多肽部分可以是：(i)在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中任一氨基酸残基被赖氨酸残基取代的多肽部分；或者(ii)在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中任一氨基酸残基被赖氨酸残基取代且除赖氨酸残基以外的1～3个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代、或者插入或添加有其他氨基酸残基的多肽部分。优选地，SEQ ID NO:5的氨基酸序列可以是FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。

优选的实施方式中，针对抗体的亲和性多肽是在N末端添加有谷氨酰胺残基(Q)或QET的具有针对抗体的亲和性的蛋白A的片段的突变体。作为这样的突变体，可列举例如以下的多肽：

(1)QETNPTENLYFQQKNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(SEQ ID NO:7)；

(2)QTADNQKNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDCSQSANLLAEAQQLNDAQA PQA(SEQID NO:8)；

(3)QETKNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(SEQ ID NO:9)；

(4)QETFNKQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(SEQ ID NO:10)；

(5)QETFNMQCQRRFYEALHDPNLNKEQRNARIRSIRDDC(SEQ ID NO:22)；

(6)QETFNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC(SEQ ID NO:23)；

(7)QETMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC(SEQ ID NO:51)；

(8)QETQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC(SEQ ID NO:52)；及

(9)QETCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC(SEQ ID NO:53)。

另一特定的实施方式中，针对抗体的亲和性多肽可以是被报道具有与人IgG的结合能力的由DCAWHLGELVWCT(SEQ ID NO:54)的氨基酸序列形成的肽Fc-III(WO2001/045746)的修饰肽(修饰Fc-III)。这样的修饰Fc-III例如为以下的多肽：

(10)QETRGNCAYHKGQLVWCTYH(SEQ ID NO:24)；及

(11)QETRGNCAYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:25)。

上述亲和性多肽的各氨基酸序列中间隔开的至少2个半胱氨酸残基可通过二硫键形成环状肽。或者，上述肽中，2个半胱氨酸中的硫醚基(sulfide group)可通过以下所示的含羰基的连接体连接。

[化学式17]

上述所示的含羰基的连接体的虚线部分表示与硫醚基的结合部分。该连接体对于还原反应等比通常的二硫键更稳定。这样的肽可通过例如国际公开第2016/186206号中所记载的方法制备。

具有这样的特定结构的新型肽可用于人IgG Fc中基于Eu numbering的Lys248残基或Lys246残基、或者除Lys248残基或Lys246残基以外的其他氨基酸残基的位置选择性修饰(实施例)。构成上述肽的氨基酸为L体或D体中的任一种，但较好是L体(实施例中构成肽的氨基酸残基全部为L体)。

上述肽可通过交联剂对特定氨基酸残基进行了修饰。作为这样的特定氨基酸残基，可列举例如赖氨酸残基、天冬氨酸残基和谷氨酸残基，较好是赖氨酸残基。作为交联剂，可列举例如：DSG(disuccinimidyl glutarate、双琥珀酰亚胺戊二酸酯)、DSS(disuccinimidyl suberate、双琥珀酰亚胺辛二酸酯)等的优选包含2个以上的琥珀酰亚胺基的交联剂，DMA(dimethyl adipimidate·2HCl、二亚胺代己二酸二甲酯二盐酸盐)、DMP(dimethyl pimelimidate·2HCl、庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、及DMS(dimethylsuberimidate·2HCl、辛二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)等的优选包含2个以上的亚氨酸部分的交联剂，以及DTBP(dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate·2HCl、3,3'-二硫代双丙亚氨酸二甲酯二盐酸盐)及DSP(dithiobis(succinimidyl propionate)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯))等的具有SS键的交联剂(例如国际公开第2016/186206号)。

关于上述肽，位于末端的氨基和羧基可被保护。作为N-末端氨基的保护基，可列举例如烷基羰基(酰基)(例如乙酰基、丙氧基、叔丁氧基羰基等丁氧基羰基)、烷氧基羰基(例如芴基甲氧基羰基)、芳氧基羰基、芳基烷基(芳烷基)氧基羰基(例如苄氧基羰基)。作为N-末端氨基的保护基，较好是乙酰基。作为C-末端羧基的保护基，可列举例如可形成酯或酰胺的基团。作为可形成酯或酰胺的基团，可列举例如烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基)、芳氧基(例如苯氧基、萘氧基)、芳烷基氧基(例如苄氧基)、氨基。作为C-末端羧基的保护基，较好是氨基。

1-3.连接体(L)

式(I)中，L为作为包含切割性部分的二价基团的切割性连接体。

以L表示的切割性连接体为包含切割性部分的二价基团。切割性部分是可通过在不会引起蛋白质的变性、分解(例如酰胺键的断裂)的条件(温和条件)下的特定处理进行切割的位点(部位)。因此，切割性部分可以是通过在温和条件下的特定的切割处理进行切割的位点(除酰胺键以外的键)。作为这样的特定处理，可列举例如：(a)采用选自酸性物质、碱性物质、还原剂、氧化剂、酶中的1种以上的物质的处理，(b)采用选自光的物理化学刺激进行的处理，或者(c)在使用包含可自体分解的切割性部分的切割性连接体的情况下进行的放置。这样的切割性连接体及其切割条件是该领域的技术常识(例如，G.Leriche，L.Chisholm，A.Wagner，Bioorganic&Medicinal Chemistry.20，571(2012)；Feng P.等，Jounal of American Chemical Society.132，1500(2010).；Bessodes M.等，Journal ofControlled Release，99，423(2004).；DeSimone，J.M.，Journal of American ChemicalSociety.132，17928(2010)；Thompson，D.H.，Journal of Controlled Release，91，187(2003)；Schoenmarks，R.G.，Journal of Controlled Release，95，291(2004))。作为这样的切割性部分，可列举例如二硫残基、缩醛残基、缩酮残基、酯残基、氨甲酰基残基、烷氧基烷基残基、亚胺残基、叔烷基氧基氨基甲酸酯残基(例如叔丁基氧基氨基甲酸酯残基)、硅烷残基、含有腙的残基(例如腙残基、酰基腙残基、双芳基腙残基)、氨基磷酸酯残基、乌头酰基残基、三苯甲基残基、偶氮残基、邻二醇残基、硒残基、含有具有吸电子基团的芳环的残基、含有香豆素的残基、含有砜的残基、含有不饱和键的链残基、糖基残基。

具有吸电子基团的芳环基较好是具有选自芳基、芳烷基、芳香族杂环基、具有芳香族杂环基的烷基中的芳环基的基团，更好是芳烷基、具有芳香族杂环基的烷基。吸电子基团较好是结合于环的2位。更优选地，含有具有吸电子基团的芳环的残基例如为在2位具有吸电子基团的芳烷基(例如苄基)。作为吸电子基团，可列举例如卤素原子、被卤素原子取代的烷基(例如三氟甲基)、硼酸残基、甲磺酰基、甲苯磺酰基、三氟甲磺酸盐或酯(三氟甲磺酰基)、硝基、氰基、苯基、酮基(例如酰基)。

作为与切割性部分的残基的名称相关被用作接头词、接尾词等术语的烷基、酰基(即，烷基羰基)、烷氧基(即，烷基氧基)、芳基、芳烷基等基团的定义、例子及优选例与后述相同。

作为酯残基，可列举例如：由碳原子和氧原子构成的通常的酯残基[例如烷基酯(例如叔丁氧基羰基等叔烷基氧基羰基)、芳基酯(例如苯甲酰甲基酯、2-(二苯基膦)苯甲酸酯)、糖基酯残基、原酸酯残基]、含硫原子和氧原子的酯残基(例如α-硫代苯基酯残基、烷硫基酯残基等硫酯残基)、含磷原子和氧原子的酯残基(例如磷酸二酯残基、磷酸三酯残基)、活性酯残基(例如N-羟基琥珀酰亚胺残基)。

作为含有砜的残基，可列举例如砜残基、喹啉基苯磺酸酯残基。

硅烷残基较好是具有选自烷基、芳基、芳烷基和烷氧基中的基团的硅烷残基。作为这样的硅烷残基，可列举例如二烷基二烷氧基硅烷残基(例如二甲基二烷氧基硅烷、二乙基二烷氧基硅烷)、或者二芳基二烷氧基硅烷残基(例如二苯基二烷氧基硅烷)。

作为烷氧基烷基(即烷基氧基烷基)残基，是将后述的烷氧基和烷基组合而得的基团(烷氧基和烷基的定义、例子和优选例与后述相同)，可列举例如甲氧基甲基残基、乙氧基甲基残基、甲氧基乙基残基、乙氧基乙基残基，但并不仅限于这些例子。

含有不饱和键的链残基是包含仅由碳原子形成的不饱和键部分的残基(例如作为具有碳原子间双键的最小单元的乙烯基(vinyl/ethenyl)、或者作为具有碳原子间三键的最小单元的乙炔基(acetylenyl/ethynyl))、或者包含由碳原子和杂原子(例如氮原子、硫原子、氧原子)形成的不饱和键部分(例如醛、氰基)的残基。作为含有不饱和键的链残基，可列举例如乙烯基醚残基、氰基乙基残基、乙烯残基、丙二醛残基。

作为酸性物质(也称为亲电子试剂)，可列举例如盐酸、硫酸、硝酸等无机酸性物质，以及甲酸、乙酸、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪丙磺酸、3-吗啉丙磺酸、磷酸二氢钠、柠檬酸、十二烷基硫酸、N-十二烷酰基肌氨酸、三氟乙酸等有机酸性物质。作为可通过酸性物质进行切割的位点，可列举例如烷氧基芳基烷基残基、叔烷基氧基氨基甲酸酯残基、缩醛残基、硅烷残基、亚胺残基、乙烯基醚残基、β-硫代丙酸酯残基、三苯甲基残基、腙残基、乌头酰基残基、原酸酯残基、氨甲酰基残基、2-(二苯基膦)苯甲酸酯残基。

作为碱性物质(也称为亲核试剂)，可列举例如氢氧化钠、氢氧化钾、乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵等无机碱性物质，以及羟胺、三乙胺、N,N'-二异丙基胺等有机碱性物质。作为可通过碱性物质进行切割的位点，可列举例如硅烷残基、氰基乙基残基、砜残基、乙烯残基、糖基二琥珀酸酯残基、α-硫代苯基酯残基、不饱和乙烯基硫醚残基、丙二醛残基、酰基腙残基、烷硫基酯残基。

作为还原剂，可列举例如半胱氨酸、二硫苏糖醇、还原型谷胱甘肽、β-巯基乙醇。作为可通过还原剂进行切割的位点，可列举例如二硫残基、烷氧基烷基残基、偶氮残基。

作为氧化剂，可列举例如高碘酸钠、氧化型谷胱甘肽。作为可通过氧化剂进行切割的位点，可列举例如邻二醇残基、硒残基。

作为酶，可列举例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、TEV、凝血酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、半胱天冬酶、蛋白酶、基质金属蛋白酶、脂肪酶、内切糖苷酶、肽N-糖苷酶F(PNGase F)。作为可通过酶进行切割的位点(部位)，可列举例如酯残基、磷酸二酯残基、糖基残基。

作为可通过光进行切割的位点，可列举例如2-硝基苄基残基、苯甲酰甲基酯残基、8-喹啉苯磺酸酯残基、香豆素残基、磷酸三酯残基、双芳基腙残基、Biman二硫代丙酸残基(Bimandithiopropionic acid residue)。

作为自分解性的切割性部分，可列举例如活性酯残基(例如N-羟基琥珀酰亚胺残基)。

更具体来说，切割性部分可对应于选自下述组中的任一化学结构；

[化学式18]

在此，与键正交的波浪线表示切割位点，

多个R

J为-CH

r为1～4的任意的整数，

○(白色圆)表示与A(或后述的La)结合的键，●(黑色圆)表示与B(或后述的Lb)结合的键，化学结构以切割位点为中心呈不对称的情况下，可以是●表示与A(或后述的La)结合的键，○表示与B(或后述的Lb)结合的键。

J为-CH

r为1～4的任意的整数，较好是1～3的任意整数，更好是1或2。

一个实施方式中，切割性连接体可以是：

(i)切割性连接体，该切割性连接体是包含切割性部分的二价基团，该切割性部分具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力；或者

(ii)切割性连接体，该切割性连接体是包含切割性部分的二价基团，该切割性部分不具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力。

作为(i)的切割性部分，可列举例如二硫残基、酯残基、缩醛残基、缩酮残基、亚胺残基、邻二醇残基。

更具体来说，(i)的切割性部分可对应于例如选自下述组中的任一化学结构；

[化学式19]

在此，与键正交的波浪线表示切割位点，

多个R

○(白色圆)表示与A(或后述的La)结合的键，●(黑色圆)表示与B(或后述的Lb)结合的键，化学结构以切割位点为中心呈不对称的情况下，可以是●表示与A(或后述的La)结合的键，○表示与B(或后述的Lb)结合的键。

作为(ii)的切割性部分，可列举例如酯残基、氨甲酰基残基、烷氧基烷基残基、亚胺残基、叔烷基氧基氨基甲酸酯残基、硅烷残基、含有腙的残基、氨基磷酸酯残基、乌头酰基残基、三苯甲基残基、偶氮残基、邻二醇残基、硒残基、含有具有吸电子基团的芳环的残基、含有香豆素的残基、含有砜的残基、含有不饱和键的链残基、糖基残基。

更具体来说，(ii)的切割性部分可对应于例如选自下述组中的任一化学结构；

[化学式20]

在此，与键正交的波浪线表示切割位点，

多个R

○(白色圆)表示与A(或后述的La)结合的键，●(黑色圆)表示与B(或后述的Lb)结合的键，化学结构以切割位点为中心呈不对称的情况下，可以是●表示与A(或后述的La)结合的键，○表示与B(或后述的Lb)结合的键。

特定的实施方式中，切割性连接体(L)可以下述式(L1)～(L3)中的任一个表示；La-C-Lb (L1)

La-C (L2)

C-Lb (L3)

式中，

La和Lb分别为二价基团，

C为切割性部分。

作为二价基团，可列举例如：可具有取代基的二价烃基、可具有取代基的二价杂环基、-C(＝O)-、-NR

作为二价烃基，是直链、支链或环状的二价烃基，较好是直链或支链的二价烃基。作为二价烃基，可列举亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基。

作为亚烷基，较好是碳原子数1～12的亚烷基，更好是碳原子数1～6的亚烷基，特别好是碳原子数1～4的亚烷基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。亚烷基可以是直链、支链或环状中的任一种，较好是直链的亚烷基。作为这样的亚烷基，可列举例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基。

作为亚烯基，较好是碳原子数2～12的亚烯基，更好是碳原子数2～6的亚烯基，特别好是碳原子数2～4的亚烯基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。亚烯基可以是直链、支链或环状中的任一种，较好是直链的亚烯基。作为这样的亚烯基，可列举例如亚乙烯基、亚丙烯基、亚丁烯基、亚戊烯基、亚己烯基。

作为亚炔基，较好是碳原子数2～12的亚炔基，更好是碳原子数2～6的亚炔基，特别好是碳原子数2～4的亚炔基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。亚炔基可以是直链、支链或环状中的任一种，较好是直链的亚炔基。作为这样的亚炔基，可列举例如亚乙炔基、亚丙炔基、亚丁炔基、亚戊炔基、亚己炔基。

作为亚芳基，较好是碳原子数6～24的亚芳基，更好是碳原子数6～18的亚芳基，进一步更好是碳原子数6～14的亚芳基，再进一步更好是碳原子数6～10的亚芳基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。作为亚芳基，可列举例如亚苯基、亚萘基、亚蒽基。

二价杂环基是二价芳香族杂环基或者二价非芳香族杂环基。作为构成杂环的杂原子，较好是包括选自氧原子、硫原子、氮原子、磷原子、硼原子和硅原子中的1种以上，更好是包括选自氧原子、硫原子和氮原子中的1种以上。

作为二价芳香族杂环基，较好是碳原子数1～21的二价芳香族杂环基，更好是碳原子数1～15的二价芳香族杂环基，进一步更好是碳原子数1～9的二价芳香族杂环基，再进一步更好是碳原子数1～6的二价芳香族杂环基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。更具体来说，作为二价芳香族杂环基，可列举例如：吡咯二基、呋喃二基、噻吩二基、吡啶二基、哒嗪二基、嘧啶二基、吡嗪二基、三嗪二基、吡唑二基、咪唑二基、噻唑二基、异噻唑二基、噁唑二基、异噁唑二基、三唑二基、四唑二基、吲哚二基、嘌呤二基、蒽醌二基、咔唑二基、芴二基、喹啉二基、异喹啉二基、喹唑啉二基和酞嗪二基。

作为二价非芳香族杂环基，较好是碳原子数2～21的非芳香族杂环基，更好是碳原子数2～15的非芳香族杂环基，进一步更好是碳原子数2～9的非芳香族杂环基，再进一步更好是碳原子数2～6的非芳香族杂环基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。更具体来说，作为二价非芳香族杂环基，可列举例如：吡咯二酮二基、吡咯啉二酮二基、氧杂环丙烷二基、氮丙啶二基、氮杂环丁烷二基、氧杂环丁烷二基、硫杂环丁烷二基、吡咯烷二基、二氢呋喃二基、四氢呋喃二基、二氧戊环二基、四氢噻吩二基、吡咯啉二基、咪唑烷二基、噁唑烷二基、哌啶二基、二氢吡喃二基、四氢吡喃二基、四氢噻喃二基、吗啉二基、硫代吗啉二基、吡嗪二基、二氢噁嗪二基、四氢噁嗪二基、二氢嘧啶二基及四氢嘧啶二基。

以La和Lb表示的二价基团可具有例如1～5个、较好是1～3个、更好是1或2个取代基。这样的取代基与以上述R

(i)卤素原子，

(ii)一价烃基，

(iii)芳烷基，

(iv)一价杂环基，

(v)R

(vii)硝基、硫酸基、磺酸基、氰基和羧基。

作为卤素原子，可列举例如氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。

作为一价烃基，可列举例如一价链状烃基、一价脂环族烃基及一价芳香族烃基。

一价链状烃基是指仅由链状结构构成的烃基，主链不含环状结构。其中，链状结构可以是直链状，也可以是支链状。作为一价链状烃基，可列举例如烷基、烯基、炔基。烷基、烯基及炔基可以是直链状或支链状中的任一种。

作为烷基，较好是碳原子数1～12的烷基，更好是碳原子数1～6的烷基，进一步更好是碳原子数1～4的烷基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数1～12的烷基，可列举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基。

作为烯基，较好是碳原子数2～12的烯基，更好是碳原子数2～6的烯基，进一步更好是碳原子数2～4的烯基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数2～12的烯基，可列举例如乙烯基、丙烯基、正丁烯基。

作为炔基，较好是碳原子数2～12的炔基，更好是碳原子数2～6的炔基，进一步更好是碳原子数2～4的炔基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数2～12的炔基，可列举例如乙炔基、丙炔基、正丁炔基。

作为一价链状烃基，较好是烷基。

作为一价脂环族烃基，是指作为环结构仅含脂环族烃且不含芳香族环的烃基，脂环族烃可以是单环、多环中的任一种。其中，不需要仅由脂环族烃构成，其一部分可含链状结构。作为一价脂环族烃基，可列举例如环烷基、环烯基、环炔基，这些基团可以是单环、多环中的任一种。

作为环烷基，较好是碳原子数3～12的环烷基，更好是碳原子数3～6的环烷基，进一步更好是碳原子数5～6的环烷基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数3～12的环烷基，可列举例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基。

作为环烯基，较好是碳原子数3～12的环烯基，更好是碳原子数3～6的环烯基，进一步更好是碳原子数5～6的环烯基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数3～12的环烯基，可列举例如环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基。

作为环炔基，较好是碳原子数3～12的环炔基，更好是碳原子数3～6的环炔基，进一步更好是碳原子数5～6的环炔基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数3～12的环炔基，可列举例如环丙炔基、环丁炔基、环戊炔基、环己炔基。

作为一价脂环族烃基，较好是环烷基。

一价芳香族烃基是指含芳环结构的烃基。其中，不需要仅由芳环构成，其一部分可含链状结构或脂环族烃，芳环可以是单环、多环中的任一种。作为一价芳香族烃基，较好是碳原子数6～12的芳基，更好是碳原子数6～10的芳基，进一步更好是碳原子数6的芳基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。作为碳原子数6～12的芳基，可列举例如苯基、萘基。

作为一价芳香族烃基，较好是苯基。

其中，作为一价烃基，较好是烷基、环烷基、芳基，更好是烷基。

芳烷基是指芳基烷基。芳基烷基中的芳基和烷基的定义、例子和优选例如上所述。作为芳烷基，较好是碳原子数3～15的芳烷基。作为这样的芳烷基，可列举例如苯甲酰基、苯乙基、萘甲基、萘乙基。

一价杂环基是指从杂环式化合物的杂环除去1个氢原子而得的基团。一价杂环基是一价芳香族杂环基或者一价非芳香族杂环基。作为构成杂环基的杂原子，较好是包括选自氧原子、硫原子、氮原子、磷原子、硼原子和硅原子中的1种以上，更好是包括选自氧原子、硫原子和氮原子中的1种以上。

作为一价芳香族杂环基，较好是碳原子数1～15的芳香族杂环基，更好是碳原子数1～9的芳香族杂环基，进一步更好是碳原子数1～6的芳香族杂环基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。作为一价芳香族杂环基，可列举例如：吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吲哚基、嘌呤基、蒽醌基、咔唑基、芴基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基和酞嗪基。

作为一价非芳香族杂环基，较好是碳原子数2～15的非芳香族杂环基，更好是碳原子数2～9的非芳香族杂环基，进一步更好是碳原子数2～6的非芳香族杂环基。上述碳原子数不包括取代基的碳原子数。作为一价非芳香族杂环基，可列举例如：氧杂环丙烷基、氮丙啶基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、吡咯烷基、二氢呋喃基、四氢呋喃基、二氧戊环基、四氢噻吩基、吡咯啉基、咪唑烷基、噁唑烷基、哌啶基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、吗啉基、硫代吗啉基、哌嗪基、二氢噁嗪基、四氢噁嗪基、二氢嘧啶基及四氢嘧啶基。

其中，作为一价杂环基，较好是5元或6元的杂环基。

优选地，取代基可以是以下的基团：

(i')卤素原子，

(ii')碳原子数1～12的烷基、苯基或萘基，

(iii')碳原子数3～15的芳烷基，

(iv')5元或6元的杂环，

(v')R

(vi')NR

(vii')与上述(vii)中列举的基团相同的基团。

更优选地，取代基可以是以下的基团：

(i”)卤素原子，

(ii”)碳原子数1～12的烷基，

(iii”)R

(iv”)NR

(v”)与上述(vii)中列举的基团相同的基团。

进一步更优选地，取代基可以是以下的基团：

(i”')卤素原子，

(ii”')碳原子数1～6的烷基，

(iii”')R

(iv”')NR

(v”')与上述(vii)中列举的基团相同的基团。

特别优选地，取代基可以是以下的基团：

(i””)卤素原子，

(ii””)碳原子数1～4的烷基，

(iii””)R

(iv””)NR

(v””)与上述(vii)中列举的基团相同的基团。

特定的实施方式中，La和Lb可分别以下述(La')和(Lb')表示；

[化学式21]

