一种可注射的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药材料技术领域，具体涉及一种可注射的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合水凝胶及其制备方法。

背景技术

水凝胶是一类具有三维网络结构的交联聚合物，可以良好模拟细胞外基质的水环境，并为细胞的粘附、增殖和分化提供类似天然外基质的微环境，是组织损伤再生、修复和重建的一种理想材料，因此被广泛应用于生物医学领域，如医用敷料、软骨组织修复、细胞移植、药物递送和组织工程支架等，尤其是用于组织修复的可注射水凝胶最富有吸引力，它不仅可通过微创的形式移植到缺损部位，而且还能填充任何形状的缺损，同时还便于细胞和生物活性因子的搭载，引起人们的极大关注。

羟基磷灰石(简称HA，化学式为Ca

蚕丝素蛋白作为一种理想的天然高分子材料，常被选为羟基磷灰石等的载体材料。近年来，关于丝素蛋白/羟基磷灰石复合材料的制备方式层出不穷。例如：(1)将羟基磷灰石粉末与丝素蛋白溶液直接复合后冻干形成的支架或采用交联等方式制得复合水凝胶；(2)通过静电纺丝得到羟基磷灰石和丝素蛋白纳米纤维；(3)利用丝素蛋白膜吸附羟基磷灰石获得复合材料。但是上述方法本质上是物理混合，并非化学键的结合，其界面结合力度、混合尺度和均匀性难以保证。加之再生丝素蛋白溶液极不稳定，即便在低温条件下保存也会随着时间的推移自发形成凝胶，最好即配即用，这不仅给丝素蛋白/羟基磷灰石复合水凝胶的制备、运输和保存带来了极大的不便，而且制备过程十分复杂繁琐，从而限制了它在临床上的推广应用和效能发挥。因羟基磷灰石具有良好的生物相容性和骨诱导性，因此常用作可注射水凝胶的材料，但目前羟基磷灰石制备得到的水凝胶产品也面临了许多问题：羟基磷灰石粉体由于粒径小很容易发生团聚现象，造成复合材料中无机相分布不均和气泡难除、水凝胶原材料保存及其运输难等问题尤为突出。

因此，创新羟基磷灰石的制备方法，开发出新型羟基磷灰石水凝胶以便满足我国新材料及相关产业发展特别是生物医药、组织工程等方面巨大需求，成为了组织工程领域研究的热点和亟待解决的问题。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种可注射的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合水凝胶，无机相均匀性好、无气泡，界面结合良好，可满足力学强度要求。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种丝素蛋白/纳米羟基磷灰石粉末，包括丝素蛋白和纳米羟基磷灰石；

所述丝素蛋白/羟基磷灰石粉末的质量体积浓度为0.1％～90％；进一步地，所述丝素蛋白：羟基磷灰石的质量比为5～99:1～95。

在本发明的具体实施方式中，所述羟基磷灰石为羟基磷灰石纳米粒子、羟基磷灰石纳米棒中的一种，优选为羟基磷灰石纳米粒子；进一步地，所述羟基磷灰石纳米粒子的粒径为50-100nm；

所述丝素蛋白是通过蚕茧进行脱胶得到的；

进一步地，所述脱胶用的试剂为钠盐溶液，所述钠盐溶液选自Na

本发明还提供了一种丝素蛋白/羟基磷灰石粉末的制备方法，包括如下内容：将丝素蛋白用溶剂溶解后与磷酸盐混合得混合溶液，反应后透析得丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合溶液体系，再干燥即得。

所述干燥的方法包括但不限于包括真空冷冻干燥法、真空干燥法、喷雾干燥法，凡是通过本领域内已知方法进行的干燥均可适用于本发明中。

在本发明的具体实施方式中，所述丝素蛋白与磷酸盐的质量比为2:0.5～6，优选为1:0.5～3。

在本发明的具体实施方式中，所述溶剂为钙盐/醇/水三元溶液，所述钙盐/醇/水三元溶液中钙盐：醇：水的摩尔比为1:2:8；

所述钙盐选自氯化钙、硝酸钙的一种，优选氯化钙；所述醇为乙醇；

所述溶解的温度为65～80℃；

所述溶解后的丝素蛋白溶液的质量体积浓度为0.1％～50％。

在本发明的具体实施方式中，所述磷酸盐选自NH

在本发明的具体实施方式中，所述混合溶液中钙/磷的摩尔比为8～12:4～7，优选为10:6；

所述混合溶液的pH值为8～12；

所述混合的温度为20～80℃。

所述混合溶液的pH值可用氢氧化钠、氨水、氢氧化钾调节得到。

在本发明的具体实施方式中，所述反应的时间为1～24h。

由于单纯的采用丝素蛋白和羟基磷灰石复合物冻干之后支架的成型效果较差，存在支架易碎和不易成型等缺陷，目前现有技术中有利用羧甲基纤维素来增加整个混合物体系的粘稠度，从而增加支架的成型效果的，但即使制成了支架，在运用中依然运存在脆性大、加工性能困难等缺点，且运用范围较窄，只局限于规则的组织缺损中，而实际上人体组织中损伤如关节炎，关节软骨缺损、骨折等往往是不规则，支架材料无法满足，但是水凝胶材料则可以满足任何形状的缺损填充。