式中，

p和p'相同或不同，为0～10的任意的整数，

q和q'相同或不同，为0～10的任意的整数，

X和X'相同或不同，为碳原子、氮原子或单键(在此，X为氮原子的情况下，R

R

p和p'相同或不同，为0～10的任意整数，较好是0～8的整数，更好是0～6的整数，进一步更好是0～4的整数，特别好是0、1或2。较好是p和p'相同。

q和q'相同或不同，为0～10的任意整数，较好是0～8的整数，更好是0～6的整数，进一步更好是0～4的整数，特别好是0、1或2。较好是q和q'相同。

X和X'相同或不同，为碳原子、氮原子或单键，较好是碳原子或单键。较好是X和X'相同。

R

1-4.(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团(B)

式(I)中，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团。

生物正交性官能团是指不会与生物构成成分(例如氨基酸、核酸、脂质、糖、磷酸)反应，或者与生物构成成分的反应速度慢，但选择性地与除生物构成成分以外的成分反应的基团。生物正交性官能团在该技术领域中周知(参照例如Sharpless K.B.等，Angew.Chem.Int.Ed.40，2004(2015)；Bertozzi C.R.等，Science 291，2357(2001)；BertozziC.R.等，Nature Chemical Biology 1，13(2005))。

亲和性物质的目标为抗体的情况下，生物正交性官能团是针对蛋白质的生物正交性官能团。针对蛋白质的生物正交性官能团是指不与构成蛋白质的天然的20种氨基酸残基的侧链反应，而与规定的官能团反应的基团。构成蛋白质的天然的20种氨基酸为丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、缬氨酸(V)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、及赖氨酸(L)。这些天然的20种氨基酸中，无侧链(即为氢原子)的甘氨酸以及侧链为烃基(即，侧链不含选自硫原子、氮原子和氧原子中的杂原子)的丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及缬氨酸对于通常的反应呈惰性。因此，针对蛋白质的生物正交性官能团是，与“具有对于通常的反应呈惰性的侧链的这些氨基酸的侧链”不会发生反应，并且与天冬酰胺、谷氨酰胺、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸及赖氨酸的侧链也不会发生反应的官能团。

作为与蛋白质不会发生反应的这样的生物正交性官能团，可列举例如：叠氮残基、醛残基、硫醇残基、烯烃残基(换言之，具有作为具有碳原子间双键的最小单元的乙烯基部分即可，下同)、炔烃残基(换言之，具有作为具有碳原子间三键的最小单元的乙炔基部分即可，下同)、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯基、α-卤化羰基残基(例如在α位具有氟原子、氯原子、溴原子或碘原子的羰基残基，下同)、异腈残基、斯德酮残基、硒残基。作为蛋白质，存在可含游离的巯基(thiol)(半胱氨酸)的蛋白质(例如除抗体以外的蛋白质)和不会含游离的巯基的蛋白质(例如抗体)。不会含游离的巯基的蛋白质中，巯基可起到生物正交性官能团的作用。因此，作为亲和性物质的目标为不会含游离的巯基的抗体，因而生物正交性官能团中包含巯基。可1种或2种以上(例如2种、3种、4种)生物正交性官能团含于二价基团，较好是1种生物正交性官能团含于二价基团。

一个实施方式中，包含生物正交性官能团的二价基团可以是：在主链中包含选自叠氮残基、醛基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基中的生物正交性官能团的二价基团。

另一个实施方式中，包含生物正交性官能团的二价基团可以是：在侧链中包含选自叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基中的生物正交性官能团的二价基团。

更具体来说，生物正交性官能团可对应于选自下述组中的任一化学结构；

[化学式22]

式中，

R

·表示结合键。

作为吸电子基团，可列举例如上述的例子，较好是卤素原子、硼酸残基、甲磺酰基、甲苯磺酰基、三氟甲磺酸盐或酯。

一个实施方式中，B可以是(a)包含生物正交性官能团的二价基团。二价基团所含的生物正交性官能团的数量为一个或多个，例如为1～5个，较好是1～3个，更好是1或2个，进一步更好是1个。二价基团所含的生物正交性官能团的数量为多个的情况下，多个生物正交性官能团可以为同种，也可以为不同种，但从采用简单的结构等的观点来看，较好是同种。

特定的实施方式中，B可以是(a1)在主链中包含生物正交性官能团的二价基团。在主链中包含生物正交性官能团的二价基团为：将选自叠氮残基、醛基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基中的生物正交性官能团作为二价基团的基团，或者在这样的二价生物正交性官能团的任一方的末端或两端连接有上述的二价基团的基团。待连接的二价基团的定义、例子和优选例与上述的二价基团相同。

另一特定的实施方式中，B可以是(a2)在侧链中包含生物正交性官能团的二价基团。在侧链中包含生物正交性官能团的二价基团为：被选自叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基中的生物正交性官能团或者包含其的基团取代的二价基团。待取代的二价基团的定义、例子和优选例与上述的二价基团相同。

另一个实施方式中，B可以是(b)不含生物正交性官能团的二价基团。这样的二价基团可以是：可取代的亚烷基、可取代的亚环烷基、可取代的芳基、可取代的二价杂环基、-NR

关于除生物正交性官能团以外的取代基，烷基、环烷基、芳烷基、一价杂环基的定义、例子和优选例如上所述。

关于除生物正交性官能团以外的取代基，烷基氧基(烷氧基)中的烷基、环烷氧基中的环烷基和芳烷氧基中的芳烷基的定义、例子和优选例如上所述。更具体来说，作为烷氧基，可列举例如甲氧基、乙氧基、丙氧基(例如正丙氧基、异丙氧基)、丁氧基(例如正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基)、戊氧基(例如正戊氧基)、己氧基(例如正己氧基)。作为环烷基氧基，可列举例如环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。作为芳烷基氧基，可列举例如苯甲氧基、苯乙氧基、萘甲氧基、萘乙氧基。

不含生物正交性官能团的二价基团还可以是对反应高度惰性的基团。因此，这样的二价基团可以是仅由碳原子和氢原子构成的基团。这样的二价基团是亚烷基、亚环烷基或芳基以及这些基团中的2个以上(例如2或3个)的组合。不含生物正交性官能团的二价基团为对反应高度惰性的基团的情况下，这样的二价基团可具有选自亚烷基、亚环烷基和芳基中的取代基作为对反应高度惰性的取代基。对反应高度惰性的取代基的数量例如为1～5个，较好是1～3个，更好是1或2个。

特定的实施方式中，B可以下述式(B-1)表示；

[化学式23]

式中，

Y为-NH-、-O-、-CH

[化学式24]

(式(B-2)中，

V和V'相同或不同，为-NH-、-O-、-CH

V1为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

s为0～10的任意的整数，

式(B-2)中的○和●分别为与式(B-1)中的○和●同样的取向)，

Z为氧原子、硫原子或氢原子(Z为氢原子的情况下，-C(＝Z)-表示-CH

式(B-1)中的○(白色圆)表示与L侧的部分结合的键，●(黑色圆)表示与R侧的部分结合的键。

Y为-NH-、-O-、-CH

Z为氧原子、硫原子或氢原子，较好是氧原子或硫原子。

V和V'为-NH-、-O-、-CH

V1为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团。这样的二价基团与上述的基团相同。

较好的是，V1中的二价基团为可取代的二价烃基或者可取代的二价杂环基。二价烃基的定义、例子及优选例与上述相同，V1的情况下，较好是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、亚芳基。例如，未被含有生物正交性官能团的部分取代的情况下，较好是亚烯基、亚炔基、亚环烯基、亚环炔基。另一方面，被含有生物正交性官能团的部分取代的情况下，较好是亚烷基、亚环烷基、亚芳基。这些基团的例子和优选例如上所述。二价杂环基的定义、例子及优选例与上述相同，V1的情况下，较好是5元或6元的杂环基。5元或6元的杂环基的例子及优选例与上述相同。取代基的定义、例子和优选例如上所述。V1可具有例如1～5个、较好是1～3个、更好是1个或2个、进一步更好是1个的(a)生物正交性官能团。二价基团所含的生物正交性官能团的数量为多个的情况下，多个生物正交性官能团可以为同种，也可以为不同种。从采用简单的结构和提高反应性等观点来看，较好是同种。从确保差异化的反应等观点来看，较好是不同种。V1还可具有1～5个、较好是1～3个、更好是1或2个的(b)取代基。

s为0～10的任意整数，较好是0～8的整数，更好是0～6的整数，进一步更好是0～4的整数，特别好是0、1或2。

另外，特定的实施方式中，V1可以是具有以下述式(B-3)表示的基团作为侧链的二价基团；

[化学式25]

式中，

G和G'相同或不同，为-NH-、-O-、-CH

[化学式26]

式(B-4)中，

W和W'相同或不同，为-NH-、-O-、-CH

W1为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

t为0～10的任意的整数，

式(B-4)中的○(白色圆)表示对于式(B-3)中的键(·)的方向的键(结合)，●(黑色圆)表示对于b侧方向的键；

H为-CH

I为二价烃基、二价杂环或单键；

b为下述所示的任一基团，

[化学式27]

式中，

R

·表示结合键。这样的二价基团是二价烃基或二价杂环基，较好是可取代的二价烃基，更好是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基或亚芳基，进一步更好是亚烷基、亚环烷基或亚芳基，特别好是亚烷基。这些基团的例子和优选例如上所述。这些基团可被除上述侧链以外的取代基取代。这样的取代基的数量为1～5个，较好是1～3个，更好是1或2个。取代基的例子和优选例如上所述。

G和G'相同或不同，为-NH-、-O-、-CH

H为-CH

I为二价烃基、二价杂环或单键。二价烃基和二价杂环可被取代基取代，也可未被取代。二价烃基、二价杂环和取代基的定义、例子及优选例与以上的V1中记载的相同。

W和W'相同或不同，为-NH-、-O-、-CH

W1为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团。这样的二价基团与上述的相同。

t为0～10的任意整数，较好是0～8的整数，更好是0～6的整数，进一步更好是0～4的整数，特别好是0、1或2。

1-5.反应性基团(R)

式(I)中，R为针对抗体的反应性基团。这样的反应性基团在该技术领域中是技术常识。

反应性基团是与生物正交性官能团同种或不同种的基团。

例如，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团的情况下，反应性基团可以是与该生物正交性官能团不同种的基团。这是因为如果反应性基团是与生物正交性官能团同种的基团，则无法确保针对抗体的反应性基团的反应特异性。此外原因还在于，原本生物正交性官能团就是不会与构成抗体的天然的20种氨基酸残基的侧链发生反应的基团。

更具体来说，构成蛋白质的如上所述的天然的20种氨基酸中，无侧链的甘氨酸、以及侧链为烃基的丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及缬氨酸对于通常的反应呈惰性。因此，针对蛋白质的反应性基团是可与天冬酰胺、谷氨酰胺、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸及赖氨酸这14种氨基酸中的任意1种或2种以上(例如2种、3种、4种)的侧链反应的基团。根据蛋白质的氨基酸组成等条件，以式(I)表示的化合物中可包含1种或2种以上(例如2种、3种、4种)的反应性基团，较好是以式(I)表示的化合物中可包含1种反应性基团。

优选地，反应性基团为可与构成蛋白质的如上所述的14种氨基酸中的任意1种氨基酸的侧链反应的基团。

更优选地，反应性基团可以是对于赖氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸中的任意1种氨基酸的侧链具有特异性的反应性基团。

进一步更优选地，反应性基团可以是对于赖氨酸、酪氨酸或色氨酸中的任意1种氨基酸的侧链具有特异性的反应性基团。

此外，蛋白质为人IgG1等人IgG的情况下，反应性基团较好是对于赖氨酸或酪氨酸的侧链具有特异性的反应性基团。

对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团是可与存在于赖氨酸残基的侧链中的氨基(NH

作为通过“对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的上述的反应性基团”与“存在于赖氨酸残基的侧链中的氨基(NH

更具体来说，对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团可对应于选自下述组中的任一化学结构；

[化学式28]

在此，

R

R

j为1～5的任意的整数，

k为1～4的任意的整数。

R

R

j为1～5的任意的整数，较好是1～3的整数，更好是1或2。

k为1～4的任意的整数，较好是1～3的整数，更好是1或2。

通过“作为对于赖氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团的上述化学结构”与“存在于赖氨酸的侧链中的氨基(NH

[化学式29]

在此，●(黑色圆)表示与T侧的部分结合的键，○(白色圆)表示与B侧的部分结合的键，与键正交的直线表示通过反应而生成的键。

对于酪氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团是可与存在于酪氨酸残基的侧链中的酚式羟基(OH)的邻位原子特异性反应的基团，可列举例如重氮残基、偶氮二甲酸酯残基、2,3-二氢-1H-吡嗪-6-酮残基。

更具体来说，对于酪氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团可对应于选自下述组中的任一化学结构；

[化学式30]

在此，R

R

通过“作为对于酪氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团的上述化学结构”与“存在于酪氨酸残基的侧链中的酚式羟基(OH)的邻位原子”之间的反应而生成的连接部分，可对应于选自下述组中的任一化学结构；

[化学式31]

在此，R

R

对于色氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团是可与存在于色氨酸残基的侧链中的吲哚基的3位的成环原子特异性反应的基团，可列举例如9-氮杂双环[3.3.1]壬-3-酮-N-氧基自由基残基。

更具体来说，对于色氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团可对应于选自下述组中的任一化学结构；

[化学式32]

在此，○表示与B结合的键。

通过“作为对于色氨酸残基的侧链具有特异性的反应性基团的上述化学结构”与“存在于色氨酸残基的侧链中的吲哚基的3位的成环原子”之间的反应而生成的连接部分，可对应于选自下述组中的任一化学结构；

[化学式33]

在此，●表示与T结合的键，○表示与B结合的键。

特别优选地，反应性基团可以是对于赖氨酸的侧链具有特异性的反应性基团。

1-6.部分结构“L-B”1-6-1.连接A和R的部分结构“L-B”中的主链的长度式(I)中，连接A(亲和性物质)和R(反应性基团)的主链(L-B中的直链部分)的长度，可根据抗体和亲和性物质的种类、及抗体中的亲和性物质的目标部位与R欲反应结合的如上所述的靶区(例如特定位置)中的特定氨基酸残基的位置及数量的关系等各种因素而适当进行设计。关于以式(I)表示的化合物，亲和性物质与抗体缔合，接着，介以L-B与亲和性物质共价结合的反应性基团通过与存在于上述目标部位附近的特定氨基酸残基的侧链中的基团(例如赖氨酸残基的侧链中的氨基)反应，从而与抗体共价结合。这时，R欲反应结合的特定氨基酸残基的附近区域、上述目标部位的附近区域、及该特定氨基酸残基与上述目标部位之间的区域中不另外存在该特定氨基酸残基的情况下，即使不严格控制主链的长度，反应性基团也可与该特定氨基酸侧链位置选择性地结合。当然，即使是这样的区域中另外存在该特定氨基酸残基的情况下，通过控制主链的长度，反应性基团也可与该特定氨基酸残基位置选择性地结合。

连接A和R的主链的长度可根据抗体及针对其的亲和性物质的种类、以及抗体中的目标部位中的特定氨基酸残基的位置及数量的关系等因素而改变，可以是约

另外，关于原子间的长度(距离)的关系，如下表所示的内容为该技术领域中的技术常识。因此，如果是本领域技术人员，可将下表的原子间的长度作为参考，适当设计具有与如上所述的主链的长度

[表1]

表1.直链亚烷基中的两末端的碳原子间的长度(距离)的关系

更具体来说，连接A和R的主链的长度也可按照构成主链(除氢原子及取代基外)的原子数规定。构成主链的原子数例如可以是4个(约

主链为不含环结构的结构的情况下，主链的原子数可通过计数链状结构中的原子数来决定。

另一方面，主链为含环结构的结构的情况下，主链的原子数与上述的长度并不一定对应，存在可根据主链的原子数规定的长度比上述的长度更短的倾向。即使是这样的情况下，从规定主链的长度的观点来看，可简便地计数主链的原子数。具体来说，这样的情况下的主链的原子数可通过在主链中不含二价环结构的链状结构中的原子数的基础上，再计数连通环结构中的2个键的最短路径的原子数来决定(参照例如以下的(a)～(d)中的粗体路径)；

[化学式34]

·表示结合键；

(a)的情况下，最短路径为粗体(粗体字)路径，因此作为主链的原子数计数的二价环结构中的原子数为2；

(b)的情况下，最短路径为粗体路径，因此作为主链的原子数计数的二价环结构中的原子数为3；

(c)的情况下，所有路径均为最短路径(等距离)，因此作为主链的原子数计数的二价环结构中的原子数为4；

(d)的情况下，稠合部位的路径为最短路径，因此作为主链的原子数计数的二价环结构中的原子数为4。

优选地，以L-B表示的A与R的连接部分(不包括侧链)可以是不含二价环结构的链状结构。该情况下，可按照以L-B表示的A与R的连接链部分中不含二价环基的条件适当设计L和B。

1-6-2.部分结构“L-B”的具体结构

上述式(I)中，L和B为可相互关联的结构。因此，上述式(I)中，L和B可作为以“L-B”表示的部分结构规定。

一个实施方式中，切割性连接体可以是(i)作为包含具有通过切割在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力的切割性部分的二价基团的切割性连接体、或者(ii)作为包含不具有通过切割在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力的切割性部分的二价基团的切割性连接体。

特定的实施方式中，L为上述(i)的切割性连接体的情况下，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团。

优选地，L为上述(i)的切割性连接体的情况下，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团。该情况下，(i)中所生成的生物正交性官能团与(a)中的生物正交性官能团可以为同种，也可以为不同种。从采用更简单的结构和/或提高对于单一的功能性物质的反应性等观点来看，(i)中所生成的生物正交性官能团可与(a)中的生物正交性官能团为同种。另一方面，从确保对于2种以上的功能性物质的差别化的反应性、以及不使用反应中的一部分生物正交性官能团等观点来看，(i)中所生成的生物正交性官能团可与(a)中的生物正交性官能团为不同种。

或者，L为上述(i)的切割性连接体的情况下，B可以是(b)不含生物正交性官能团的二价基团。该情况下，以式(I)表示的化合物或其盐具有更简单的结构，所以合成容易。

作为另一特定的实施方式中，L为上述(ii)的切割性连接体的情况下，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团。

特定的实施方式中，以L-B表示的部分结构较好是不含肽部分。该情况下，使用本发明的化合物得到的本发明的具有功能性物质的抗体(例如抗体药物复合物)具有不会包含可具有免疫原性的肽部分作为连接体的优点。

特定的实施方式中，以“L-B”表示的部分结构，将存在于连接A和R的主链(L-B中的直链部分)的中心位置的原子(例如构成主链的原子数为奇数的情况)、或者存在于该主链的中心位置的结合部位(例如构成主链的原子数为偶数的情况)作为基准，可具有对称结构[例如顺式(即Z)、反式(即E)]。例如，也可将存在于中心位置的结合部位设计为如上所述的切割连接体中的切割性部分。以“L-B”表示的部分结构具有对称结构的情况下，以“L-B”表示的部分结构可容易地合成。例如，可通过使在一侧末端具有能够反应而形成切割性部分的官能团的同样的二价基团(例如在一侧末端具有SH基的链状二价基团)相互反应，从而实现在主链的中心位置包含切割性部分的对称结构(链状的二价基团-S-S-链状的二价基团)。

因此，以“L-B”表示的部分结构可以是以“B2-L'-B1”表示的部分结构(即，L为以B2-L'表示的二价基团，B为B1)。该情况下，以上述式(I)表示的化合物可规定为以下述式(I')表示的化合物；

A-B2-L'-B1-R(I')

式中，

A和R与所述式(I)中相应符号的含义相同，

L'为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，B1和B2相同或不同，为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

B1和B2可具有以L'为中心的对称结构。

B1和B2相同或不同，与B的定义、例子和优选例相同。

特定的实施方式中，L'可以下述式(L1')～(L3')中的任一个表示；

La'-C'-Lb' (L1')

La'-C' (L2')

C'-Lb' (L3')

式中，

La'和Lb'分别为二价基团，

C'为切割性部分。

以La'和Lb'表示的二价基团分别与以La'和Lb'表示的二价基团的定义、例子和优选例相同。

以C'表示的切割性部分与以C表示的切割性部分的定义、例子和优选例相同。

另一特定的实施方式中，以L-B表示的结构单元可以下述式(LB')表示；

[化学式35]

式中，

C、p、p'、q、q'、X、X'、R

○(白色圆)表示与A结合的键，●(黑色圆)表示与R结合的键。

因此，上述式(I)可规定以下述式(I”)；

[化学式36]

式中，

A、R、C、p、p'、q、q'、X、X'、R

上述式(LB')和(I”)中，从C＝Z中的C(碳原子)至C＝Z'中的C(碳原子)的长度与连接A和R的主链的长度相同。这些式中，从C＝Z中的C至C＝Z'中的C的长度也可作为构成连接C＝Z中的C至C＝Z'中的C的部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)的原子数规定。这样的原子数与构成连接A和R的主链的原子数相同。连接C＝Z中的C至C＝Z'中的C的部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)可包含环结构，也可不包含环结构，但较好是不包含环结构。该连接链(除氢原子及取代基外)可优选不含肽部分。

1-7.制造方法

包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐可适当地进行制备。包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物以式(I)、较好是式(I')、更好是式(I”)表示。

作为亲和性物质，可适当选择具有任意的官能团的物质。因此，通过利用可与该官能团反应的反应性基团，使亲和性物质与以L-B-R表示的结构单元、或者以R-L-B-R表示的结构单元(2个反应性基团相同或不同)反应，可制备以A-L-B-R表示的结构单元。例如，这样的反应可在适当的反应体系、例如有机溶剂体系或水溶液体系中在适当温度(例如约15～200℃)下进行。反应体系可包含适当的催化剂。反应时间例如为1分钟～20小时，较好是10分钟～15小时，更好是20分钟～10小时，进一步更好是30分钟～8小时。

反应体系中，以L-B-R表示的结构单元、或者以R-L-B-R表示的结构单元(Y)相对于亲和性物质(X)的摩尔比(Y/X)，根据该结构单元及亲和性物质的种类、待通过该结构单元修饰的亲和性物质中的部位的数量等而变动，所以无特别限定，例如为0.1～50，较好是0.5～40，更好是1～35，进一步更好是2～25，特别好是3～15。

包含针对抗体的亲和性物质和切割性部分的抗体或其盐的生成的确认，虽也依赖于其具体的原料及产物的分子量，但可通过例如电泳法、色谱法(例如凝胶过滤层析法、离子交换色谱法、反相柱色谱法、HPLC)或质谱分析进行，较好是通过质谱分析进行。包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐可通过色谱法(例如上述的色谱法及亲和色谱法)等任意的方法适当纯化。

1-8.其他

后述的发明[例如式(II)～(v)及其下位概念的式以及部分结构式(例如(L1)～(L3)、(La')、(Lb')、(B-1)～(B-4))表示的发明]中，任意的符号(例如A、L、B、R)、以该符号表示的术语及它们的详细说明(例如定义、例子及优选例)与以上述式(I)表示的化合物或其盐的发明共通。此外，对于可规定后述发明的特定部分(例如切割性部分、具有通过切割在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力的部分)、特定基团(例如生物正交性官能团、二价基团、烷基、取代基、吸电子基团)及特定数值以及盐等任意的技术要素(例如定义、例子及优选例)，也可与上文中说明的内容共通。因此，在无特别说明的情况下，这些事项可在后述的发明中适当援引。同样地，后述的发明中记述的特定的发明的技术要素可作为本发明及其他发明的技术要素适当援引。

2.包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐

2-1.概要

本发明提供以式(II)表示的包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐；

A-L-B-R'-T (II)

式中，

A为针对抗体的亲和性物质，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，

T为抗体。

2-2.通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分(R')

通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分中，抗体及反应性基团的定义、例子及优选例如上所述。通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分在该技术领域中为技术常识，可根据抗体及反应性基团的种类适当决定。

优选地，通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分是通过抗体可包含的14种氨基酸(天冬酰胺、谷氨酰胺、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸及赖氨酸)中的任意1种氨基酸的侧链与针对其的反应性基团之间的反应而生成的部分。

更优选地，通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分可以是赖氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸中的任意1种氨基酸的侧链与对其具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分。

进一步更优选地，通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分可以是赖氨酸、酪氨酸或色氨酸中的任意1种氨基酸的侧链与对其具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分。作为通过赖氨酸、酪氨酸或色氨酸中的任意1种氨基酸的侧链与对其具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分，可列举例如上述“1-5.反应性基团(R)”中记述的连接部分和/或化学结构。

再进一步更优选地，通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分可以是赖氨酸或酪氨酸的侧链与对其具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分(特别是抗体为人IgG1等人IgG的情况)。作为通过赖氨酸或酪氨酸的侧链与对其具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分，可列举例如上述“1-5.反应性基团(R)”中记述的连接部分和/或化学结构。

特别优选地，通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分可以是赖氨酸的侧链与对其具有特异性的反应性基团之间的反应而生成的部分。

2-3.部分结构“L-B”

部分结构“L-B”的详细内容如上述“1-6.部分结构‘L-B’”中所述。

特定的实施方式中，以“L-B”表示的部分结构可以是以“B2-L'-B1”表示的部分结构(即，L为以B2-L'表示的二价基团，B为B1)。该情况下，以上述式(II)表示的包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐可以下述式(II')表示；

A-B2-L'-B1-R'-T (II')

式中，

A、R'和T与所述式(II)中相应符号的含义相同，

L'为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，B1和B2相同或不同，为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

B1和B2可具有以L'为中心的对称结构。

上述式(II')中，L'可以上述的式(L1')～(L3')中的任一个表示。

另一特定的实施方式中，以L-B表示的结构单元可以下述式(LB')表示；

[化学式37]

式中，

C、p、p'、q、q'、X、X'、R

○(白色圆)表示与A结合的键，●(黑色圆)表示与R'结合的键。

因此，上述式(II)可规定为下述式(II”)；

[化学式38]

式中，

A、R'、T、C、p、p'、q、q'、X、X'、R

上述式(LB')和(II”)中，从C＝Z中的C(碳原子)至C＝Z'中的C(碳原子)的长度与如上所述的连接A和R的主链的长度相同。这些式中，从C＝Z中的C至C＝Z'中的C的长度也可作为构成连接C＝Z中的C至C＝Z'中的C的部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)的原子数规定。这样的原子数与构成连接A和R的主链的原子数相同。连接C＝Z中的C至C＝Z'中的C的部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)可包含环结构，也可不含环结构，但较好是不含环结构。该连接链(除氢原子及取代基外)可优选不含肽部分。

2-4.抗体所具有的除抗体以外的部分结构的结合部位(位置选择性)

除抗体以外的部分结构(例如A-L-B-R')可位置选择性地与抗体(T)中的如上所述的靶区结合。

本说明书中，“位置选择性地”或“位置选择性”是指，尽管抗体中特定氨基酸残基未集中存在(偏在)于特定区域，可与抗体中的特定氨基酸残基结合的规定的结构单元却集中存在于抗体中的特定区域。因此，“位置选择性地具有”、“位置选择性的结合”、“基于位置选择性的结合”等与位置选择性相关的表述是指，“包含1个以上的特定氨基酸残基的靶区中的规定的结构单元的保有率或结合率”以显著的水平高于“包含与靶区中的该特定氨基酸残基同种的多个氨基酸残基的非靶区中的该结构单元的保有率或结合率”。这样的位置选择性的结合或保有，可通过能够使规定的结构单元不随机与抗体中的特定氨基酸残基反应，而使规定的结构单元优先与抗体中的靶区中的特定氨基酸残基反应的本发明来实现。

具体来说，T在由连续的1～50个氨基酸残基形成的靶区中包含1个以上的特定氨基酸残基且在除所述靶区以外的非靶区中包含5个以上的所述特定氨基酸残基的情况下，除抗体以外的部分结构可按照30％以上的位置选择性与该靶区中所含的1个以上的特定氨基酸残基结合。靶区及位置选择性的定义、例子和优选例如上所述。

2-5.抗体所具有的除抗体以外的部分结构的个数

抗体(T)所保有的除抗体以外的部分结构(例如A-L-B-R')的个数可变动。例如，T为包含多个单体蛋白质的多聚体蛋白质的情况下，T可在多个单体蛋白质中的对应的多个靶区中具有除T以外的部分结构。因而，T可具有多个除T以外的部分结构。因此，以式(II)、(II')或(II”)表示的结构，表示T可具有1个或多个除T以外的部分结构。T所具有的除T以外的部分结构的个数，可通过适当设定抗体的种类、及抗体与对其引入的结构单元的反应比例等条件来进行调节。这样的个数也根据抗体的种类而不同，例如可以是1～8个，较好是1～4个，更好是1或2个。

特定的实施方式中，抗体所保有的除抗体以外的部分结构的个数，在抗体为由多个单体蛋白质构成的多聚体蛋白质的情况下，可以是多个。如果采用本发明，可对于多个单体蛋白质的同一靶区引入多个除抗体以外的部分结构。

优选的实施方式中，抗体可以是包含多个重链的抗体。抗体的定义、例子和优选例如上所述。重链的个数根据抗体的种类而不同。例如，IgG、IgE和IgD可具有2个重链。IgA可具有2个或4个重链。IgM可具有8个重链。抗体(抗体)所保有的除抗体以外的部分结构的个数可作为与DAR同义的参数进行考虑。本发明中，抗体所保有的除抗体以外的部分结构的个数，对于IgG、IgE和IgD可以是1个或2个(较好是2个)，对于IgA可以是1～4个(较好是4个)，对于IgM可以是1～8个(较好是8个)。

2-6.制造方法

本发明提供包括以下工序的包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的制造方法：

(A1)使包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐与抗体反应，生成包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐。

包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物以式(I)、较好是式(I')、更好是式(I”)表示。包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体以式(II)、较好是式(II')、更好是式(II”)表示。

包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐具有反应性基团，因此可与抗体反应。这样的反应可在不会引起蛋白质的变性、分解(例如酰胺键的断裂)的条件(温和条件)下适当进行。例如，这样的反应可在适当的反应体系例如缓冲液中在室温(例如约15～30℃)下进行。缓冲液的pH例如为5～9，较好是5.5～8.5，更好是6.0～8.0。缓冲液可包含适当的催化剂。反应时间例如为1分钟～20小时，较好是10分钟～15小时，更好是20分钟～10小时，进一步更好是30分钟～8小时。关于这样的反应的详细情况，可参照例如G.J.L.Bernardes等，Chem.Rev.，115，2174(2015)；G.J.L.Bernardes等，Chem.Asian.J.，4，630(2009)；B.G.Davies等，Nat.Commun.，5，4740(2014)；A.Wagner等，Bioconjugate.Chem.，25，825(2014)。

反应体系中，包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐(Y)相对于抗体(X)的摩尔比(Y/X)，根据包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物和抗体的种类、待通过包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物进行修饰的抗体中的部位的数量(例如DAR)等而变化，故无特别限定，例如为0.1～100，较好是0.5～80，更好是1～70、进一步更好是2～50，特别好是3～30。

包含针对抗体的亲和性物质和切割性部分的抗体或其盐的生成的确认，虽也依赖于其具体的原料及产物的分子量，但可通过例如电泳法、色谱法(例如凝胶过滤层析法、离子交换色谱法、反相柱色谱法、HPLC)或质谱分析进行，较好是通过质谱分析进行。位置选择性的确认例如可通过肽谱分析(peptide mapping)进行。关于肽谱分析，例如可通过蛋白酶(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)处理和质谱分析进行。作为蛋白酶，较好是胞内蛋白酶。作为这样的胞内蛋白酶，可列举例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Glu-C、Lys-N、Lys-C、Asp-N。抗体所具有的除抗体以外的部分结构的个数的确认可通过例如电泳法、色谱法或质谱分析进行，较好是通过质谱分析进行。包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐可通过色谱法(例如上述的色谱法及亲和色谱法)等任意的方法适当纯化。

3.具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐3-1.概要

本发明提供以下述式(III)表示的具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐；

A-L-B'(-F)-R'-T (III)

式中，

A为针对抗体的亲和性物质，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，

F为功能性物质，

R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，

T为抗体。

式(III)或其他式中，R'不为F，与B'共价结合。

3-2.功能性物质(F)

作为功能性物质，只要是赋予抗体任意功能的物质，则无特别限定，可列举例如药物、标记物质、稳定剂，较好是药物或标记物质。此外，功能性物质可以是单一的功能性物质，或者也可以是2个以上的功能性物质连接而成的物质。

作为药物，可以是针对任意疾病的药物。作为这样的疾病，可列举例如癌症(例如肺癌、胃癌、大肠癌、胰腺癌、肾脏癌、肝癌、甲状腺癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫癌、骨癌、皮肤癌、脑肿瘤、黑色素瘤)、自身免疫疾病及炎性疾病(例如过敏性疾病、风湿性关节炎、全身性红斑狼疮)、脑神经疾病(例如脑梗塞、阿尔茨海默氏症、帕金森氏症、肌肉萎缩性侧索硬化症)、传染病(例如细菌传染病、病毒传染病)、遗传性疾病及罕见疾病(例如遗传性球形红细胞增多症、非营养不良性肌强直综合征)、眼部疾病(例如老年性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、视网膜色素变性)、骨科及整形外科领域的疾病(例如变形性关节炎)、血液疾病(例如白血病、紫斑症)、其他疾病(例如糖尿病、高脂血症等代谢异常疾病、肝脏疾病、肾脏疾病、肺疾病、循环系统疾病、消化系统疾病)。抗体为针对规定疾病的目标蛋白质的抗体的情况下，药物可以是与该规定疾病相关的药物(例如治疗该规定疾病的药物、缓和伴随针对该规定疾病的目标蛋白质的抗体的使用的副作用的药物)。

更具体来说，药物为抗癌剂。作为抗癌剂，可列举例如化疗剂、毒素、放射性同位素或包含其的物质。作为化疗剂，可列举例如DNA损伤剂、代谢拮抗剂、酶抑制剂、DNA嵌入剂、DNA切割剂、拓扑异构酶抑制剂、DNA结合抑制剂、微管蛋白结合抑制剂、细胞毒性核苷、铂化合物。作为毒素，可列举例如细菌毒素(例如白喉毒素)、植物毒素(例如蓖麻毒素)。作为放射性同位素，可列举例如氢原子的放射性同位素(例如

作为标记物质，可列举例如：酶(例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶)、亲和性物质(例如链霉亲和素、生物素、地高辛、适体)、荧光物质(例如荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白)、发光物质(例如荧光素、水母发光蛋白(aequorin)、吖啶酯(Acridinium ester)、三(2,2'-联吡啶)钌、鲁米诺)、放射性同位素(例如上述的放射性同位素)或含其的物质。

此外，功能性物质为高分子化合物、中分子化合物或低分子化合物，较好是低分子化合物。低分子化合物是指分子量1500以下的化合物。低分子化合物为天然化合物或合成化合物。低分子化合物的分子量可以是1200以下、1000以下、900以下、800以下、700以下、600以下、500以下、400以下或300以下。此外，低分子化合物的分子量可以是30以上、40以上或50以上。低分子化合物可以是如上所述的药物或标记物质。此外，作为低分子化合物，可列举例如氨基酸、寡肽、维生素、核苷、核苷酸、寡核苷酸、单糖、寡糖、脂质、脂肪酸及它们的盐。

3-3.包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团(B')关于B'，除了(a)的生物正交性官能团与功能性物质反应以外，与上述的B中的(a)包含生物正交性官能团的二价基团相同。因此，B'中的三价基团及正交性官能团的定义、例子及优选例，除了(a)的生物正交性官能团与功能性物质反应之外，与B中相同。

功能性物质具有与其结构相应的各种官能团。功能性物质具有容易与生物正交性官能团反应的官能团的情况下，可使功能性物质的该官能团与生物正交性官能团适当反应。容易与生物正交性官能团反应的官能团可根据生物正交性官能团的具体种类而不同。如果是本领域技术人员，可适当选择适当的官能团作为容易与生物正交性官能团反应的官能团(例如，Boutureira等,Chem.Rev.,2015,115,2174-2195)。作为容易与生物正交性官能团反应的官能团，例如，生物正交性官能团为硫醇残基的情况下可列举马来酰亚胺残基及二硫残基，生物正交性官能团为炔烃残基的情况下可列举叠氮残基，生物正交性官能团为醛残基或酮残基的情况下可列举肼残基，但并不仅限于这些。例如，生物正交性官能团为硫醇残基且容易与生物正交性官能团反应的官能团为马来酰亚胺残基或二硫残基的情况下(或者与之相反的情况下)，包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团可以是：包含硫代琥珀酰亚胺残基的三价基团、或包含二硫残基的三价基团；生物正交性官能团为炔烃残基且容易与生物正交性官能团反应的官能团为叠氮残基的情况下(或者与之相反的情况下)，包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团可以是：包含三唑残基(可与其他环稠合，也可不与其他环稠合)的三价基团；生物正交性官能团为醛残基或酮残基且容易与生物正交性官能团反应的官能团为肼残基的情况下(或者与之相反的情况下)，包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团可以是：包含腙残基的三价基团(例如，Boutureira等,Chem.Rev.,2015,115,2174-2195)。包含硫代琥珀酰亚胺残基的三价基团、包含二硫残基的三价基团、包含三唑残基(可与其他环稠合，也可不与其他环稠合)的三价基团、或包含腙残基的三价基团是：包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团的优选例。

另一方面，功能性物质不具有容易与生物正交性官能团反应的官能团的情况下，作为功能性物质，可使用衍生物化而具有所期望的官能团的物质。例如，功能性物质为抗体的情况下，可使用衍生物化而具有抗体天然不具有的官能团的物质。该情况下，抗体的衍生物化可通过本发明的方法进行。该情况下，可将衍生物化而位置选择性地具有所期望的生物正交性官能团的抗体用作功能性物质。

衍生物化为该领域中的技术常识(例如国际公开第2004/010957号、美国专利申请公开第2006/0074008号说明书、美国专利申请公开第2005/0238649号说明书)。例如，衍生物化可使用如上所述的交联剂进行。或者，衍生物化可使用具有所期望的官能团的特定连接体进行。例如，这样的连接体可以是能在适当的环境(例如细胞内或细胞外)中通过连接体的切割将功能性物质与抗体分离的连接体。作为这样的连接体，可列举例如通过特定的蛋白酶[例如，细胞内蛋白酶(例如溶酶体或者核内体中存在的蛋白酶)、细胞外蛋白酶(例如分泌性蛋白酶)]分解的肽基连接体(例如美国专利第6214345号；Dubowchik等,Pharm.Therapeutics83:67-123(1999))、可在存在于生物体内的局部酸性部位被切割的连接体(例如美国专利第5622929号、美国专利第5122368号、美国专利第5824805号)。连接体可以是自解构的(self-immolative)(例如国际公开第02/083180号、国际公开第04/043493号、国际公开第05/112919号)。本发明中，衍生物化的功能性物质也可简称为“功能性物质”。

包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团中，功能性物质及生物正交性官能团的定义、例子及优选例如上所述。通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分在该技术领域中为技术常识，可根据功能性物质(功能性物质被衍生物化的情况下为其衍生物化部分)和生物正交性官能团的种类适当决定。

包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，(1)可以是包含作为上述的优选例中提及的残基的硫代琥珀酰亚胺残基、三唑残基或腙残基的三价基团，或者(2)例如可以是包含选自二硫残基(该残基为上述的优选例中提及的残基)、缩醛残基、缩酮残基、酯残基、氨甲酰基残基、烷氧基烷基残基、亚胺残基、叔烷基氧基氨基甲酸酯残基、硅烷残基、含有腙的残基、氨基磷酸酯残基、乌头酰基残基、三苯甲基残基、偶氮残基、邻二醇残基、硒残基、含有具有吸电子基团的芳环的残基、含有香豆素的残基、含有砜的残基、含有不饱和键的链残基、糖基残基中的残基的三价基团，但无特别限定。

此外，包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团并无特别限定，例如，可以是包含与选自下述组中的任一化学结构对应的残基的三价基团；

[化学式39]

在此，

黑色方形表示与功能性物质侧的部分结合的键，

○(白色圆)表示与L侧的部分结合的键，●(黑色圆)表示与R'侧的部分结合的键，化学结构以切割性部分为中心呈不对称的情况下，可以是●表示与L侧的部分结合的键，○表示与R'侧的部分结合的键。

3-4.部分结构“L-B'(-F)”

部分结构“L-B'(-F)”的详细内容，除了B变更为B'(-F)以外，如上述“1-6.部分结构‘L-B’”所述。

一个实施方式中，切割性连接体可以是(i)作为包含具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力的切割性部分的二价基团的切割性连接体、或者(ii)作为包含不具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力的切割性部分的二价基团的切割性连接体。

特定的实施方式中，切割性连接体可以是上述(ii)的切割性连接体。这是因为由于B'已与功能性物质(F)结合，因此不需要在反应性基团侧生成生物正交性官能团。

另一特定的实施方式中，以L-B'(-F)表示的部分结构可以是以B2'(-F2)-L'-B1'(-F1)”表示的部分结构(即，L为B2'(-F2)-L'，B'为B1')。该情况下，以上述式(III)表示的具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐可以下述式(III')表示；

A-B2'(-F2)-L'-B1'(-F1)-R'-T (III')

式中，

A、R'和T与所述式(III)中相应符号的含义相同，

L'为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，B1'和B2'相同或不同，为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，

F1和F2相同或不同，为功能性物质，

B1'(-F1)和B2'(-F2)可具有以L'为中心的对称结构。

B1'和B2'相同或不同，与B'的定义、例子和优选例相同。

上述式(III')中，L'可以上述的式(L1')～(L3')中的任一个表示。

另一特定的实施方式中，以L-B'(-F)表示的结构单元可以下述式(LB'(F)')表示；

[化学式40]

式中，

C、F1、F2、p、p'、q、q'、X、X'、R

Y和Y'相同或不同，为从所述式(B-1)的Y除去1个氢原子而得的残基，

○(白色圆)表示与A结合的键，●(黑色圆)表示与R'结合的键。

更具体来说，Y和Y'中的从所述式(B-1)的Y除去1个氢原子而得的残基为-N(-)-、-CH(-)-、或从上述式(B-2)除去1个氢原子而得的基团。从结构简化等观点来看，Y可以是-N(-)-或-CH(-)-。或者，从以碳原子为基调的结构的设计等观点来看，Y可以是-CH(-)-或从上述式(B-2)除去1个氢原子而得的基团。

从上述式(B-2)除去1个氢原子而得的基团是从下述式(B-2')除去1个氢原子而得的基团；

[化学式41]

式中，

V和V'相同或不同，为-NH-、-O-、-CH

V1为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

s为0～10的任意的整数，式(B-2')中的○和●分别为与式(B-1)中的○和●同样的取向。式(B-2')中的s的定义、例子和优选例与式(B-2)中的相同。因此，式(B-2')中，V和V'中的一方可以是-N(-)-或-CH(-)-。或者，式(B-2')中，V1可以是从上述(a)或(b)的二价基团除去1个氢原子而得的三价基团。或者，式(B-2')中，s个-CH

该情况下，上述式(III)可规定为下述式(III”)；

[化学式42]

式中，

A、R、C、F1、F2、p、p'、q、q'、X、X'、R

上述式(LB'(F)')和(III”)中，从C＝Z中的C(碳原子)至C＝Z'中的C(碳原子)的长度与如上所述的连接A和R的主链的长度相同。这些式中，从C＝Z中的C至C＝Z'中的C的长度也可作为构成连接C＝Z中的C至C＝Z'中的C的部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)的原子数规定。这样的原子数与构成连接A和R的主链的原子数相同。连接C＝Z中的C至C＝Z'中的C的部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)可包含环结构，也可不含环结构，但较好是不含环结构。该连接链(除氢原子及取代基外)可优选不含肽部分。

3-5.抗体所具有的除抗体以外的部分结构的结合部位(位置选择性)

除抗体以外的部分结构(例如A-L-B'(-F)-R')可位置选择性地与抗体(T)中的如上所述的靶区结合。具体来说，T在由连续的1～50个氨基酸残基形成的靶区中包含1个以上的特定氨基酸残基且在除所述靶区以外的非靶区中包含5个以上的所述特定氨基酸残基的情况下，除抗体以外的部分结构可以30％以上的位置选择性与该靶区中所含的1个以上的特定氨基酸残基结合。靶区及位置选择性的定义、例子和优选例如上所述。

3-6.抗体所具有的除抗体以外的部分结构的个数

抗体(T)所保有的除抗体以外的部分结构(例如A-L-B'(-F)-R')的个数可变化。例如，T为包含多个单体蛋白质的多聚体蛋白质的情况下，T可在多个单体蛋白质中的对应的多个靶区中具有除T以外的部分结构。因而，T可具有多个除T以外的部分结构。因此，以式(III)、(III')或(III”)表示的结构表明T可具有1个或多个除T以外的部分结构。T所具有的除T以外的部分结构的个数可通过适当设定抗体的种类、及抗体与对其引入的结构单元的反应比例等条件来进行调节。这样的个数也根据抗体的种类而不同，例如可以是1～8个，较好是1～4个，更好是1或2个。

特定的实施方式中，在抗体为由多个单体蛋白质构成的多聚体蛋白质的情况下，抗体所保有的除抗体以外的部分结构的个数可以是多个。如果采用本发明，可对于多个单体蛋白质的同一靶区引入多个除抗体以外的部分结构。

优选的实施方式中，抗体可以是包含多个重链的抗体。抗体的定义、例子和优选例如上所述。本发明中，抗体所保有的除抗体以外的部分结构的个数，对于IgG、IgE和IgD可以是1个或2个(较好是2个)，对于IgA可以是1～4个(较好是4个)，对于IgM可以是1～8个(较好是8个)。

3-7.制造方法

本发明提供包含以下工序的具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的制造方法：

(B1)使包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐与功能性物质反应，生成具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐。

包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体以式(II)、较好是式(II')、更好是式(II”)表示。包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物以式(III)、较好是式(III')、更好是式(III”)表示。

包括针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐具有可与功能性物质反应的生物正交性官能团，因此可与功能性物质反应。这样的反应可在如上述“2-6.制造方法”中所述的不会引发蛋白质的变性、分解(例如酰胺键的断裂)的条件(温和条件)下适当进行。

反应体系中，“功能性物质(Y)”相对于“包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐(X)”的摩尔比(Y/X)，根据抗体及功能性物质的种类、待通过功能性物质进行修饰的抗体中的部位的数量(例如DAR)等而变化，无特别限定，例如为0.1～100，较好是0.5～80，更好是1～70、进一步更好是2～50，特别好是3～30。

具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的生成的确认，虽也依赖于其具体的原料及产物的分子量，但可通过例如电泳法、色谱法(例如凝胶过滤层析法、离子交换色谱法、反相柱色谱法、HPLC)或质谱分析进行，较好是通过质谱分析进行。位置选择性的确认、除抗体以外的部分结构的个数的确认及纯化，可通过上述“2-6.制造方法”中所述的方法适当进行。

本发明还提供包含以下工序的具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的制造方法：

(B2)使包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐与抗体反应，生成包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐；以及

(B3)使包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐与功能性物质反应，生成具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐。

上述(B2)的工序可与上述“2-6.制造方法”中所述的上述(A1)的工序同样地进行。上述(B3)的工序可与上述(B1)的工序同样地进行。上述(B2)和(B3)的工序可分别进行。或者，上述(B2)和(B3)的工序可根据作为抗体中的反应目标的特定氨基酸残基与反应性基团的反应对、以及功能性物质中的官能团与生物正交性官能团的反应对的组合同时进行。即，上述(B2)和(B3)的工序同时进行的情况下，可不分离上述(B2)的工序中得到的产物，将上述(B2)的工序中得到的含产物的反应液供于上述(B3)的工序。

4.具有生物正交性官能团的抗体或其盐

4-1.制造方法的概要

本发明提供以式(IV)表示的具有生物正交性官能团的抗体或其盐的制造方法；

L1-B-R'-T (IV)

式中，

L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团，

B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，

T为抗体。

4-2.(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团(L1)

式(IV)中，L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团。这样的一价基团是可通过作为如上所述的包含切割性部分的二价基团的切割性连接体的切割而生成的一价基团。因此，L1可以是可通过如上所述的切割性部分的残基或化学结构的切割而生成的一价基团。更具体来说，(i')包含生物正交性官能团的一价基团可以是能通过上述的“(i)作为包含具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力的切割性部分的二价基团的切割性连接体”的切割而生成的一价基团，(ii')不含生物正交性官能团的一价基团可以是能通过“(ii)作为包含不具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力的切割性部分的二价基团的切割性连接体”的切割而生成的一价基团。

特定的实施方式中，L1可以下述式(L1-1)或(L1-2)中的任一个表示；

C1-Lb (L1-1)

C1 (L1-2)

式中，

Lb为二价基团，

C1为生物正交性官能团、或者除生物正交性官能团的基团。

作为二价基团，可列举例如：可具有取代基的二价烃基、可具有取代基的二价杂环基、-C(＝O)-、-NR

生物正交性官能团的定义、例子和优选例如上所述。

作为除生物正交性官能团以外的基团，可列举例如上述的取代基中的除生物正交性官能团以外的基团。作为除生物正交性官能团以外的这样的基团，可列举例如烷基、环烷基、芳烷基、一价杂环基、羟基、氨基、烷基氧基(烷氧基)、环烷氧基、芳烷氧基。对于这些基团及这些基团的构成要素(例如烷基氧基(烷氧基)中的烷基、环烷氧基中的环烷基、和芳烷氧基中的芳烷基)的定义、例子和优选例，与上述相同。

特定的实施方式中，Lb可以下述式(Lb')表示；

[化学式43]

式中，

p为0～10的任意的整数，

q为0～10的任意的整数，

X为碳原子、氮原子或单键(在此，X为氮原子的情况下，R

R

○(白色圆)表示与C1结合的键，●(黑色圆)表示与B结合的键。

p、q和X、以及R

4-3.部分结构“L1-B”

4-3-1.连接L1末端部分和R'的部分结构“L1-B”的长度

式(IV)中，连接通过切割生成的L1末端部分(或C1末端部分)和R'的部分结构(“L1-B”中的直链部分)的长度(或者，不仅限于式(IV)等特定式的、位置选择性地具有生物正交性官能团的抗体或其盐中的连接“生物正交性官能团”和“特定氨基酸残基的侧链”的主链的原子数，下同)可根据如上述“1-6-1.连接A和R的部分结构‘L-B’中的主链的长度”中所述的各种因素适当地进行设计。

连接通过切割生成的L1末端部分(或C1末端部分)和R'的部分结构的长度例如可以为约

更具体来说，连接通过切割生成的L1末端部分(或C1末端部分)和R'的部分结构的长度也可作为构成部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)的原子数规定。构成连接链的原子数例如可以是2个(约

连接通过切割生成的L1末端部分(或C1末端部分)和R'的部分结构的连接链为不含二价环结构的链状结构的情况下，连接链的原子数可通过计数连接链中的原子数来决定。

另一方面，连接通过切割生成的L1末端部分(或C1末端部分)和R'的部分结构的连接链为含二价环结构的结构的情况下，连接链的原子数与上述的长度并不一定对应，存在可根据连接链的原子数规定的长度比上述的长度更短的倾向。即使是这样的情况下，从通过原子数规定连接链的长度的观点来看，可简便地计数连接链的原子数。具体来说，这样的情况下的连接链的原子数可如上所述通过在连接链中不含二价环结构的链状结构中的原子数的基础上，再计数连通二价环结构中的2个结合键的最短路径的原子数来决定。

优选地，连接通过切割生成的L1末端部分(或C1末端部分)和R'的部分结构的连接链可以是不含二价环结构的链状结构。该情况下，可按照连接通过切割生成的末端部分和R'的部分结构的连接链中不含二价环基的条件适当设计L1-B。

特定的实施方式中，以L1-B表示的部分结构较好是不含肽部分。该情况下，使用本发明的具有生物正交性官能团的抗体得到的本发明的具有功能性物质的抗体(例如抗体药物复合物)具有不会包含可具有免疫原性的肽部分作为连接体的优点。

4-3-2.部分结构“L1-B”的具体结构

上述式(IV)中，L1和B为可相互关联的结构。因此，上述式(IV)中，L1和B可作为以“L1-B”表示的部分结构规定。

特定的实施方式中，L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团的情况下，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团。

优选地，L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团的情况下，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团。该情况下，(i')中的生物正交性官能团与(a)中的生物正交性官能团可以为同种，也可以为不同种。从采用更简单的结构和/或提高对于单一的功能性物质的反应性等观点来看，(i')中的生物正交性官能团可与(a)中的生物正交性官能团为同种。另一方面，从确保对于2种以上的功能性物质的差别化的反应性等、和不使用反应中的部分生物正交性官能团的观点来看，(i')中的生物正交性官能团可与(a)中的生物正交性官能团为不同种。

或者，L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团的情况下，B可以是(b)不含生物正交性官能团的二价基团。该情况下，以式(IV)表示的具有生物正交性官能团的抗体或其盐具有更简单的结构，所以合成容易。

另一特定的实施方式中，L1为(ii')不含生物正交性官能团的一价基团的情况下，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团。

特定的实施方式中，以L1-B表示的结构单元可以下述式(L1B')表示；

[化学式44]

式中，

C1、p、q、X、R

●(黑色圆)表示与R'结合的键。

因此，上述式(IV)可规定为下述式(IV')；

[化学式45]

式中，

C1、p、q、X、R

上述式(L1B')和(IV')中，从C＝Z中的C至C1的长度与连接通过切割生成的L1末端部分(或C1末端部分)和R'的部分结构的长度相同。这些式中，从C＝Z中的C至C1的长度也可按照构成C＝Z中的C至C1的部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)的原子数规定。这样的原子数与构成“连接通过切割生成的L1末端部分(或C1末端部分)和R'的部分结构(除氢原子及取代基外)”的原子数相同。连接C＝Z中的C至C1的部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)可包含环结构，也可不含环结构，但较好是不含环结构。该连接链(除氢原子及取代基外)可优选不含肽部分。

4-4.抗体所具有的除抗体以外的部分结构的结合部位(位置选择性)

除抗体以外的部分结构(例如L1-B-R')可位置选择性地与抗体(T)中的如上所述的靶区结合。具体来说，T在由连续的1～50个氨基酸残基形成的靶区中包含1个以上的特定氨基酸残基且在除所述靶区以外的非靶区中包含5个以上的所述特定氨基酸残基的情况下，除抗体以外的部分结构可按照30％以上的位置选择性与该靶区中所含的1个以上的特定氨基酸残基结合。靶区及位置选择性的定义、例子和优选例如上所述。

4-5.抗体所具有的除抗体以外的部分结构的个数

抗体(T)所保有的除抗体以外的部分结构(例如L1-B-R')的个数可变化。例如，T为包含多个单体蛋白质的多聚体蛋白质的情况下，T可在多个单体蛋白质中的对应的多个靶区中具有除T以外的部分结构。因而，T可具有多个除T以外的部分结构。因此，以式(IV)、(IV')或(IV”)表示的结构表明T可具有1个或多个除T以外的部分结构。T所具有的除T以外的部分结构的个数可通过适当设定抗体的种类、及抗体与对其引入的结构单元的反应比例等条件来进行调节。这样的个数也根据抗体的种类而不同，例如可以是1～8个，较好是1～4个，更好是1或2个。

特定的实施方式中，抗体所保有的除抗体以外的部分结构的个数，在抗体为由多个单体蛋白质构成的多聚体蛋白质的情况下，可以是多个。如果采用本发明，可对于多个单体蛋白质的同一靶区引入多个除抗体以外的部分结构。

优选的实施方式中，抗体可以是包含多个重链的抗体。抗体的定义、例子和优选例如上所述。本发明中，抗体所保有的除抗体以外的部分结构的个数，对于IgG、IgE和IgD可以是1个或2个(较好是2个)，对于IgA可以是1～4个(较好是4个)，对于IgM可以是1～8个(较好是8个)。

4-6.制造方法

本发明提供包括以下工序的具有生物正交性官能团的抗体或其盐的制造方法：

(C1)对包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的切割性部分进行切割，生成具有生物正交性官能团的抗体或其盐。

包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体以式(II)、较好是式(II')、更好是式(III”)表示。具有生物正交性官能团的抗体以式(IV)、较好是式(IV')、更好是式(IV")表示。

包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐具有可通过如上所述的切割处理进行切割的切割性部分，因此可以进行切割。这样的切割反应可在如上述“2-6.制造方法”中所述的不会引起蛋白质的变性、分解(例如酰胺键的断裂)的条件(温和条件)下适当进行。

作为切割处理，可列举例如：(a)采用选自酸性物质、碱性物质、还原剂、氧化剂、酶中的1种以上的物质进行的处理，(b)采用选自光的物理化学刺激进行的处理，或者(c)在使用包含可自体分解的切割性部分的切割性连接体的情况下进行的放置。这样的切割处理的条件为该领域中的技术常识(例如，G.Leriche，L.Chisholm，A.Wagner，Bioorganic&Medicinal Chemistry.20，571(2012)；Feng P.等，Jounal of American ChemicalSociety.132，1500(2010).；Bessodes M.等，Journal of Controlled Release，99，423(2004).；DeSimone，J.M.，Journal ofAmerican Chemical Society.132，17928(2010)；Thompson，D.H.，Journal of Controlled Release，91，187(2003)；Schoenmarks，R.G.，Journal ofControlledRelease，95，291(2004))。

具有生物正交性官能团的抗体或其盐的生成的确认，虽也依赖于其具体的原料及产物的分子量，但可通过例如电泳法、色谱法(例如凝胶过滤层析法、离子交换色谱法、反相柱色谱法、HPLC)或质谱分析进行，较好是通过质谱分析进行。位置选择性的确认、除抗体以外的部分结构的个数的确认、及纯化可通过上述“2-6.制造方法”中所述的方法适当进行。

本发明还提供包括以下工序的具有生物正交性官能团的抗体或其盐的制造方法：

(C2)使包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐与抗体反应，生成包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐；以及

(C3)对包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的切割性部分进行切割，生成具有生物正交性官能团的抗体或其盐。

上述(C2)的工序可与上述“2-6.制造方法”中所述的上述(A1)的工序同样地进行。上述(C3)的工序可与上述(C1)的工序同样地进行。上述(C2)和(C3)的工序可分别进行。或者，上述(C2)和(C3)的工序可根据反应性基团与可通过切割生成的生物正交性官能团的组合(非反应性)等因素而同时进行。即，上述(C2)和(C3)的工序同时进行的情况下，可不分离上述(C2)的工序中得到的产物，将上述(C2)的工序中得到的含产物的反应液供于上述(C3)的工序。

5.具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法

5-1.概要

本发明提供以式(V)表示的具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法；

F-(L1-B)'-R'-T (V)

式中，

L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团，

B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，以(L1-B)'表示的结构单元为包含通过“功能性物质”与“(i')和(a)中的生物正交性官能团中的任一者或两者”之间的反应而生成的部分的二价结构单元，

F为功能性物质，

R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，

T为抗体。

5-2.部分结构“F-(L1-B)'”5-2-1.连接F和R'的部分结构“L1-B”的长度

式(V)中，连接F和R'的部分结构“L1-B”(“L1-B”中的直链部分)的长度(或者，不仅限于式(V)等特定式的、位置选择性地具有功能性物质的抗体或其盐中连接“功能性物质”和“特定氨基酸残基的侧链”的主链的原子数，或功能性物质介以生物正交性官能团与抗体结合的情况下为连接“生物正交性官能团”和“特定氨基酸残基的侧链”的主链的原子数。下同)可根据如上述“1-6-1.连接A和R的部分结构‘L-B’中的主链的长度”中所述的各种因素适当地进行设计。

连接F和R'的部分结构的长度例如为约

更具体来说，连接F和R'的部分结构的长度也可按照构成部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)的原子数规定。构成连接链的原子数例如可以是2个(约

连接F和R'的部分结构的连接链为不含二价环结构的链状结构的情况下，连接链的原子数可通过计数连接链中的原子数来决定。

另一方面，连接F和R'的部分结构的连接链为含二价环结构的结构的情况下，连接链的原子数与上述的长度不一定对应，存在可根据连接链的原子数规定的长度比上述的长度更短的倾向。即使是这样的情况下，从通过原子数规定连接链的长度的观点来看，可简便地计数连接链的原子数。具体来说，这样的情况下的连接链的原子数可如上所述通过在连接链中不含二价环结构的链状结构中的原子数的基础上，再计数连通二价环结构中的2个结合键的最短路径的原子数来决定。

优选地，连接F和R'的部分结构的连接链可以是不含二价环结构的链状结构。可按照连接F和R'的部分结构的连接链中不含二价环基的方式适当设计L1-B。

特定的实施方式中，以L1-B表示的部分结构较好是不含肽部分。该情况下，使用本发明的具有功能性物质的抗体(例如抗体药物复合物)具有不含可具有免疫原性的肽部分作为连接体的优点。

5-2-2.部分结构“F-(L1-B)'”的具体结构

式(V)中，F-(L1-B)'中的L1和B为可相互关联的结构。因此，上述式(V)中，L1和B可作为以“L1-B”表示的部分结构规定。

此外，以F-(L1-B)'表示的结构单元为通过“功能性物质”与“(i')和(a)中的生物正交性官能团中的任一者或两者”之间的反应而生成的部分。供于反应的生物正交性官能团在式(V)中不存在。因此，式(V)中，不存在(i')和(a)中的生物正交性官能团中的任一者或两者。通过“功能性物质”与“(i')和(a)中的生物正交性官能团中的任一者或两者”之间的反应而生成的部分，与通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分相同。因此，本说明书中，通过“功能性物质”与“(i')和(a)中的生物正交性官能团中的任一者或两者”之间的反应而生成的部分的例子(残基的名称)和具体例子(化学结构式)，与上文中关于通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分所述的相同。

一个实施方式中，L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团的情况下，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团。

优选的实施方式中，L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团的情况下，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团。该情况下，(i')中的生物正交性官能团与(a)中的生物正交性官能团可以为同种，也可以为不同种。从采用更简单的结构和/或提高对于单一的功能性物质的反应性等观点来看，(i')中的生物正交性官能团可与(a)中的生物正交性官能团为同种。另一方面，从确保对于2种以上的功能性物质的差别化的反应性、和不使用反应中的一部分生物正交性官能团等观点来看，(i')中的生物正交性官能团可与(a)中的生物正交性官能团为不同种。

另一优选的实施方式中，L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团的情况下，B可以是(b)不含生物正交性官能团的二价基团。该情况下，以式(V)表示的具有功能性物质的抗体或其盐具有更简单的结构，所以合成容易。

另一实施方式中，L1为(ii')不含生物正交性官能团的一价基团的情况下，B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团。

特定的实施方式中，(i')和(a)中的生物正交性官能团为不同种的情况下，以式(V)表示的具有功能性物质的抗体或其盐可以式(V1)或(V2)表示。

L1-B'(-F)-R'-T (V1)

式中，

L1为(i')包含生物正交性官能团的一价基团、或者(ii')不含生物正交性官能团的一价基团，

B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，

F为功能性物质，

R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，

T为抗体。

F-L1'-B-R'-T (V2)

式中，

L1'为包含通过“功能性物质”与“(i')包含生物正交性官能团的一价基团”之间的反应而生成的部分的二价基团，

B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

F为功能性物质，

R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，

T为抗体。

L1'为包含通过“功能性物质”与“(i')包含生物正交性官能团的一价基团”之间的反应而生成的部分的二价基团。通过“功能性物质”与“(i')包含生物正交性官能团的一价基团”之间的反应而生成的部分，与通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分相同。因此，本说明书中，通过“功能性物质”与“(i')包含生物正交性官能团的一价基团”之间的反应而生成的部分的例子(残基的名称)和具体例子(化学结构式)，与上文中关于通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分所述的相同。因此，由于功能性物质与生物正交性官能团反应，所以包含通过“功能性物质”与“(i')包含生物正交性官能团的一价基团”之间的反应而生成的部分的二价基团(L1')，也可表述为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的二价基团(下同)。更具体而言，关于包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的二价基团，(1)可以是包含作为上述的优选例中提及的残基的硫代琥珀酰亚胺残基、三唑残基或腙残基的二价基团，或者(2)例如可以是包含选自二硫残基(该残基为上述的优选例中提及的残基)、缩醛残基、缩酮残基、酯残基、氨甲酰基残基、烷氧基烷基残基、亚胺残基、叔烷基氧基氨基甲酸酯残基、硅烷残基、含有腙的残基、氨基磷酸酯残基、乌头酰基残基、三苯甲基残基、偶氮残基、邻二醇残基、硒残基、含有具有吸电子基团的芳环的残基、含有香豆素的残基、含有砜的残基、含有不饱和键的链残基、糖基残基中的残基的二价基团，但无特别限定；较好是(1)包含硫代琥珀酰亚胺残基、三唑残基或腙残基的二价基团。

另一特定的实施方式中，(i')和(a)中的生物正交性官能团为同种或不同种的情况下，以式(V)表示的具有功能性物质的抗体或其盐可以式(V3)表示。

Fa-L1'-B'(-Fb)-R'-T (V3)

式中，

L1'为包含通过“功能性物质”与“(i')包含生物正交性官能团的一价基团”之间的反应而生成的部分的二价基团，

B'为包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的三价基团，

Fa和Fb分别为相同或不同的功能性物质，

R'为通过抗体与反应性基团之间的反应而生成的部分，

T为抗体。

特定的实施方式中，上述式(V1)中，以L1-B'(-F)表示的结构单元可以下述式(L1B'(F))表示；

[化学式46]

式中，

F、C1、p、q、X、R

Y'为从所述式(B-1)的Y除去1个氢原子而得的残基，

●(黑色圆)表示与R'结合的键。

从所述式(B-1)的Y除去1个氢原子而得的残基的定义、例子和优选例与上述相同。

因此，上述式(V1)可规定为下述式(V1')；

[化学式47]

式中，

F、C1、p、q、X、R

Y'为从所述式(B-1)的Y除去1个氢原子而得的残基。

特定的实施方式中，上述式(V2)中，以F-L1'-B表示的结构单元可以下述式(FL1'B)表示；

[化学式48]

式中，

F、p、q、X、R

C1'为通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分，

●(黑色圆)表示与R'结合的键。

C1'为通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分。C1'中的通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的定义、例子及优选例与上述“包含通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分的二价基团”中所述的相同(下同)。

因此，上述式(V2)可规定为下述式(V2')；

[化学式49]

式中，

F、p、q、X、R

C1'为通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分。

特定的实施方式中，上述式(V3)中，以Fa-L1'-B'(-Fb)表示的结构单元可以下述式(FaL1'B'(Fb))表示；

[化学式50]

式中，

Fa、Fb、p、q、X、R

C1'为通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分，

Y'为从所述式(B-1)的Y除去1个氢原子而得的残基，

●(黑色圆)表示与R'结合的键。

因此，上述式(V3)可规定为下述式(V3')；

[化学式51]

式中，

Fa、Fb、p、q、X、R

C1'为通过功能性物质与生物正交性官能团之间的反应而生成的部分，

Y'为从所述式(B-1)的Y除去1个氢原子而得的残基。

上述式(L1B'(F))、(FL1'B)和(FaL1'B'(F2))、以及(V1')、(V2')和(V3')中，从C＝Z中的C至C1的长度与连接通过切割生成的L1末端部分(或C1末端部分)和R'的部分结构的长度相同。这些式中，从C＝Z中的C至C1的长度也可按照构成从C＝Z中的C至C1的部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)的原子数规定。这样的原子数与构成连接通过切割生成的L1末端部分(或C1末端部分)和R'的部分结构(除氢原子及取代基外)的原子数相同。连接C＝Z中的C至C1的部分结构的连接链(除氢原子及取代基外)可包含环结构，也可不含环结构，但较好是不含环结构。该连接链(除氢原子及取代基外)可优选不含肽部分。

5-3.抗体所具有的除抗体以外的部分结构的结合部位(位置选择性)

除抗体以外的部分结构(例如F-(L1-B)'-R')可位置选择性地与抗体(T)中的如上所述的靶区结合。具体来说，T在由连续的1～50个氨基酸残基形成的靶区中包含1个以上的特定氨基酸残基且在除所述靶区以外的非靶区中包含5个以上的所述特定氨基酸残基的情况下，除抗体以外的部分结构可按照30％以上的位置选择性与该靶区中所含的1个以上的特定氨基酸残基结合。靶区及位置选择性的定义、例子和优选例如上所述。

5-4.抗体所具有的除抗体以外的部分结构的个数

抗体(T)所保有的除抗体以外的部分结构(例如F-(L1-B)'-R')的个数可变化。例如，T为包含多个单体蛋白质的多聚体蛋白质的情况下，T可在多个单体蛋白质中的对应的多个靶区中具有除T以外的部分结构。因而，T可具有多个除T以外的部分结构。因此，以式(V)、(V1)、(V2)、(V3)、(V1')、(V2')或(V3')表示的结构表明T可具有1个或多个除T以外的部分结构。T所具有的除T以外的部分结构的个数可通过适当设定抗体的种类、及抗体与对其引入的结构单元的反应比例等条件来进行调节。这样的个数也根据抗体的种类而不同，例如可以是1～8个，较好是1～4个，更好是1或2个。

特定的实施方式中，抗体所保有的除抗体以外的部分结构的个数，在抗体为由多个单体蛋白质构成的多聚体蛋白质的情况下，可以是多个。如果采用本发明，可对于多个单体蛋白质的同一靶区引入多个除抗体以外的部分结构。

优选的实施方式中，抗体可以是包含多个重链的抗体。抗体的定义、例子和优选例如上所述。本发明中，抗体所保有的除抗体以外的部分结构的个数，对于IgG、IgE和IgD可以是1个或2个(较好是2个)，对于IgA可以是1～4个(较好是4个)，对于IgM可以是1～8个(较好是8个)。

5-5.制造方法

本发明提供具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法。本制造方法可分类为：(D)使用具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐作为原料的方法(参照图2的反应(3))；以及(E)使用具有生物正交性官能团的抗体或其盐作为原料的方法(参照图2的反应(5))。

(D)使用具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐作为原料的方法，包括以下工序：

(D1)对具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的切割性部分进行切割，生成具有功能性物质的抗体或其盐。

具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物以式(III)、较好是式(III')、更好是式(III”)表示。具有功能性物质的抗体以式(V)表示，较好是以式(V1)、(V2)或(V3)表示，更好是以式(V1')、(V2')或(V3')表示。

“具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐”具有可通过如上所述的切割处理进行切割的切割性部分，因此可以进行切割。这样的切割反应可在如上述“4-6.制造方法”中所述的方式下进行。

具有功能性物质的抗体或其盐的生成的确认，虽也依赖于其具体的原料及产物的分子量，但可通过例如电泳法、色谱法(例如凝胶过滤层析法、离子交换色谱法、反相柱色谱法、HPLC)或质谱分析进行，较好是通过质谱分析进行。位置选择性的确认、除抗体以外的部分结构的个数的确认、及纯化可通过上述“2-6.制造方法”中所述的方法适当进行。

本发明还提供包含以下工序的具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法：

(D2)使包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐与功能性物质反应，生成具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐；以及

(D3)对具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的切割性部分进行切割，生成具有功能性物质的抗体或其盐。

上述(D2)的工序可与上述“3-7.制造方法”中所述的上述(B1)的工序同样地进行。上述(D3)的工序可与上述(D1)的工序同样地进行。上述(D2)和(D3)的工序可分别进行。或者，上述(D2)和(D3)的工序可根据与切割性部分、功能性物质及生物正交性官能团的组合等因素同时进行。即，上述(D2)和(D3)的工序同时进行的情况下，可不分离上述(D2)的工序中得到的产物，将上述(D2)的工序中得到的含产物的反应液供于上述(D3)的工序。

本发明还提供包含以下工序的具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法：

(D4)使包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐与抗体反应，生成包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐；

(D5)使包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐与功能性物质反应，生成具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐；以及

(D6)对具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的复合物或其盐的切割性部分进行切割，生成具有功能性物质的抗体或其盐。

上述(D4)的工序可与上述“2-6.制造方法”中所述的上述(A1)的工序同样地进行。上述(D5)和(D6)的工序可与上述(D2)和(D3)的工序同样地进行。上述(D5)的工序可与上述“3-7.制造方法”中所述的上述(B1)的工序同样地进行。上述(D6)的工序可与上述(D1)的工序同样地进行。上述(D4)～(D6)的工序可分别进行。或者，上述(D4)～(D6)的工序中的至少一部分可根据与反应性基团、切割性部分、功能性物质及生物正交性官能团的组合等因素同时进行。即，上述(D4)～(D6)的工序中的2个以上的工序同时进行的情况下，可不分离前一工序中得到的产物，将前一工序中得到的含产物的反应液供于后一工序。

(E)使用具有生物正交性官能团的抗体或其盐作为原料的方法，包括以下工序：

(E1)使具有生物正交性官能团的抗体或其盐与功能性物质反应，生成具有功能性物质的抗体或其盐。

具有生物正交性官能团的抗体以式(IV)、较好是式(IV')表示。具有功能性物质的抗体以式(V)表示，较好是以式(V1)、(V2)或(V3)表示，更好是以式(V1')、(V2')或(V3')表示。

具有生物正交性官能团的抗体或其盐具有生物正交性官能团，因此可与功能性物质反应。这样的反应可在如上述“3-7.制造方法”中所述的方式下进行。

具有功能性物质的抗体或其盐的生成的确认可通过如上所述的方法进行。位置选择性的确认、除抗体以外的部分结构的个数的确认、及纯化可通过上述“2-6.制造方法”中所述的方法适当进行。

本发明还提供包含以下工序的具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法：

(E2)对包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的切割性部分进行切割，生成具有生物正交性官能团的抗体或其盐；以及

(E3)使具有生物正交性官能团的抗体或其盐与功能性物质反应，生成具有功能性物质的抗体或其盐。

上述(E2)的工序可与上述“4-6.制造方法”中所述的上述(C1)的工序同样地进行。上述(E3)的工序可与上述(E1)的工序同样地进行。上述(E2)和(E3)的工序可分别进行。或者，上述(E2)和(E3)的工序可根据与切割性部分、功能性物质及生物正交性官能团的组合等因素同时进行。即，上述(E2)和(E3)的工序同时进行的情况下，可不分离上述(E2)的工序中得到的产物，将上述(E2)的工序中得到的含产物的反应液供于上述(E3)的工序。

本发明还提供包含以下工序的具有功能性物质的抗体或其盐的制造方法：

(E4)使包含针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐与抗体反应，生成包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐；

(E5)对包含针对抗体的亲和性物质及切割性部分的抗体或其盐的切割性部分进行切割，生成具有生物正交性官能团的抗体或其盐；以及

(E6)使具有生物正交性官能团的抗体或其盐与功能性物质反应，生成具有功能性物质的抗体或其盐。

上述(E4)的工序可与上述“2-6.制造方法”中所述的上述(A1)的工序同样地进行。上述(E5)和(E6)的工序可与上述(E2)和(E3)的工序同样地进行。上述(E4)～(E6)的工序可分别进行。或者，上述(E4)～(E6)的工序中的至少一部分可根据与反应性基团、切割性部分、功能性物质及生物正交性官能团的组合等因素同时进行。即，上述(E4)～(E6)的工序中的2个以上的工序同时进行的情况下，可不分离前一工序中得到的产物，将前一工序中得到的含产物的反应液供于后一工序。

6.盐

本发明中，作为盐，可列举例如：与无机酸的盐、与有机酸的盐、与无机碱的盐、与有机碱的盐、及与氨基酸的盐。作为与无机酸的盐，可列举例如：与盐酸、溴化氢、磷酸、硫酸、硝酸的盐。作为与有机酸的盐，可列举例如：与甲酸、乙酸、三氟乙酸、乳酸、酒石酸、富马酸、乙二酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、苯磺酸、对甲苯磺酸的盐。作为与无机碱的盐，可列举例如：与碱金属(例如钠、钾)、碱土金属(例如钙、镁)、及锌、铝等其他金属、以及铵的盐。作为与有机碱的盐，可列举例如：与三甲胺、三乙胺、丙二胺、乙二胺、吡啶、乙醇胺、单烷基乙醇胺、二烷基乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺的盐。作为与氨基酸的盐，可列举例如：与碱性氨基酸(例如精氨酸、组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸)及酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)的盐。关于盐，较好是与无机酸(例如盐酸)的盐、或与有机酸(例如三氟乙酸)的盐。

7.用途

具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的本发明的化合物或其盐可用于例如抗体的位置选择性修饰。因此，本发明提供：包含“具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐”的、抗体的位置选择性修饰试剂。

本发明的位置选择性修饰试剂可以以进一步包含其他成分的组合物的形态提供。作为这样的其他成分，可列举例如溶液、稳定剂(例如抗氧化剂、防腐剂(保存剂))。作为溶液，较好是水溶液。作为水溶液，可列举例如：水(例如蒸馏水、灭菌蒸馏水、纯化水、生理盐水)、缓冲液(例如磷酸水溶液、Tris-盐酸缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、硼酸水溶液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、柠檬酸盐缓冲液)，较好是缓冲液。溶液的pH例如为5.0～9.0，较好是5.5～8.5。本发明的位置选择性修饰试剂可以液态或粉末状(例如冻干粉末)提供。

(位置选择性地)具有针对抗体的亲和性物质及切割性部分的本发明的抗体或其盐、(位置选择性地)具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分、功能性物质及抗体的本发明的复合物或其盐、以及(位置选择性地)具有生物正交性官能团的本发明的抗体或其盐，可用作例如用于制备(位置选择性地)具有功能性物质的抗体或其盐的中间体。

(位置选择性地)具有功能性物质的本发明的抗体或其盐可用作例如药物或者试剂(例如诊断试剂、研究用试剂)。

特别地，(位置选择性地)具有功能性物质的本发明的抗体或其盐作为药物有用。如上所述，有报道称，如果改变抗体药物复合物(ADC)的药物的结合数和结合位置，则体内动力学和药物的释放速度、效果会发生变化。基于这些情况，对于下一代的ADC，要求控制偶联的药物的个数和位置。认为如果个数和位置固定，则所期待的功效、偶联药剂的多样性、批次差异即所谓标准化(regulation)的问题得到解决。具有功能性物质的本发明的抗体或其盐可解决这样的标准化的问题。因此，具有功能性物质的本发明的抗体或其盐可以以药物组合物的形态提供。这样的药物组合物除包含“具有功能性物质的抗体或其盐”之外，还可包含药学上可允许的载体。作为药学上可允许的载体，可列举例如：蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石、磷酸钙、碳酸钙等赋形剂，纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇、蔗糖、淀粉等粘合剂，淀粉、羧甲基纤维素、羟丙基淀粉、碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙等崩解剂，硬脂酸镁、二氧化硅气凝胶(Aerosil)、滑石、十二烷基硫酸钠等润滑剂，柠檬酸、薄荷醇、甘氨酰赖氨酸铵盐、甘氨酸、甜橙粉等芳香剂，苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等防腐剂，柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸等稳定剂，甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、硬脂酸铝等悬浮剂，表面活性剂等分散剂，水、生理盐水、橙汁等稀释剂，可可脂、聚乙二醇、白煤油等基质蜡(basewax)等，但并不仅限于这些例子。此外，具有功能性物质的本发明的抗体或其盐还可具有实现稳定性的任意的修饰(例如PEG化)。

适合于口服给药的制剂为：使有效量的配体(ligand)溶解于水、生理盐水、橙汁等稀释液而得的液体制剂，作为固体或颗粒包含有效量的配体的胶囊剂、药囊(sachet)或片剂，使有效量的有效成分悬浮于适当的分散介质中的悬浮液剂，使溶解了有效量的有效成分的溶液分散于适当的分散介质并乳化的乳剂等。

药物组合物适合于非口服给药(胃肠外给药)(例如静脉注射、皮下注射、肌肉注射、局部注入、腹腔内给药)。作为这样的适合于非口服给药的药物组合物，有水性和非水性的等渗无菌注射液剂，其中可含抗氧化剂、缓冲液、抗菌剂、等渗剂等。此外，可列举水性和非水性的无菌悬浮液剂，其中可含悬浮剂、助溶剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂等。

药物组合物的给药量根据有效成分的种类及活性、疾病的严重程度、作为给药对象的动物种类、以及给药对象的药物耐受性、体重、年龄等而不同，可适当设定。

实施例

以下，示出实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于以下的实施例。

(实施例1)修饰蛋白A的设计及其在谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)中的分泌表达(1-1)修饰蛋白A的设计的概要

本发明中，需要使连接体与蛋白质结合。即，为了实现连接体对蛋白质中的特定氨基酸残基的特异性结合，需要按照蛋白质中仅存在一个可与连接体反应的氨基的条件进行设计。考虑到该事项而实施了以下的突变；

A)将蛋白质中的K(赖氨酸)全部突变为R(精氨酸)；

B)通过使N末端的氨基酸为Q(谷氨酰胺)，从而使其焦谷氨酰化并将N末端氨基变换为酰胺；

按照上述A)和B)的规则如下设计了实际的修饰蛋白A。

(1-2)修饰蛋白A的制备

制备了以下的修饰蛋白A；

(a)CspB6Tev-QZ34C

QETNPTENLYFQQKNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(SEQ ID NO:7)

(b)QZ34C-60

QTADNQKNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDCSQSANLLAEAQQLNDAQAPQA(SEQ IDNO:8)

(c)QET-Z34C1

QETKNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(SEQ ID NO:9)

(d)QET-Z34C2

QETFNKQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(SEQ ID NO:10)

(e)QET-Z34C3

QETFNMQCQRRFYEALHDPNLNKEQRNARIRSIRDDC(SEQ ID NO:22)

(f)QET-Z34C4

QETFNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC(SEQ ID NO:23)。

(1-3)修饰蛋白A的表达

使用Corynex(注册商标)进行了这些修饰蛋白A的表达探讨。采用Corynex(注册商标)的表达中，利用了CspB融合法(WO2013/062029)，即，以下的技术：通过在编码信号肽的碱基序列与编码目标蛋白质的碱基序列之间，插入编码包含CspB成熟蛋白质的N末端三碱基Gln-Glu-Thr(QET)的氨基酸序列的碱基序列，从而可提高目标蛋白质的分泌生产量。此外，由于CspB标签的N末端为Q，因此具有在信号序列切割后，第1位残基Q可焦谷氨酰化而保护N末端氨基的优点。特别地，对于QET-Z34C1和QET-Z34C2，利用这些见解，在将添加序列控制到最小限度的同时，成功实现了修饰蛋白A的高分泌表达。即，除上述A)和B)的规则以外，进一步考虑下述C)的规则，在采用Corynex(注册商标)的亲和性蛋白质的表达中是有效的；

C)在N末端添加QET的三残基，用Corynex(注册商标)提高分泌效率；

以下，记载采用Corynex(注册商标)的表达探讨的实施例。

(1-4)CspB6Tev-QZ34C、QZ34C-60、QET-Z34C1、和QET-Z34C2的各分泌表达质粒的构建

作为修饰蛋白A(修饰Z34C)，分别设计上述CspB6Tev-QZ34C、QZ34C-60、QET-Z34C1、和QET-Z34C2这4种氨基酸序列，考虑到谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)的密码子使用频率而设计了编码这些蛋白质的碱基序列。进而，分别设计了以下的表达盒(expressioncassette)，使采用谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)的分泌表达成为可能。

CspB6Tev-QZ34C为来源于谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)ATCC13869株的CspB的信号肽的30个氨基酸残基、来源于该株的CspB成熟蛋白质的N末端的6个氨基酸残基QETNPT(SEQ ID NO:11)、proTev蛋白酶的识别序列ENLYFQ(SEQ ID NO:12)、和QZ34C的融合蛋白(以下，记作“CspBss-CspB6Tev-QZ34C”)。将编码设计的CspBss-CspB6Tev-QZ34C的碱基序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:13、14。对于CspB6Tev-QZ34C，在分泌表达后，通过用proTev蛋白酶切割，CspB6Tev序列QETNPTENLYFQ(SEQ ID NO:15)被除去，因此可获得QZ34C的蛋白质。

编码CspBss-CspB6Tev-QZ34C的碱基序列

atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctcaggagaccaacccaaccgagaacctgtacttccagcagaagaacatgcagtgtcagcgtcgcttctacgaggccctccacgaccctaacctcaacgaggaacagcgtaacgcgcgtattcgctccatccgcgatgactgctaa(SEQ ID NO:13)。

CspBss-CspB6Tev-QZ34C的氨基酸序列

MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAQETNPTENLYFQQKNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(SEQ ID NO:14)。

QZ34C-60为来源于产氨棒状杆菌(C.ammoniagenes)ATCC6872株的CspA的信号肽的25个氨基酸残基与QZ34C-60的融合蛋白(以下，记作“CspAss-QZ34C-60”)。将编码设计的CspAss-QZ34C-60的碱基序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:16、17。

编码CspAss-QZ34C-60的碱基序列

Atgaaacgcatgaaatcgctggctgcggcgctcaccgtcgctggggccatgctggccgcacctgtggcaacggcacagaccgcagacaaccagaagaacatgcagtgtcagcgtcgcttctacgaggccctccacgaccctaacctcaacgaggaacagcgtaacgcgcgtattcgctccatccgcgatgactgctcccagtccgcaaacctcctcgcagaggcacagcagctcaacgacgcacaggcaccacaggcataa(SEQ ID NO:16)。

CspAss-QZ34C-60的氨基酸序列

MKRMKSLAAALTVAGAMLAAPVATAQTADNQKNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDCSQSANLLAEAQQLNDAQAPQA(SEQ ID NO:17)。

QET-Z34C1为来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽的30个氨基酸残基、来源于该株的CspB成熟蛋白质的N末端的3个氨基酸残基QET、和Z34C1的融合蛋白(以下，记作“CspBss-QET-Z34C1”)。将编码设计的CspBss-QET-Z34C1的碱基序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:18、19。

编码CspBss-QET-Z34C1的碱基序列

atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctcaggagaccaagaacatgcagtgtcagcgtcgcttctacgaggccctccacgaccctaacctcaacgaggaacagcgtaacgcgcgtattcgctccatccgcgatgactgctaa(SEQ ID NO:18)。

CspBss-QET-Z34C1的氨基酸序列

MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAQETKNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(SEQ ID NO:19)。

关于QET-Z34C2，设计了来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽的30个氨基酸残基、来源于该株的CspB成熟蛋白质的N末端的3个氨基酸残基QET、和Z34C2的融合蛋白(以下，记作“CspBss-QET-Z34C2”)、以及编码该融合蛋白的碱基序列。将编码设计的CspBss-QET-Z34C2的碱基序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:20、21。

编码CspBss-QET-Z34C2的碱基序列

atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctcaggagaccttcaacaagcagtgtcagcgtcgcttctacgaggccctccacgaccctaacctcaacgaggaacagcgtaacgcgcgtattcgctccatccgcgatgactgctaa(SEQ ID NO:20)。

CspBss-QET-Z34C2的氨基酸序列

MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAQETFNKQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(SEQ ID NO:21)。

设计了在CspBss-CspB6Tev-QZ34C、CspAss-QZ34C-60、CspBss-QET-Z34C1、和CspBss-QET-Z34C2中记载的碱基序列的上游连接来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869株的cspB基因的启动子并进而在5'-侧添加KpnI位点、在3'-侧添加BamHI位点而成的4种的蛋白A修饰体的表达盒，并进行了全合成。通过将全合成的DNA片段(修饰蛋白A的表达盒)插入日本特开平9-322774中记载的pPK4的KpnI-BamHI部位，从而分别构建了作为修饰蛋白A的分泌表达质粒的pPK4_CspBss-CspB6Tev-QZ34C、pPK4_CspAss-QZ34C-60、pPK4_CspBss-QET-Z34C1、和pPK4_CspBss-QET-Z34C2。作为确定插入片段的碱基序列的结果，确认分别构建了符合设计的修饰蛋白A的表达盒。碱基序列的确定(测序)，使用BigDye(R)Terminator v3.1循环测序试剂盒(Cycle Sequencing Kit)(应用生物系统公司(Applied Biosystems))和3130基因分析仪(GeneticAnalyzer)(应用生物系统公司)进行。

(1-5)谷氨酸棒状杆菌中的各修饰蛋白A的分泌表达

使用上文中构建的pPK4_CspBss-CspB6Tev-QZ34C、pPK4_CspAss-QZ34C-60、pPK4_CspBs s-QET-Z34C1、和pPK4_CspBss-QET-Z34C2，对WO2016/171224中记载的谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)YDK010::phoS(W302C)株进行转化，获得了YDK010::phoS(W302C)/pPK4_Cs pBss-CspB6Tev-QZ34C株、YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspAss-QZ34C-60株、YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-QET-Z34C1株、和YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-QET-Z34C2株。谷氨酸棒状杆菌YDK010::phoS(W302C)株是将WO2002/081694中记载的谷氨酸棒状杆菌YDK010的野生型phoS基因取代为突变型phoS(W302C)基因而得的株。突变型phoS(W302C)基因编码第302位的色氨酸残基被半胱氨酸残基取代的PhoS蛋白质(W302C)。YDK010株是谷氨酸棒状杆菌AJ12036株(FERM BP-734)的细胞表层蛋白质PS2(CspB)的缺陷株。AJ12036株在1984年3月26日原本作为国际保藏保藏于工业技术院微生物工业技术研究所(现独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心，邮政编码:292-0818，地址:日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8120号室)，被授予保藏编号FERM BP-734。

将所得的各转化体用含25mg/L的卡那霉素的MMTG液体培养基(葡萄糖120g、硫酸镁七水合物3g、硫酸铵30g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸铁七水合物0.03g、硫酸锰五水合物0.03g、盐酸硫胺素0.45mg、生物素0.45mg、DL-甲硫氨酸0.15g、大豆盐酸水解液(总氮量0.2g)、碳酸钙50g，用水调至1L，调节至pH7.0)分别在30℃培养72小时。

培养结束后，将对各培养液离心分离而得的培养上清液6.5μL供于还原SDS-PAGE后，通过Quick-CBB(Wako)进行了染色。其结果是，在YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBs s-CspB6Tev-QZ34C株的培养上清液中检出了被推测为CspB6Tev-QZ34C的蛋白质条带(图5，泳道(Lane)2)，在YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspAss-QZ34C-60株的培养上清液中检出了被推测为QZ34C-60的蛋白质条带(图5，泳道3)，在YDK010::phoS(W302C)/pPK4_Csp Bss-QET-Z34C1株的培养上清液中检出了被推测为QET-Z34C1的蛋白质条带(图5，泳道4)，且在YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-QET-Z34C2株的培养上清液中检出了被推测为QET-Z34C2的蛋白质条带(图5，泳道5)。

(1-6)QET-Z34C3和QET-Z34C4的各分泌表达质粒的构建

作为修饰蛋白A(修饰Z34C)，分别设计上述QET-Z34C3和QET-Z34C4这2种氨基酸序列，考虑到谷氨酸棒状杆菌的密码子使用频率而设计了编码这些蛋白质的碱基序列。进而，分别设计了以下的表达盒，以使采用谷氨酸棒状杆菌的分泌表达成为可能。

QET-Z34C3为来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽的30个氨基酸残基、来源于该株的CspB成熟蛋白质的N末端的3个氨基酸残基QET、和Z34C3的融合蛋白(以下，记作“CspBss-QET-Z34C3”)。将编码设计的CspBss-QET-Z34C3的碱基序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:55、56。

编码CspBss-QET-Z34C3的碱基序列

atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctcaggagaccttcaacatgcagtgtcagcgtcgcttctacgaggccctccacgaccctaacctcaacaaggaacagcgtaacgcgcgtattcgctccatccgcgatgactgctaa(SEQ ID NO:55)。

CspBss-QET-Z34C3的氨基酸序列

MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAQETFNMQCQRRFYEALHDPNLNKEQRNARIRSIRDDC(SEQ ID NO:56)。

QET-Z34C4为来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽的30个氨基酸残基、来源于该株的CspB成熟蛋白质的N末端的3个氨基酸残基QET、和Z34C4的融合蛋白(以下，记作“CspBss-QET-Z34C4”)。将编码设计的CspBss-QET-Z34C4的碱基序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:57、58。

编码CspBss-QET-Z34C4的碱基序列

atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctcaggagaccttcaacatgcagtgtcagcgtcgcttctacgaggccctccacgaccctaacctcaacgaggaacagcgtaacgcgcgtattcgctccatcaaggatgactgctaa(SEQ ID NO:57)。

CspBss-QET-Z34C4的氨基酸序列

MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAQETFNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC(SEQ ID NO:58)。

设计了在CspBss-QET-Z34C3和CspBss-QET-Z34C4中记载的碱基序列的上游连接来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869株的cspB基因的启动子并进而在5'-侧添加KpnI位点、在3'-侧添加BamHI位点而成的蛋白A修饰体的表达盒，并进行了全合成。通过将全合成的DNA片段(修饰蛋白A的表达盒)插入日本特开平9-322774中记载的pPK4的KpnI-BamHI部位，从而分别构建了作为修饰蛋白A的分泌表达质粒的pPK4_CspBss-QET-Z34C3和pPK4_CspBss-QET-Z34C4。作为确定插入片段的碱基序列的结果，确认分别构建了符合设计的修饰蛋白A的表达盒。碱基序列的确定，使用BigDye(R)Terminator v3.1循环测序试剂盒(应用生物系统公司)和3130基因分析仪(应用生物系统公司)进行。

(1-7)谷氨酸棒状杆菌中的各修饰蛋白A的分泌表达

使用上文中构建的pPK4_CspBss-QET-Z34C3和pPK4_CspBss-QET-Z34C4，对WO2016/171224中记载的谷氨酸棒状杆菌YDK010::phoS(W302C)株进行转化，获得了YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-QET-Z34C3株和YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-QET-Z34C4株。

将所得的各转化体用含25mg/L的卡那霉素的MMTG液体培养基分别在30℃培养72小时。

培养结束后，将对各培养液离心分离而得的培养上清液6.5μL供于还原SDS-PAGE后，通过Quick-CBB(Wako)进行了染色。其结果是，在YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-QET-Z34C3株的培养上清液中检出了被推测为QET-Z34C3的蛋白质条带(图24，泳道2)，且在YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-QET-Z34C4株的培养上清液中检出了被推测为QET-Z34C4的蛋白质条带(图24，泳道3)。

(实施例2)修饰Fc-III的设计及其在谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)中的分泌表达(2-1)修饰Fc-III的设计的概要

作为具有与人IgG的结合能力的肽，报道有由DCAWHLGELVWCT(SEQ ID NO:54)的氨基酸序列形成的Fc-III(WO2001/045746)。按照实施例(1-1)中记载的规则A)和B)以及实施例(1-3)中记载的规则C)修饰Fc-III，设计了下述修饰Fc-III。

(2-2)修饰Fc-III的制备

制备了以下的修饰Fc-III；

(g)QET-LV

QETRGNCAYHKGQLVWCTYH(SEQ ID NO:24)

(h)QET-II

QETRGNCAYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:25)。

(2-3)QET-LV和QET-II的各分泌表达质粒的构建

作为修饰Fc-III，分别设计上述QET-LV和QET-II这2种氨基酸序列，考虑到谷氨酸棒状杆菌的密码子使用频率而设计了编码这些蛋白质的碱基序列。另外，分别设计了以下的表达盒，以使采用谷氨酸棒状杆菌的分泌表达成为可能。

QET-LV为来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽的30个氨基酸残基、来源于该株的CspB成熟蛋白质的N末端的3个氨基酸残基QET、和LV的融合蛋白(以下，记作“CspBss-QET-LV”)。将编码设计的CspBss-QET-LV的碱基序列和氨基酸序列分别示于SEQID NO:59、60。

编码CspBss-QET-LV的碱基序列

atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctcaggagacccgcggcaactgcgcataccacaagggccagctggtgtggtgcacctaccactaa(SEQ ID NO:59)。

CspBss-QET-LV的氨基酸序列

MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAQETRGNCAYHKGQLVWCTYH(SEQ ID NO:60)。

QET-II为来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869株的CspB的信号肽的30个氨基酸残基、来源于该株的CspB成熟蛋白质的N末端的3个氨基酸残基QET、和II的融合蛋白(以下，记作“CspBss-QET-II”)。将编码设计的CspBss-QET-II的碱基序列和氨基酸序列分别示于SEQID NO:61、62。

编码CspBss-QET-II的碱基序列

atgtttaacaaccgtatccgcactgcagctctcgctggtgcaatcgcaatctccaccgcagcttccggcgtagctatcccagcattcgctcaggagacccgcggcaactgcgcataccacaagggccagatcatctggtgcacctaccactaa(SEQ ID NO:61)。

CspBss-QET-II的氨基酸序列

MFNNRIRTAALAGAIAISTAASGVAIPAFAQETRGNCAYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:62)。

设计了在CspBss-QET-LV和CspBss-QET-II中记载的碱基序列的上游连接来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869株的cspB基因的启动子、并进而在5'-侧添加KpnI位点、在3'-侧添加BamHI位点而成的修饰Fc-III的表达盒，并进行了全合成。通过将全合成的DNA片段(修饰Fc-III的表达盒)插入日本特开平9-322774中记载的pPK4的KpnI-BamHI部位，从而分别构建了作为修饰Fc-III的分泌表达质粒的pPK4_CspBss-QET-LV和pPK4_CspBss-QET-II。作为确定插入片段的碱基序列的结果，确认分别构建了符合设计的修饰Fc-III的表达盒。碱基序列的确定，使用BigDye(R)Terminator v3.1循环测序试剂盒(应用生物系统公司)和3130基因分析仪(应用生物系统公司)进行。

(2-4)谷氨酸棒状杆菌中的各修饰Fc-III的分泌表达

使用上文中构建的pPK4_CspBss-QET-LV和pPK4_CspBss-QET-II，对WO2016/171224中记载的谷氨酸棒状杆菌YDK010::phoS(W302C)株进行转化，获得了YDK010::phoS(W302C)/pPK4 CspBss-QET-LV株、和YDK010::phoS(W302C)/pPK4 CspBss-QET-II株。

将所得的各转化体用含25mg/L的卡那霉素的MMTG液体培养基分别在30℃培养72小时。

培养结束后，将对各培养液离心分离而得的培养上清液6.5μL、或者未离心分离而均匀含有菌体和培养上清液的培养液6.5μL供于还原SDS-PAGE后，通过Quick-CBB(Wako)进行了染色。其结果是，在YDK010::phoS(W302C)/pPK4 CspBss-QET-LV株的培养上清液中检出了被推测为QET-LV的肽的条带(图25，泳道2-3)，且在含菌体的培养液样品中也同样检出了被推测为QET-LV的肽的条带(图25，泳道7-8)。

在YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspBss-QET-II株的培养上清液中几乎未检出被推测为QET-II的肽的条带(图25，泳道4-5)，而在含菌体的培养液样品中检出了被推测为QET-II的肽的条带(图25，泳道9-10)。

根据以上的结果，可认为QET-LV在分泌后主要溶解存在于培养上清液中，而QET-II在分泌后凝集存在于培养上清液中，或吸附存在于培养菌体的细胞表层中。

(实施例3)具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物的制备为了除去培养液中的杂质成分，表达的蛋白质通过反相制备HPLC纯化一次。使二硫连接体(disulfide linker)与经纯化的蛋白质结合。具体来说，如下进行。

(3-1)具有针对抗体的亲和性物质(CspB6Tev-QZ34C)、切割性部分及反应性基团的化合物的制备作为针对抗体的亲和性物质，采用CspB6Tev-QZ34C。将QETNPTENLYFQQKNMQCQRRF YEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(SEQ ID NO:7)(13.0mg，2.24μmol，其中，第18位和第47位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(3,3'-dithiodipropionic acid di(N-succinimid yl))(18.0mg，44.8μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认了各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述表达蛋白质二硫连接体偶联物-NHS活化体(expressed protein-and disul fide linker-coupled NHS-activationcompound)(0.50mg，0.08μmol)。

(3-2)具有针对抗体的亲和性物质(QZ34C-60)、切割性部分及反应性基团的化合物的制备作为针对抗体的亲和性物质，采用QZ34C-60。将QTADNQKNMQCQRRFYEALHDPNLNE EQRNARIRSIRDDCSQSANLLAEAQQLNDAQAPQA(SEQ ID NO:8)(15.8mg，2.16μmo l，其中，第11位和第40位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(17.5mg，43.2μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认了各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述表达蛋白质二硫连接体偶联物-NHS活化体(5.20mg，0.71μmol)。

(3-3)具有针对抗体的亲和性物质(QET-Z34C1)、切割性部分及反应性基团的化合物的制备作为针对抗体的亲和性物质，采用QET-Z34C1。将QETKNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(SEQ ID NO:9)(6.70mg，1.46μmol，其中，第8位和第37位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(11.8mg，29.2μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.20mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认了各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述表达蛋白质二硫连接体偶联物-NHS活化体(1.00mg，0.21μmol)。

(3-4)具有针对抗体的亲和性物质(QET-Z34C2)、切割性部分及反应性基团的化合物的制备作为针对抗体的亲和性物质，采用QET-Z34C2。将QETFNKQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIRDDC(SEQ ID NO:10)(9.50mg，2.07μmol，其中，第8位和第37位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.20mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(33.0mg，82.8μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认了各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述表达蛋白质二硫连接体偶联物-NHS活化体(0.90mg，0.18μmol)。

(实施例4)具有针对抗体的亲和性物质(CspB6Tev-QZ34C)及切割性部分的抗体的制备对于抗HER2抗体曲妥珠单抗，通过与上述(3-1)中制备的化合物的偶联反应而特异性地进行修饰，制备了具有针对抗体的亲和性物质(CspB6Tev-QZ34C)及切割性部分的抗体。接着，对所制备的抗体进行了分析。

(4-1)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析将上述(3-1)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺并使浓度成为21.6mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于171μL的50mM的乙酸钠缓冲液(pH 5.5)，加入8.5μL的4mM的肽试剂(相对于抗体为10当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定了质量，结果是，关于原料的曲妥珠单抗，在148059观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在154033观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在160000确认到峰。

(4-2)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认向上述(4-1)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定了质量，结果是，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50756观测到重链峰，在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入硫代丙酰基(thiopropionyl)后在50683、50845观测到重链峰，与原料同样在23439观测到轻链峰。

(4-3)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析通过HIC对上述(4-1)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi ResHIC柱(沃特世(Waters)公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer(A缓冲液):0.1M PiNa,2.3M(NH

对于样品，按照以下的条件进行反应；

a:曲妥珠单抗原料；

b:曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体10当量。

其结果是，获得了图6的色谱图。保留时间(retension time)9.7365分钟被认为是曲妥珠单抗原料，9.4815分钟被认为是引入了1个肽的化合物，9.1342分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图6)。

(实施例5)具有针对抗体的亲和性物质(QZ34C-60)及切割性部分的抗体的制备对于抗HER2抗体曲妥珠单抗，通过与上述(3-2)中制备的化合物的偶联反应而特异性地进行修饰，制备了具有针对抗体的亲和性物质(QZ34C-60)及切割性部分的抗体。接着，对所制备的抗体进行了分析。

(5-1)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析将上述(3-2)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺并使浓度成为1.8mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于171μL的50mM的乙酸钠缓冲液(pH 5.5)，加入9.4μL的1.8mM的肽试剂(相对于抗体为10当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定了质量，结果是，关于原料的曲妥珠单抗，在148228观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在155416观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在162595确认到峰。

(5-2)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认向上述(5-1)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定了质量，结果是，关于原料的曲妥珠单抗，在50596、50757观测到重链峰，在23440观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入硫代丙酰基后在50679、50844观测到重链峰，与原料同样在23440观测到轻链峰。

(5-3)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析通过HIC对上述(5-1)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi ResHIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer：0.1M PiNa,2.3M(NH

对于样品，按照以下的条件进行反应；

a：曲妥珠单抗原料；

b：曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体10当量。

其结果是，获得了图7的色谱图。保留时间9.9634分钟被认为是曲妥珠单抗原料，9.5868分钟被认为是引入了1个肽的化合物，9.1212分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图7)。

(实施例6)具有针对抗体的亲和性物质(QET-Z34C1)及切割性部分的抗体的制备对于抗HER2抗体曲妥珠单抗，通过与上述(3-3)中制备的化合物的偶联反应而特异性地进行修饰，制备了具有针对抗体的亲和性物质(QET-Z34C1)及切割性部分的抗体。接着，对所制备的抗体进行了分析。

(6-1)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析将上述(3-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺并使浓度成为3.6mM。使250μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于84.4μL的50mM的乙酸钠缓冲液(pH 5.5)，加入4.7μL的3.6mM的肽试剂(相对于抗体为10当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定了质量，结果是，关于原料的曲妥珠单抗，在148226观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在151027观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在153022确认到峰。

(6-2)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认向上述(6-1)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定了质量，结果是，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50756观测到重链峰，在23439观测到轻链峰；关于产物，在重链中引入硫代丙酰基后在50681、50845观测到重链峰，与原料同样在23439观测到轻链峰。

(6-3)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析通过HIC对上述(6-1)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi ResHIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer：0.1M PiNa,2.3M(NH

对于样品，按照以下的条件进行反应；

a：曲妥珠单抗原料；

b：曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体10当量。

其结果是，获得了图8的色谱图。保留时间11.3730分钟被认为是曲妥珠单抗原料，10.7783分钟被认为是引入了1个肽的化合物，9.8747分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图8)。

(6-4)曲妥珠单抗-肽复合物的连接体切割和再氧化

如果进行上述(6-1)中得到的抗体-肽复合物的连接体切割和再氧化，就可获得对EU numbering中的Lys246及Lys248位置选择性地引入了硫代丙酰基的抗体(即，位置选择性地具有生物正交性官能团的抗体)。

(连接体切割)

将400μg的抗体-肽复合物溶解于60mM的磷酸盐缓冲液(pH 8.0)，使浓度成为72μM后，添加10.0μL的20mM的D,L-二硫苏糖醇(相对于曲妥珠单抗-肽复合物为60当量)，室温下搅拌16小时，对连接体中的二硫键进行切割。

(再氧化)

接着，为了使与连接体中的二硫键一起被切割的抗体中的二硫键再次结合，进行了再氧化的工序(Jagath R Junutula等，NATURE BIOTECHNOLOGY，26(8)，925-932(2008))。具体来说，将反应液用Amicon 10K溶剂置换为9.57mM的PBS缓冲液(pH 7.0)，将曲妥珠单抗-肽复合物的浓度调整为18μM后，加入6.4μL的10mM的脱氢抗坏血酸(相对于曲妥珠单抗-肽复合物为20当量)并搅拌3小时，从而进行再氧化。

(实施例7)具有针对抗体的亲和性物质(QET-Z34C2)及切割性部分的抗体的制备对于抗HER2抗体曲妥珠单抗，通过与上述(3-4)中制备的化合物的偶联反应而特异性地进行修饰，制备了具有针对抗体的亲和性物质(QET-Z34C2)及切割性部分的抗体。接着，对所制备的抗体进行了分析。

(7-1)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析将上述(3-4)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺并使浓度成为9.2mM。使1000μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于200μL的20mM的乙酸钠缓冲液(pH 6.5)，加入20μL的9.2mM的肽试剂(相对于抗体为27当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为100mM的柠檬酸钠缓冲液(pH 2.9)而使反应停止，进而置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定了质量，结果是，关于原料的曲妥珠单抗，在148234观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在152978观测到峰，引入了2个结合性肽的产物在157721确认到峰。

(7-2)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析通过HIC对上述(7-1)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。柱使用了Protein-Pak Hi ResHIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer：0.1M PiNa,2.3M(NH

对于样品，按照以下的条件进行反应；

a：曲妥珠单抗原料；

b：曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体27当量。

其结果是，获得了图9的色谱图。保留时间10.0384分钟被认为是曲妥珠单抗原料，9.4324分钟被认为是引入了1个肽的化合物，8.5647分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图9)。

(实施例8)通过使用针对抗体的亲和性物质(CspB6Tev-QZ34C)制备的曲妥珠单抗的巯基引入体的基于胰蛋白酶处理的肽谱分析(8-1)曲妥珠单抗的巯基引入体的胰蛋白酶处理

对于上述(4-1)中得到的曲妥珠单抗的巯基引入体通过PNGaseF(新英格兰生物实验室(New England BioLabs)公司制)进行了糖链切割后，进行了肽谱分析。向1.5mL低吸附微试管中加入10μL样品溶液、50mM碳酸氢铵缓冲液、10μL的溶解于40％三氟乙醇的20mM的二硫苏糖醇水溶液，在65℃加温1小时后，添加10μL的50mM的碘乙酰胺水溶液，遮光下于室温反应30分钟。反应后，加入40μL的50mM碳酸氢铵缓冲液并进行搅拌，添加10μL的20ng/μL的胰蛋白酶水溶液并在37℃进行了16小时的酶消化。消化后，加入2μL的20％三氟乙酸水溶液，停止反应，实施了LC-MS/MS测定。

(8-2)曲妥珠单抗的LC-MS/MS测定条件(分析装置)

纳米HPLC：EASY-nLC 1000(赛默飞世尔科技公司)

质谱仪：Tribrid质谱仪Orbitrap Fusion(赛默飞世尔科技公司)。

(HPLC分析条件)

捕获柱：Acclaim PepMap(注册商标)100，75μm×2cm(赛默飞世尔科技公司)

分析柱：ESI-柱(NTCC-360/75-3-125，75μm×12.5cm，3μm(日京技术株式会社，Nikkyo Technos Co.,Ltd.))

流动相A：0.1％甲酸水溶液

流动相B：0.1％甲酸，乙腈溶液

加样溶液：0.1％三氟乙酸水溶液

流速：300nL/分钟

样品注入量：1μL

梯度条件(B％)：2％(0.0-0.5分钟)、2％→30％(0.5-23.5分钟)、30％→75％(23.5-25.5分钟)、75％(25.5-35.0分钟)。

(质谱仪的分析条件)

离子化方法：ESI，正离子化(Positive)模式

扫描类型：数据依赖性获取(DataDependentAcquisition)

活化类型(Activation Type)：碰撞诱导离解(Collision InducedDissociation，CID)

关于数据的获取，使用作为附属软件的Xcalibur 3.0(赛默飞世尔科技公司)及Thermo Orbitrap Fusion TuneApplication 2.0(赛默飞世尔科技公司)进行。

(8-3)曲妥珠单抗的修饰部位的分析条件

关于对LC-MS/MS测定结果的修饰部位分析，使用Proteome Discoverer version1.4(赛默飞世尔科技公司)进行。

关于采用Proteome Discoverer的分析，使用Sequest HT作为搜索引擎，前体离子的范围设为350～5000Da，总强度阈值(Total Intensity Threshold)设为峰顶的强度的0.01％。此外，将胰蛋白酶设定为消化酶，最大漏切位点(Maximum Missed Cleavage Site)设为3。此外，前体和碎片离子(fragment ion)的质量容差(Mass Tolerance)分别设为5ppm和0.5Da。关于静态修饰(Static Modification)，作为采用碘乙酰胺的半胱氨酸残基的修饰，设定了脲甲基化(Carbamidomethyl)(+57.021Da)。关于动态修饰(DynamicModification)，设定了甲硫氨酸残基的氧化(+15.995Da)和对赖氨酸残基的修饰体(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))。进而，设置筛选器(filter)以使肽置信度(Peptide Confidence)仅为高。

此外，作为修饰部位的检索对象的氨基酸序列的数据，使用图4所示的(1)、(3)。

(8-4)曲妥珠单抗的基于LC-MS/MS的修饰部位的分析结果

使用LC-MS/MS的分析结果是，观测到曲妥珠单抗的采用胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的由33个氨基酸残基形成的肽、THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(SEQ ID NO:26)的肽片段的MS谱(实测值：m/z 952.23196，理论值：952.22900，4价)(图10)，根据CID谱确认了表示重链的EU numbering中的第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰的、相当于2价的y12的m/z 764.68(理论值：764.40)的产物离子(图11-1)。此外，通过采用Proteome Discoverer的分析，表明高选择性地发生了对第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰(图11-2)。

由该结果可知，上述(4-1)中，抗体的重链上，在EU numbering中的Lys246及Lys248位置选择性地进行偶联。

(实施例9)通过使用针对抗体的亲和性物质(QZ34C-60)制备的曲妥珠单抗的巯基引入体的基于胰蛋白酶处理的肽谱分析(9-1)曲妥珠单抗的巯基引入体的胰蛋白酶处理

对上述(5-1)中得到的曲妥珠单抗的巯基引入体进行与上述(8-1)同样的处理，然后实施LC-MS/MS测定。

(9-2)曲妥珠单抗的LC-MS/MS测定条件

HPLC和质谱分析的测定装置和测定条件与上述(8-2)中相同。

(9-3)曲妥珠单抗的修饰部位的分析条件

针对LC-MS/MS测定结果的修饰部位分析的条件与上述(8-3)中相同。

(9-4)曲妥珠单抗的基于LC-MS/MS的修饰部位的分析结果

使用LC-MS/MS的分析结果是，观测到曲妥珠单抗的采用胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的由33个氨基酸残基形成的肽THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(SEQ ID NO:26)的肽片段的MS谱(实测值：m/z 952.23227，理论值：952.22900，4价)(图12)；根据CID谱确认了表示重链的EU numbering中的第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰的相当于2价的y13的m/z838.23(理论值：837.94)的产物离子(图13-1)。此外，通过采用Proteome Discoverer的分析，表明高选择性地发生了对第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰(图13-2)。

由该结果可知，上述(5-1)中，抗体的重链上，在EU numbering中的Lys246及Lys248位置选择性地进行偶联。

(实施例10)通过使用针对抗体的亲和性物质(QET-Z34C2)制备的曲妥珠单抗的巯基引入体的基于胰蛋白酶处理的肽谱分析(10-1)曲妥珠单抗的巯基引入体的胰蛋白酶处理

对上述(7-1)中得到的曲妥珠单抗的巯基引入体进行与上述(8-1)同样的处理，然后实施LC-MS/MS测定。

(10-2)曲妥珠单抗的LC-MS/MS测定条件

HPLC和质谱分析的测定装置和测定条件与上述(8-2)中相同。

(10-3)曲妥珠单抗的修饰部位的分析条件

针对LC-MS/MS测定结果的修饰部位分析的条件与上述(8-3)中相同。

(10-4)曲妥珠单抗的基于LC-MS/MS的修饰部位的分析结果

使用LC-MS/MS的分析结果是，观测到曲妥珠单抗的采用胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的由33个氨基酸残基形成的肽THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(SEQ ID NO:26)的肽片段的MS谱(实测值：m/z 952.23032，理论值：952.22900，4价)(图14)；根据CID谱确认了表示重链的EU numbering中的第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰的相当于2价的y13的m/z838.29(理论值：837.94)的产物离子(图15-1)。此外，通过采用Proteome Discoverer的分析，表明高选择性地发生了对第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰(图15-2)。

由该结果可知，上述(7-1)中，抗体的重链上，在EU numbering中的Lys246及Lys248位置选择性地进行偶联。

(实施例11)具有针对抗体的亲和性物质(QET-Z34C4)及切割性部分的抗体的制备及分析

(11-1)具有针对抗体的亲和性物质(QET-Z34C4)、切割性部分及反应性基团的化合物的制备将QETFNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC(SEQ ID NO:23)(44.0mg，9.70μmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.60mL)，加入将3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(78.0mg，194mol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(0.40mL)而得的溶液，室温下搅拌24小时。通过减压浓缩而除去乙腈后，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认了各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述表达蛋白质二硫连接体偶联物-NHS活化体(15mg，3.10μmol)；MS(ESI)m/z:z＝41210.1[M+4H]

(11-2)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析(11-1)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于二甲亚砜并使浓度成为10mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于188μL的20mM的乙酸钠缓冲液(pH5.5)，加入3.88μL的10mM的肽试剂(相对于抗体为10当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为9.56mM的PBS缓冲液。向200μL的置换为PBS缓冲液的曲妥珠单抗的特异性修饰体(抗体200μg)中加入20μL的Glyco Buffer、8μL的PNGaseF(50000单位/mL)，在37℃搅拌24小时。将反应液置换为20mM乙酸铵水溶液，通过ESI-TOFMS测定了质量，结果是，关于原料的曲妥珠单抗，在145170观测到峰，引入了1个结合性肽的产物在149901确认到峰，引入了2个结合性肽的产物在154628确认到峰。

(实施例12)通过使用针对抗体的亲和性物质(QET-Z34C4)制备的曲妥珠单抗的巯基引入体的基于胰蛋白酶处理的肽谱分析(12-1)曲妥珠单抗的巯基引入体的胰蛋白酶处理

对于上述(11-2)中得到的曲妥珠单抗的巯基引入体进行了肽谱分析。向1.5mL低吸附微试管中加入10μL样品溶液、50mM碳酸氢铵缓冲液、10μL的溶解于40％三氟乙醇的20mM的二硫苏糖醇水溶液，在65℃加温1小时后，添加10μL的50mM的碘乙酰胺水溶液，遮光下于室温反应30分钟。反应后，加入40μL的50mM碳酸氢铵缓冲液并进行搅拌，添加10μL的20ng/μL的胰蛋白酶水溶液并在37℃进行了16小时的酶消化。消化后，加入2μL的20％三氟乙酸水溶液，停止反应，实施了LC-MS/MS测定。

(12-2)曲妥珠单抗的LC-MS/MS测定条件(分析装置)

纳米HPLC：EASY-nLC 1000(赛默飞世尔科技公司)

质谱仪：Tribrid质谱仪Orbitrap Fusion(赛默飞世尔科技公司)。

(HPLC分析条件)

捕获柱：Acclaim PepMap(注册商标)100，75μm×2cm(赛默飞世尔科技公司)

分析柱：ESI-柱(NTCC-360/75-3-125,75μm×12.5cm,3μm(日京技术株式会社))

流动相A：0.1％甲酸水溶液

流动相B：0.1％甲酸，乙腈溶液

加样溶液：0.1％三氟乙酸水溶液

流速：300nL/分钟

样品注入量：1μL

梯度条件(B％)：2％(0.0-0.5分钟)、2％→30％(0.5-23.5分钟)、30％→75％(23.5-25.5分钟)、75％(25.5-35.0分钟)。

(质谱仪的分析条件)

离子化方法：ESI，正离子化模式

扫描类型：数据依赖性获取

活化类型：碰撞诱导离解(CID)

关于数据的获取，使用作为附属软件的Xcalibur 3.0(赛默飞世尔科技公司)及Thermo Orbitrap Fusion TuneApplication 2.0(赛默飞世尔科技公司)进行。

(12-3)曲妥珠单抗的修饰部位的分析条件

关于对LC-MS/MS测定结果的修饰部位分析，使用BioPharma Finder 3.0(赛默飞世尔科技公司)进行。

使用BioPharma Finder的分析中，将S/N阈值设为1，按照MS噪声水平为峰顶强度的0.01％的条件设定并实施。此外，消化酶采用胰蛋白酶，特异性(Specificity)设为高。进而，峰检测时的质量容差(Mass Tolerance)设为4ppm，肽鉴定时的质量准确度(MassAccuracy)设为5ppm。对于静态修饰(Static Modification)，作为采用碘乙酰胺的半胱氨酸残基的修饰，设定了脲甲基(Carbamidomethyl)(+57.021Da)。关于动态修饰(DynamicModification)，设定了甲硫氨酸残基的氧化(+15.995Da)和对赖氨酸残基的修饰体(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))。此外，设定了筛选器(filter)，使得仅获得置信度评分(Confidence Score)为80以上、且可观测MS/MS的那些。

此外，作为修饰部位的检索对象的氨基酸序列的数据，使用图4所示的(1)、(3)。

(12-4)曲妥珠单抗的基于LC-MS/MS的修饰部位的分析结果

使用LC-MS/MS的分析结果是，观测到曲妥珠单抗的采用胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的由18个氨基酸残基形成的肽FNWYVDGVEVHNAKTKPR(SEQ ID NO:50)的肽片段的MS谱(实测值：m/z769.04353，理论值：769.04482，3价)(图26)；根据CID谱确认了表示重链的EUnumbering中的第288位或第290位的赖氨酸残基的修饰的相当于2价的y16的m/z 1022.73(理论值：1022.51)的产物离子(图27-1)。此外，通过采用BioPharma Finder的分析，表明高选择性地发生了对第288位或第290位的赖氨酸残基的修饰(图27-2)。

由该结果可知，上述(11-2)中，抗体的重链上，在EU numbering中的Lys288及Lys290位置选择性地进行偶联。

(实施例13)具有针对抗体的亲和性物质(修饰Fc-III(QET-LV))及切割性部分的抗体的制备及分析

(13-1)具有针对抗体的亲和性物质(修饰Fc-III(QET-LV))、切割性部分及反应性基团的化合物的制备

将QETRGNCAYHKGQLVWCTYH(SEQ ID NO:24)(50.0mg，21.0μmol，其中，第7位和第17位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)，加入3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(255mg，630μmol)，室温下搅拌24小时。通过LC-MS确认反应后，溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认了各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物(1.2mg，0.45μmol)。

(13-2)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析将(13-1)中合成的肽连接体偶联物溶解于二甲亚砜并使浓度成为20mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于100μL(500μg/100μL)的50mM的乙酸钠缓冲液(pH4.7，pH 5.5)，加入1.69μL的20mM的肽试剂(相对于抗体为10当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为20mM的乙酸铵缓冲液。通过ESI-TOFMS测定了质量(质谱)，结果是，关于原料的曲妥珠单抗，在148222观测到峰。关于pH4.7，引入了2个结合性肽的情形在153323确认到峰。关于pH5.5，引入了2个结合性肽的情形在153511确认到峰(图28)。

(13-3)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认向(13-2)中生成的抗体-肽复合物中加入2μL的100mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，室温下搅拌15分钟。通过ESI-TOFMS测定了质量，结果是，关于原料的曲妥珠单抗，在50594、50755观测到重链峰，在23439观测到轻链峰；关于pH4.7，引入了连接体的情形在50681、50843确认到重链峰，与原料同样在23439确认到轻链峰，引入了连接体的情形在23526确认到峰。关于pH5.5，引入了连接体的情形在50681、50843确认到重链峰，与原料同样在23439确认到轻链峰，引入了连接体的情形在23526确认到峰。关于pH6.4，引入了连接体的情形在50681、50843确认到重链峰，与原料同样在23439确认到轻链峰，引入了连接体的情形在23526确认到峰。关于pH7.4，引入了连接体的情形在50681、50843确认到重链峰，与原料同样在23439确认到轻链峰，引入了连接体的情形在23527确认到峰。关于pH8.0，引入了连接体的情形在50681、50844确认到重链峰，与原料同样在23439确认到轻链峰，引入了连接体的情形在23527确认到峰(图29)。

(13-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析通过HIC对(13-2)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。关于柱，使用了Protein-Pak Hi ResHIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer：0.1M PiNa,2.3M(NH

对于样品，按照以下的条件进行反应；

a：曲妥珠单抗原料；

b：曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体10当量。

其结果是，获得了图30的色谱图。保留时间10.255分钟被认为是曲妥珠单抗原料，11.294分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图30)。

(实施例14)通过使用针对抗体的亲和性物质(修饰Fc-III(QET-LV))制备的曲妥珠单抗的巯基引入体的基于胰蛋白酶处理的肽谱分析(14-1)曲妥珠单抗的巯基引入体的胰蛋白酶处理

对于上述(13-2)中得到的曲妥珠单抗的巯基引入体通过PNGaseF(新英格兰生物实验室公司制)进行了糖链切割后，进行了肽谱分析。向1.5mL低吸附微试管中加入10μL样品溶液、50mM碳酸氢铵缓冲液、10μL的溶解于40％三氟乙醇的20mM的二硫苏糖醇水溶液，在65℃加温1小时后，添加10μL的50mM的碘乙酰胺水溶液，遮光下于室温反应30分钟。反应后，加入40μL的50mM碳酸氢铵缓冲液并进行搅拌，添加10μL的20ng/μL的胰蛋白酶水溶液并在37℃进行了16小时的酶消化。消化后，加入2μL的20％三氟乙酸水溶液，停止反应，实施了LC-MS/MS测定。

(14-2)曲妥珠单抗的LC-MS/MS测定条件(分析装置)

纳米HPLC：EASY-nLC 1000(赛默飞世尔科技公司)

质谱仪：Tribrid质谱仪Orbitrap Fusion(赛默飞世尔科技公司)。

(HPLC分析条件)

捕获柱：Acclaim PepMap(注册商标)100，75μm×2cm(赛默飞世尔科技公司)

分析柱：ESI-柱(NTCC-360/75-3-125，75μm×12.5cm，3μm(日京技术株式会社))

流动相A：0.1％甲酸水溶液

流动相B：0.1％甲酸，乙腈溶液

加样溶液：0.1％三氟乙酸水溶液

流速：300nL/分钟

样品注入量：1μL

梯度条件(B％)：2％(0.0-0.5分钟)、2％→30％(0.5-23.5分钟)、30％→75％(23.5-25.5分钟)、75％(25.5-35.0分钟)。

(质谱仪分析条件)

离子化方法：ESI，正离子化模式

扫描类型：数据依赖性获取

活化类型：碰撞诱导离解(CID)

关于数据的获取，使用作为附属软件的Xcalibur 3.0(赛默飞世尔科技公司)及Thermo Orbitrap Fusion TuneApplication 2.0(赛默飞世尔科技公司)进行。

(14-3)曲妥珠单抗的修饰部位的分析条件

关于对LC-MS/MS测定结果的修饰部位分析，使用BioPharma Finder 3.0(赛默飞世尔科技公司)进行。

使用BioPharma Finder的分析中，将S/N阈值设定为1，按照MS噪声水平为峰顶强度的0.01％的条件设定并实施。此外，消化酶采用胰蛋白酶，将特异性(Specificity)设定为高(High)。进而，峰检测时的质量容差(Mass Tolerance)设为4ppm，肽鉴定时的质量准确度(Mass Accuracy)设为5ppm。关于静态修饰(Static Modification)，作为采用碘乙酰胺的半胱氨酸残基的修饰，设定了脲甲基(Carbamidomethyl)(+57.021Da)。关于动态修饰(Dynamic Modification)，设定了甲硫氨酸残基的氧化(+15.995Da)和对赖氨酸残基的修饰体(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))。此外，设定了筛选器(filter)，使得仅获得置信度评分(Confidence Score)为80以上、且可观测MS/MS的那些。

此外，作为修饰部位的检索对象的氨基酸序列的数据，使用图4所示的(1)、(3)。

(14-4)曲妥珠单抗的基于LC-MS/MS的修饰部位的分析结果

使用LC-MS/MS的分析结果是，观测到曲妥珠单抗的采用胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的由33个氨基酸残基形成的肽THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR(SEQ ID NO:26)的肽片段的MS谱(实测值：m/z 952.23425，理论值：952.22942，4价)(图31)；根据CID谱确认了表示重链的EU numbering中的第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰的相当于2价的y20的m/z1166.99(理论值：1166.61)的产物离子(图32-1)。此外，通过采用BioPharma Finder的分析，表明高选择性地发生了对第246位或第248位的赖氨酸残基的修饰(图32-2)。

由该结果可知，上述(13-2)中，抗体的重链上，在EU numbering中的Lys246及Lys248位置选择性地进行偶联。

(实施例15)具有针对抗体的亲和性物质(修饰Fc-III(QET-II))及切割性部分的抗体的制备及分析

(15-1)具有针对抗体的亲和性物质(修饰Fc-III(QET-II))、切割性部分及反应性基团的化合物的制备

将QETRGNCAYHKGQIIWCTYH(SEQ ID NO:25)(46.0mg，20.0μmol，其中，第7位和第17位的2个半胱氨酸分别在分子内形成二硫键)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1.00mL)，加入3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(255mg，630μmol)，室温下搅拌24小时。通过LC-MS确认反应后，溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认了各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得上述肽二硫连接体偶联物(2.5mg，1.10μmol)。

(15-2)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析将(15-1)中合成的肽连接体偶联物溶解于二甲亚砜并使浓度成为20mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于100μL(500μg/100μL)的50mM的乙酸钠缓冲液(pH4.7，pH5.5)，加入1.69μL的20mM的肽试剂(相对于抗体为10当量)，室温下搅拌1小时。将反应液置换为20mM的乙酸铵缓冲液。通过ESI-TOFMS测定了质量，结果是，关于原料的曲妥珠单抗，在148222观测到峰。引入了2个结合性肽的情形在153524确认到峰。

(汇总)

将以上的结果汇总如下。

[表2]

表2.亲和性肽的汇总

此外，关于抗体，表明可实现以第246位和/或第248位的赖氨酸残基(例如，实施例7、8、9)为代表的特定氨基酸残基的位置选择性修饰。

进而，关于以下述式(I)表示的具有针对抗体的亲和性物质(在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽)、切割性部分及反应性基团的下述的化合物，列举部分实施例为例进行说明时，如以下的表3所示；

A-L-B-R (I)

式中，

A为针对抗体的亲和性物质(在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽)，

L为切割性连接体，该切割性连接体为包含切割性部分的二价基团，

B为(a)包含生物正交性官能团的二价基团、或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团，

R为针对所述抗体的反应性基团；

L为：(i)切割性连接体，该切割性连接体是包含切割性部分的二价基团，该切割性部分具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力；或者(ii)切割性连接体，该切割性连接体是包含切割性部分的二价基团，该切割性部分不具有通过切割而在反应性基团侧生成生物正交性官能团的能力。

[表3-1]

表3-1.具有针对抗体的亲和性物质(在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽)、切割性部分及反应性基团的化合物与可由其制造的具有生物正交性官能团的抗体的关系(其一)

[表3-2]

表3-2.具有针对抗体的亲和性物质(在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽)、切割性部分及反应性基团的化合物与可由其制造的具有生物正交性官能团的抗体的关系(其二)

关于具有针对抗体的亲和性物质(在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽)、切割性部分及反应性基团的各种化合物，如上所述，可通过适当改变“针对抗体的亲和性物质(A)”、“作为包含切割性部分的二价基团的切割性连接体(L)”、“(a)包含生物正交性官能团的二价基团或者(b)不含生物正交性官能团的二价基团(B)”、“针对抗体的反应性基团(R)”的种类，按照周知的有机合成方法来制备。本发明中可制备的具有针对抗体的亲和性物质(在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽)、切割性部分及反应性基团的化合物的进一步的例子与可由其制造的具有生物正交性官能团的抗体的关系如下。

[表4]

表4.具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物的进一步的例子与可由其制造的具有生物正交性官能团的抗体的关系(其一)

[表5]

表5.具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物的进一步的例子与可由其制造的具有生物正交性官能团的抗体的关系(其二)

[表6]

表6.具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物的进一步的例子与可由其制造的具有生物正交性官能团的抗体的关系(其三)

由以上内容显示，在具有针对抗体的亲和性物质(在N末端包含谷氨酰胺残基(Q)的多肽)、切割性部分及反应性基团的化合物中，通过适当调节亲和性物质的种类、亲和性物质与反应性基团之间的连接体的长度、以及在亲和性物质中引入连接体的位置等因素，可以位置选择性地修饰抗体。

[参考例1：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]

(1-1)IgG1 Fc结合性肽的合成

通过Fmoc固相合成法合成Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNKEQRNARIRSIRDDC-NH

(Fmoc固相合成法)

关于肽合成装置，使用Biotage公司制Syro wave。关于试剂，全部使用渡边化学工业株式会社制的试剂。树脂为Fmoc-NH-SAL-PEG Resin,HL，精氨酸(R)、半胱氨酸(C)、组氨酸(H)进行了双偶联(double coupling)。关于从树脂的切取，以在三氟乙酸:水:三异丙基硅烷:乙二硫醇＝94:2.5:1.0:2.5的溶液中搅拌3小时的条件进行。切取后，将树脂通过过滤除去，除去三氟乙酸。向生成的结晶中加入二乙醚进行醚沉淀，通过过滤回收生成的白色结晶。将其溶解于0.1％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基(octadodecyl group)化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.1％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认了各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而仅除去乙腈后，进行冷冻干燥。

(1-2)Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNKEQRNARIRSIRDDC-NH

[化学式52]

上述氨基酸序列为SEQ ID NO:46。

将(1-1)中合成的肽溶解于DMSO，加入0.1M Tris-HCl pH 8.0。向该溶液中加入氧化型谷胱甘肽，在室温下搅拌20小时。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认了各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得目标物(23.0mg，5.38μmol)。

MS(ESI)m/z:z＝41070.55[M+4H]

(1-3)二硫连接体(disulfide linker)与肽的偶联

[化学式53]

上述氨基酸序列为SEQ ID NO:46。

将(1-2)中合成的Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNKEQRNARIRSIRDDC-NH

MS(ESI)m/z:z＝5914.45[M+5H]

(1-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析将(1-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺并使浓度成为4mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于171μL的50mM的乙酸钠缓冲液(pH 5.5)，加入4.2μL的4mM的肽试剂(相对于抗体为5当量)，在室温下搅拌1小时。将反应液添加于NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定了质量，结果是，关于原料的曲妥珠单抗，在148065观测到峰；关于引入了1个结合性肽的产物，在152525观测到峰；关于引入了2个结合性肽的产物，在156978观测到峰。

(1-5)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析通过HIC对(1-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。关于柱，使用了Protein-Pak Hi ResHIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer：0.1M PiNa,2.3M(NH

对于样品，按照以下的条件进行反应；

a：曲妥珠单抗原料；

b：曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体5当量。

保留时间9.2124分钟被认为是引入了1个肽的化合物，8.6157分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图16)。

[参考例2：曲妥珠单抗的巯基引入体的肽谱分析]

(2-1)曲妥珠单抗的巯基引入体的胰蛋白酶处理向1.5mL低吸附微试管中加入10μL的样品溶液(包含参考例1中制备的曲妥珠单抗的巯基引入体)、50mM碳酸氢铵缓冲液、10μL的溶解于40％三氟乙醇的20mM的二硫苏糖醇水溶液，在65℃加温1小时后，添加10μL的50mM的碘乙酰胺水溶液，遮光下于室温以300rpm振荡反应30分钟。反应后，加入40μL的50mM碳酸氢铵缓冲液并进行搅拌，添加10μL的20ng/μL的胰蛋白酶水溶液(蛋白质组学级(Proteomics Grade)，Code No.T6567-5x20μg(SIGMA))并在37℃进行了18小时的酶消化。消化后，添加2μL的20％三氟乙酸水溶液，停止反应，实施了LC-MS/MS测定。

(2-2)曲妥珠单抗的LC-MS/MS测定条件(分析装置)

纳米HPLC：EASY-nLC 1000(赛默飞世尔科技公司)

质谱仪：Tribrid质谱仪Orbitrap Fusion(赛默飞世尔科技公司)。

(HPLC分析条件)

捕获柱：Acclaim PepMap(注册商标)100，75μm×2cm(赛默飞世尔科技公司)

分析柱：ESI-柱(NTCC-360/75-3-125，75μm×12.5cm，3μm(日京技术株式会社))

流动相A：0.1％甲酸水溶液

流动相B：0.1％甲酸，乙腈溶液

加样溶液：0.1％三氟乙酸水溶液

流速：300nL/分钟

样品注入量：1μL

梯度条件(B％)：2％(0.0-0.5分钟)、2％→30％(0.5-23.5分钟)、30％→75％(23.5-25.5分钟)、75％(25.5-35.0分钟)。

(质谱仪分析条件)

离子化方法：ESI，正离子化模式

扫描类型：数据依赖性获取

活化类型：碰撞诱导离解(CID)

关于数据的获取，使用作为附属软件的Xcalibur 3.0(赛默飞世尔科技公司)及Thermo Orbitrap Fusion TuneApplication 2.0(赛默飞世尔科技公司)进行。

(2-3)曲妥珠单抗的修饰部位的分析条件

关于对LC-MS/MS测定结果的修饰部位分析，使用Proteome Discoverer version1.4(赛默飞世尔科技公司)进行。

关于采用Proteome Discoverer的分析，使用Sequest HT作为搜索引擎，将前体离子的范围设为350～5000Da，将总强度阈值(Total Intensity Threshold)设为50000。此外，将胰蛋白酶设定为消化酶，最大漏切位点(Maximum Missed Cleavage Site)设为3。此外，前体和碎片离子的质量容差(Mass Tolerance)分别设为5ppm和0.5Da。关于静态修饰(Static Modification)，作为采用碘乙酰胺的半胱氨酸残基的修饰，设定了脲甲基化(Carbamidomethyl)(+57.021Da)。关于动态修饰(Dynamic Modification)，设定了甲硫氨酸的氧化(+15.995Da)和对赖氨酸残基的修饰体(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))。进而，设置了筛选器(filter)以使肽置信度(Peptide Confidence)仅为高。

此外，作为修饰部位的检索对象的氨基酸序列的数据，使用图4所示的(1)、(3)。

(2-4)曲妥珠单抗的基于LC-MS/MS的修饰部位的分析结果

使用LC-MS/MS的分析结果是，观测到使用参考例1的结合性肽修饰的曲妥珠单抗的采用胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的由19个氨基酸残基形成的肽VVSVLTVLHQDWLNGKEYK(SEQ IDNO:47)的肽片段的MS谱(实测值：m/z 791.74872，理论值：791.74753，3价)(图17)；根据CID谱确认了表示重链的EU numbering中的第317位的赖氨酸残基的修饰的相当于2价的b18的m/z 1114.35(理论值：1114.06)的产物离子(图18)。此外，观测到采用胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的由28个氨基酸残基形成的肽EEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK(SEQ ID NO:48)的肽片段的MS谱(实测值：m/z 886.93408，理论值：886.93215，4价)(图19)；根据CID谱同样确认了表示重链的第317位的赖氨酸残基的修饰的相当于2价的y14的m/z 938.70(理论值：938.46)的产物离子(图20)。

[参考例3：具有针对可溶性蛋白质的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物(肽二硫连接体偶联物-NHS活化体)的合成、以及使用该化合物的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的修饰及其分析]

(3-1)IgG1 Fc结合性肽的合成

与参考例1同样地通过Fmoc固相合成法合成Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC-NH

(3-2)Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC-NH

[化学式54]

上述氨基酸序列为SEQ ID NO:49。

将(3-1)中合成的肽溶解于DMSO，加入0.1M Tris-HCl pH 8.0。向该溶液中加入氧化型谷胱甘肽，在室温下搅拌20小时。向反应溶液中加入2M三氟乙酸水溶液停止反应，将其溶解于0.05％三氟乙酸水溶液，供至以十八烷基化学键合硅胶作为填充剂的反相高效液相色谱，用含有0.05％三氟乙酸的水和乙腈的混合溶液洗脱，通过LC-MS确认了各级分。回收含产物的级分，通过减压浓缩而除去乙腈后，进行冷冻干燥，获得目标物(20.0mg，4.70μmol)。

MS(ESI)m/z:z＝41063.65[M+4H]

(3-3)二硫连接体与肽的偶联

[化学式55]

上述氨基酸序列为SEQ ID NO:49。

将(3-2)中合成的Ac-FNMQCQRRFYEALHDPNLNEEQRNARIRSIKDDC-NH

MS(ESI)m/z:z＝5908.95[M+5H]

(3-4)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰和基于ESI-TOFMS的分析将(3-3)中合成的肽二硫连接体偶联物-NHS活化体溶解于N,N'-二甲基甲酰胺并使浓度成为4mM。使500μg的抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗(中外制药株式会社)溶解于171μL的50mM的乙酸钠缓冲液(pH 5.5)，加入8.5μL的4mM的肽试剂(相对于抗体为10当量)，在室温下搅拌1小时。将反应液添加于NAP-5柱，使反应停止，置换为20mM的PBS缓冲液。通过ESI-TOFMS测定了质量，结果是，关于原料的曲妥珠单抗，在148234观测到峰；关于引入了1个结合性肽的产物，在152648观测到峰；关于引入了2个结合性肽的产物，在157083观测到峰。

(3-5)曲妥珠单抗的特异性修饰体的还原条件下的基于ESI-TOFMS分析的重链选择性的确认向(3-4)中生成的抗体-肽复合物中加入5μL的7mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液(相对于抗体为等量)，在室温下搅拌20分钟。通过ESI-TOFMS测定了质量，结果是，关于产物，在重链中引入了硫代丙酰基的情形在50686、50847观测到峰，并且与原料同样在23439观测到轻链峰。

(3-6)抗HER2 IgG抗体曲妥珠单抗的特异性修饰的HIC-UPLC分析通过HIC对(3-4)中生成的抗体-肽复合物和原料的抗体进行了分析。关于柱，使用了Protein-Pak Hi ResHIC柱(沃特世公司)4.6×100mm 2.5μm。使用A_Buffer：0.1M PiNa,2.3M(NH

对于样品，按照以下的条件进行反应；

a：曲妥珠单抗原料；

b：曲妥珠单抗+肽二硫连接体偶联物-NHS活化体10当量。

保留时间9.7202分钟被认为是曲妥珠单抗原料，9.2689分钟被认为是引入了1个肽的化合物，8.7994分钟被认为是引入了2个肽的化合物(图21)。

[参考例4：曲妥珠单抗的巯基引入体的肽谱分析]

(4-1)曲妥珠单抗的巯基引入体的胰蛋白酶处理

进行了与参考例(2-1)同样的处理。

(4-2)曲妥珠单抗的LC-MS/MS测定条件

采用了与参考例(2-2)同样的测定条件。

(4-3)曲妥珠单抗的修饰部位的分析条件

采用了与参考例(2-3)同样的分析条件。

(4-4)曲妥珠单抗的基于LC-MS/MS的修饰部位的分析结果

使用LC-MS/MS的分析结果是，观测到使用参考例3的结合性肽修饰的曲妥珠单抗的采用胰蛋白酶消化的包含对赖氨酸残基的修饰部位(经受了采用碘乙酰胺的脲甲基化的巯基引入体(+145.019Da))的由18个氨基酸残基形成的肽FNWYVDGVEVHNAKTKPR(SEQ IDNO:50)的肽片段的MS谱(实测值：m/z 769.04688，理论值：769.04457，3价)(图22)；根据CID谱确认了表示重链的EU numbering中的第288位或第290位的赖氨酸残基的修饰的相当于2价的y12的m/z 741.15(理论值：740.89)的产物离子(图23)。

工业上利用的可能性

本发明例如可用于制造位置选择性地修饰的抗体。

序列表

<110> 味之素株式会社

<120> 具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐

<130> PAMA-20855

<150> JP2018-205225

<151> 2018-10-31

<160> 62

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 230

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人IgG1的Fc区域

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(19)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (140)..(140)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (142)..(142)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (177)..(177)

<223> Xaa 可为任何天然存在的氨基酸

<400> 1

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

1 5 10 15

Glu Xaa Xaa Gly Xaa Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

35 40 45

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

50 55 60

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

65 70 75 80

Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

85 90 95

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

100 105 110

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

115 120 125

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Xaa Glu Xaa Thr Lys

130 135 140

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

145 150 155 160

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

165 170 175

Xaa Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

180 185 190

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

195 200 205

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Ser Pro Gly

225 230

<210> 2

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 曲妥珠单抗的重链 (人源化IgG1单克隆抗体)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 3

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人IgG1抗体的Fc区域

<400> 3

Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

1 5 10 15

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu

20 25 30

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

35 40 45

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

50 55 60

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

65 70 75 80

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

85 90 95

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

100 105 110

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

115 120 125

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

130 135 140

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

145 150 155 160

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

165 170 175

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

180 185 190

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

195 200 205

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

210 215 220

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230 235

<210> 4

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 曲妥珠单抗的轻链 (人源化IgG1单克隆抗体)

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 5

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人IgG的Fc区域具有亲和性的肽。

2个半胱氨酸残基可通过二硫键连接。

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (26)..(26)

<223> 精氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (28)..(28)

<223> 精氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺

<400> 5

Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro

1 5 10 15

Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Xaa Ile Xaa Ser Ile Arg Asp

20 25 30

Asp Cys

<210> 6

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人IgG的Fc区域具有亲和性的肽。

2个半胱氨酸残基可通过二硫键连接。

<400> 6

Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro

1 5 10 15

Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp

20 25 30

Asp Cys

<210> 7

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人IgG的Fc区域具有亲和性的肽(CspB6Tev-QZ34C)。

2个半胱氨酸残基可通过二硫键连接。

<400> 7

Gln Glu Thr Asn Pro Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gln Lys Asn Met

1 5 10 15

Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn

20 25 30

Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys

35 40 45

<210> 8

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人IgG的Fc区域具有亲和性的肽(QZ34C-60)。

2个半胱氨酸残基可通过二硫键连接。

<400> 8

Gln Thr Ala Asn Asp Gln Lys Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr

1 5 10 15

Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg

20 25 30

Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala

35 40 45

Glu Ala Gln Gln Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Gln Ala

50 55 60

<210> 9

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人IgG的Fc区域具有亲和性的肽(QET-Z34C)。

2个半胱氨酸残基可通过二硫键连接。

<400> 9

Gln Glu Thr Lys Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu

1 5 10 15

His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser

20 25 30

Ile Arg Asp Asp Cys

35

<210> 10

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人IgG的Fc区域具有亲和性的肽(QET-FNK-Z34C)。

2个半胱氨酸残基可通过二硫键连接。

<400> 10

Gln Glu Thr Phe Asn Lys Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu

1 5 10 15

His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser

20 25 30

Ile Arg Asp Asp Cys

35

<210> 11

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CspB成熟蛋白质的N末端的6个氨基酸残基

<400> 11

Gln Glu Thr Asn Pro Thr

1 5

<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> proTev蛋白酶识别位点的氨基酸序列

<400> 12

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln

1 5

<210> 13

<211> 234

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CspBss-CspB6Tev-QZ34C的核苷酸序列

<400> 13

atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60

gcttccggcg tagctatccc agcattcgct caggagacca acccaaccga gaacctgtac 120

ttccagcaga agaacatgca gtgtcagcgt cgcttctacg aggccctcca cgaccctaac 180

ctcaacgagg aacagcgtaa cgcgcgtatt cgctccatcc gcgatgactg ctaa 234

<210> 14

<211> 77

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CspBss-CspB6Tev-QZ34C的氨基酸序列

<400> 14

Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala

1 5 10 15

Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Gln Glu

20 25 30

Thr Asn Pro Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gln Lys Asn Met Gln Cys

35 40 45

Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu

50 55 60

Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp Cys

65 70 75

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> (a) CspB成熟蛋白质的N末端的6个氨基酸残基(SEQ ID NO:11)与

(b) proTev蛋白酶识别的氨基酸序列 (SEQ ID NO:12)的融合氨基酸序列

<400> 15

Gln Glu Thr Asn Pro Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln

1 5 10

<210> 16

<211> 261

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CspAss-QZ34C-60的核苷酸序列

<400> 16

atgaaacgca tgaaatcgct ggctgcggcg ctcaccgtcg ctggggccat gctggccgca 60

cctgtggcaa cggcacagac cgcagacaac cagaagaaca tgcagtgtca gcgtcgcttc 120

tacgaggccc tccacgaccc taacctcaac gaggaacagc gtaacgcgcg tattcgctcc 180

atccgcgatg actgctccca gtccgcaaac ctcctcgcag aggcacagca gctcaacgac 240

gcacaggcac cacaggcata a 261

<210> 17

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CspAss-QZ34C-60的氨基酸序列

<400> 17

Met Lys Arg Met Lys Ser Leu Ala Ala Ala Leu Thr Val Ala Gly Ala

1 5 10 15

Met Leu Ala Ala Pro Val Ala Thr Ala Gln Thr Ala Asp Asn Gln Lys

20 25 30

Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn

35 40 45

Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp Asp

50 55 60

Cys Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Gln Gln Leu Asn Asp

65 70 75 80

Ala Gln Ala Pro Gln Ala

85

<210> 18

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CspBss-QET-Z34C的核苷酸序列

<400> 18

atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60

gcttccggcg tagctatccc agcattcgct caggagacca agaacatgca gtgtcagcgt 120

cgcttctacg aggccctcca cgaccctaac ctcaacgagg aacagcgtaa cgcgcgtatt 180

cgctccatcc gcgatgactg ctaa 204

<210> 19

<211> 67

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CspBss-QET-Z34C的氨基酸序列

<400> 19

Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala

1 5 10 15

Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Gln Glu

20 25 30

Thr Lys Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp

35 40 45

Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg

50 55 60

Asp Asp Cys

65

<210> 20

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CspBss-QET-FNK-Z34C的核苷酸序列

<400> 20

atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60

gcttccggcg tagctatccc agcattcgct caggagacct tcaacaagca gtgtcagcgt 120

cgcttctacg aggccctcca cgaccctaac ctcaacgagg aacagcgtaa cgcgcgtatt 180

cgctccatcc gcgatgactg ctaa 204

<210> 21

<211> 67

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CspBss-QET-FNK-Z34C的氨基酸序列

<400> 21

Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala

1 5 10 15

Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Gln Glu

20 25 30

Thr Phe Asn Lys Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp

35 40 45

Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg

50 55 60

Asp Asp Cys

65

<210> 22

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人IgG的Fc区域具有亲和性的肽。

2个半胱氨酸残基可通过二硫键连接。

<400> 22

Gln Glu Thr Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu

1 5 10 15

His Asp Pro Asn Leu Asn Lys Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser

20 25 30

Ile Arg Asp Asp Cys

35

<210> 23

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人IgG的Fc区域具有亲和性的肽。

2个半胱氨酸残基可通过二硫键连接。

<400> 23

Gln Glu Thr Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu

1 5 10 15

His Asp Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser

20 25 30

Ile Lys Asp Asp Cys

35

<210> 24

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人IgG的Fc区域具有亲和性的肽。

2个半胱氨酸残基可通过二硫键连接。

<400> 24

Gln Glu Thr Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Leu Val Trp

1 5 10 15

Cys Thr Tyr His

20

<210> 25

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人IgG的Fc区域具有亲和性的肽。

2个半胱氨酸残基可通过二硫键连接。

<400> 25

Gln Glu Thr Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Ile Ile Trp

1 5 10 15

Cys Thr Tyr His

20

<210> 26

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 曲妥珠单抗的片段

<400> 26

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

1 5 10 15

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

20 25 30

Arg

<210> 27

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来源于金黄色葡萄球菌的蛋白A的结构域A

<400> 27

Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 28

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来源于金黄色葡萄球菌的蛋白A的结构域B

<400> 28

Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 29

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来源于金黄色葡萄球菌的蛋白A的结构域C

<400> 29

Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 30

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来源于金黄色葡萄球菌的蛋白A的结构域D

<400> 30

Ala Asp Ala Gln Gln Asn Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe

1 5 10 15

Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly

20 25 30

Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu

35 40 45

Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys

50 55 60

<210> 31

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来源于金黄色葡萄球菌的蛋白A的结构域E

<400> 31

Ala Ala Asn Ala Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr

1 5 10 15

Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe

20 25 30

Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly

35 40 45

Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys

50 55 60

<210> 32

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来源于G群链球菌的蛋白G的结构域C2

<400> 32

Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu

1 5 10 15

Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys

20 25 30

Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr

35 40 45

Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu

50 55 60

<210> 33

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来源于G群链球菌的蛋白G的结构域C3

<400> 33

Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu

1 5 10 15

Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys

20 25 30

Ala Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr

35 40 45

Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu

50 55 60

<210> 34

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来源于大消化链球菌的蛋白L的结构域C

<400> 34

Glu Val Thr Ile Lys Val Asn Leu Ile Phe Ala Asp Gly Lys Ile Gln

1 5 10 15

Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr

20 25 30

Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ala Lys Val Asn Gly Glu Tyr Thr Ala Asp

35 40 45

Leu Glu Asp Gly Gly Asn His Met Asn Ile Lys Phe Ala

50 55 60

<210> 35

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来源于大消化链球菌的蛋白L的结构域C1

<400> 35

Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Phe Ala Asp Gly Ser Thr Gln

1 5 10 15

Asn Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Ala Lys Ala Val Ser Asp Ala Tyr

20 25 30

Ala Tyr Ala Asp Ala Leu Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp

35 40 45

Val Ala Asp Lys Gly Leu Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala

50 55 60

<210> 36

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来源于大消化链球菌的蛋白L的结构域C2

<400> 36

Glu Val Thr Ile Lys Val Asn Leu Ile Phe Ala Asp Gly Lys Thr Gln

1 5 10 15

Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Lys Ala Tyr

20 25 30

Ala Tyr Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Glu Tyr Thr Ala Asp

35 40 45

Leu Glu Asp Gly Gly Asn Thr Ile Asn Ile Lys Phe Ala

50 55 60

<210> 37

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来源于大消化链球菌的蛋白L的结构域C3

<400> 37

Glu Val Thr Ile Lys Val Asn Leu Ile Phe Ala Asp Gly Lys Ile Gln

1 5 10 15

Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Lys Ala Tyr

20 25 30

Ala Tyr Ala Asn Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Glu Tyr Thr Ala Asp

35 40 45

Leu Glu Asp Gly Gly Asn Thr Ile Asn Ile Lys Phe Ala

50 55 60

<210> 38

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来源于大消化链球菌的蛋白L的结构域C4

<400> 38

Glu Val Thr Ile Lys Val Asn Leu Ile Phe Ala Asp Gly Lys Thr Gln

1 5 10 15

Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr

20 25 30

Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ala Lys Val Asn Gly Glu Tyr Thr Ala Asp

35 40 45

Leu Glu Asp Gly Gly Tyr Thr Ile Asn Ile Lys Phe Ala

50 55 60

<210> 39

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来源于大消化链球菌的蛋白L的结构域B1

<400> 39

Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Phe Ala Asn Gly Ser Thr Gln

1 5 10 15

Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Lys Ala Thr Ser Glu Ala Tyr

20 25 30

Ala Tyr Ala Asp Thr Leu Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp

35 40 45

Val Ala Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala

50 55 60

<210> 40

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来源于大消化链球菌的蛋白L的结构域B2

<400> 40

Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln

1 5 10 15

Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr

20 25 30

Arg Tyr Ala Asp Ala Leu Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp

35 40 45

Val Ala Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala

50 55 60

<210> 41

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来源于大消化链球菌的蛋白L的结构域B3

<400> 41

Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln

1 5 10 15

Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr

20 25 30

Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Val Asp

35 40 45

Val Ala Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala

50 55 60

<210> 42

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来源于大消化链球菌的蛋白L的结构域B4

<400> 42

Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln

1 5 10 15

Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Ala Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr

20 25 30

Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Ala Asp

35 40 45

Leu Glu Asp Gly Gly Tyr Thr Ile Asn Ile Arg Phe Ala

50 55 60

<210> 43

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来源于大消化链球菌的蛋白L的结构域B5

<400> 43

Gln Val Thr Ile Lys Glu Asn Ile Tyr Phe Glu Asp Gly Thr Val Gln

1 5 10 15

Thr Ala Thr Phe Lys Gly Thr Phe Ala Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr

20 25 30

Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ser Lys Glu His Gly Lys Tyr Thr Ala Asp

35 40 45

Leu Glu Asp Gly Gly Tyr Thr Ile Asn Ile Arg Phe Ala

50 55 60

<210> 44

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于来源于金黄色葡萄球菌的蛋白A人工设计的蛋白Z

<400> 44

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 45

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 基于来源于金黄色葡萄球菌的蛋白A人工设计的多肽Z34C

<400> 45

Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro

1 5 10 15

Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Lys Ser Ile Arg Asp

20 25 30

Asp Cys

<210> 46

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 位于N末端的苯丙氨酸残基可被乙酰化且2个半胱氨酸残基可通过二硫键连接

<400> 46

Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro

1 5 10 15

Asn Leu Asn Lys Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg Asp

20 25 30

Asp Cys

<210> 47

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽片段

<400> 47

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

1 5 10 15

Glu Tyr Lys

<210> 48

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽片段

<400> 48

Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

1 5 10 15

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

20 25

<210> 49

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 位于N末端的苯丙氨酸残基可被乙酰化且2个半胱氨酸残基可通过二硫键连接

<400> 49

Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro

1 5 10 15

Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Lys Asp

20 25 30

Asp Cys

<210> 50

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽片段

<400> 50

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

1 5 10 15

Pro Arg

<210> 51

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人IgG的Fc区域具有亲和性的肽。

2个半胱氨酸残基可通过二硫键连接。

<400> 51

Gln Glu Thr Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp

1 5 10 15

Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Lys

20 25 30

Asp Asp Cys

35

<210> 52

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人IgG的Fc区域具有亲和性的肽。

2个半胱氨酸残基可通过二硫键连接。

<400> 52

Gln Glu Thr Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro

1 5 10 15

Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Lys Asp

20 25 30

Asp Cys

<210> 53

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人IgG的Fc区域具有亲和性的肽。

2个半胱氨酸残基可通过二硫键连接。

<400> 53

Gln Glu Thr Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn

1 5 10 15

Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Lys Asp Asp

20 25 30

Cys

<210> 54

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对人IgG的Fc区域具有亲和性的肽 (肽已知为Fc-III)。

2个半胱氨酸残基可通过二硫键连接。

<400> 54

Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr

1 5 10

<210> 55

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码CspBss-QET-Z34C3的氨基酸序列的核苷酸序列

<400> 55

atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60

gcttccggcg tagctatccc agcattcgct caggagacct tcaacatgca gtgtcagcgt 120

cgcttctacg aggccctcca cgaccctaac ctcaacaagg aacagcgtaa cgcgcgtatt 180

cgctccatcc gcgatgactg ctaa 204

<210> 56

<211> 67

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CspBss-QET-Z34C3的氨基酸序列

<400> 56

Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala

1 5 10 15

Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Gln Glu

20 25 30

Thr Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp

35 40 45

Pro Asn Leu Asn Lys Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Arg

50 55 60

Asp Asp Cys

65

<210> 57

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码CspBss-QET-Z34C4的氨基酸序列的核苷酸序列

<400> 57

atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60

gcttccggcg tagctatccc agcattcgct caggagacct tcaacatgca gtgtcagcgt 120

cgcttctacg aggccctcca cgaccctaac ctcaacgagg aacagcgtaa cgcgcgtatt 180

cgctccatca aggatgactg ctaa 204

<210> 58

<211> 67

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CspBss-QET-Z34C4的氨基酸序列

<400> 58

Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala

1 5 10 15

Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Gln Glu

20 25 30

Thr Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp

35 40 45

Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Arg Ile Arg Ser Ile Lys

50 55 60

Asp Asp Cys

65

<210> 59

<211> 153

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码CspBss-QET-LV的氨基酸序列的核苷酸序列

<400> 59

atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60

gcttccggcg tagctatccc agcattcgct caggagaccc gcggcaactg cgcataccac 120

aagggccagc tggtgtggtg cacctaccac taa 153

<210> 60

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CspBss-QET-LV的氨基酸序列

<400> 60

Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala

1 5 10 15

Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Gln Glu

20 25 30

Thr Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Leu Val Trp Cys Thr

35 40 45

Tyr His

50

<210> 61

<211> 153

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码CspBss-QET-II的氨基酸序列的核苷酸序列

<400> 61

atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60

gcttccggcg tagctatccc agcattcgct caggagaccc gcggcaactg cgcataccac 120

aagggccaga tcatctggtg cacctaccac taa 153

<210> 62

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CspBss-QET-II的氨基酸序列

<400> 62

Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala

1 5 10 15

Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Gln Glu

20 25 30

Thr Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Lys Gly Gln Ile Ile Trp Cys Thr

35 40 45

Tyr His

50