本发明还提供了一种可注射的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合水凝胶，是由上述丝素蛋白/羟基磷灰石粉末溶解后进行超声处理得到；

或由上述的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合溶液体系进行超声处理得到。

进一步地，所述溶解后的丝素蛋白/羟基磷灰石质量体积浓度为0.1～90％；

所述超声处理的条件为：超声功率为250瓦特，超声功率比为1％～100％，时间为1s～10min。

本发明所述质量体积浓度(w/v)为单位体积(mL)混合物中某组分的质量(g)浓度，即混合物中某组分的质量(g)与混合物体积(mL)的比值。

本发明还提供了一种可注射的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合水凝胶的应用方法，包括但不限于将本发明复合水凝胶注射到缺损部位进行原位成胶；或待其成胶之后再注射到到缺损部位。

本发明的有益效果是：

(1)本发明丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合水凝胶以丝素蛋白为原料，充分利用三元体系中钙离子作为钙源原位合成羟基磷灰石，节省了成本，达到变废为宝的目的。

(2)本发明反应后透析得丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合溶液体系具有凝胶特性，可以满足任何缺损形状的填充，通过选取绿色、环保的超声波方法诱导丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合溶液体系得到可注射的复合水凝胶，制备方法高效快捷，全程避免了使用化学交联剂，操作简单且条件温和，无需复杂的设备设施，易于产业化和推广应用。

(3)本发明通过钙离子和丝素蛋白通过静电吸附结合，是一种化学力结合，得到的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合水凝胶无机相均匀性、界面结合力好，内部无起泡现象，能较好的满足临床应用需求。

(4)本发明丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合溶液体系通过干燥后，还能继续溶于水依然具有凝胶特性，再次通过超声波处理等方法同样可得到SF-nHA可注射水凝胶，解决了原料运输、保存等瓶颈问题。

(5)本发明在超声波处理参数、丝素蛋白和纳米羟基磷灰石各占比例相同的情况下，使用18G针头检验本发明制备的SF-nHA水凝胶(原位合成，注射推力小于25N)的可注射性远远优于SF-nHA水凝胶(物理混合，注射推力大于80N)；且本发明SF-nHA水凝胶使用27G针头仍表现出良好的可注射性，注射推力不大于45N；本发明SF-nHA水凝胶还可结合实际应用需求，通过调整超声波参数、SF-nHA百分比浓度以及各占比例等改进其可注射性能。

附图说明

图1为实施例1得到的SF-nHA干粉状态；

图2为实施例1得到的SF-nHA粉末的扫描电镜图；

图3为nHA粉末与丝素蛋白溶液物理混合后冻干的扫描电镜图；

图4为实施例1得到的SF-nHA干粉和HA(09-0432)的XRD图谱；

图5为实施例1得到的复合水凝胶外观成型状态；

图6为实施例1中SF-nHA水凝胶(原位合成)和SF-nHA水凝胶(物理混合)成胶之后使用18G针头的可注射性效果比较。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)选取0.05％Na

(2)在70℃条件下，用50ml氯化钙/乙醇/水(摩尔比为1∶2∶8)三元体系溶液溶解5g丝素蛋白纤维，制得10％(w/v)的丝素蛋白混合溶液。

(3)在37℃条件下，按照钙∶磷为10∶6的摩尔比例向步骤(2)中得到的丝素蛋白混合溶液中逐渐添加10.0g磷酸二氢铵，使用2M氨水调节pH值至10.0，搅拌反应6h；反应结束后，经透析得到丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合溶液。

(4)将步骤(3)得到的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合溶液用超声功率为250瓦特，超声波功率比为90％，进行超声诱导1min，得到可注射的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合水凝胶；也可将步骤(3)得到的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合溶液进行真空冷冻干燥得到分散性好的SF-nHA(丝素蛋白-纳米羟基磷灰石)粉末，质量百分比SF：HA＝4.5：9.3，再将4.0gSF-nHA粉末充分溶于15ml纯水中制得26.7％(w/v)溶液用超声功率为250瓦特，超声波功率比为90％进行超声诱导1min，得到可注射的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合水凝胶。

实施例2

(1)选取0.05％Na

(2)在70℃条件下，用50ml氯化钙/乙醇/水(摩尔比为1∶2∶8)三元体系溶液溶解15g丝素蛋白纤维，制得15％(w/v)的丝素蛋白混合溶液。

(3)在60℃条件下，按照钙∶磷为10∶6的摩尔比例向步骤(2)中得到的丝素蛋白混合溶液中逐渐添加15.0g磷酸氢二铵，使用2M氢氧化钠调节pH值至9.0，搅拌反应4h；反应结束后，经透析得到丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合溶液。

(4)将步骤(3)得到的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合溶液用超声功率为250瓦特，超声波功率比为30％，进行超声诱导2min，得到可注射的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合水凝胶；也可将步骤(3)得到的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合溶液进行真空冷冻干燥得到分散性好的SF-nHA粉末，质量百分比SF：HA＝13.5：18.4，再将2gSF-nHA粉末充分溶于5ml纯水中的制得40％(w/v)溶液，用超声功率为250瓦特，超声波功率比为30％，进行超声诱导2min，得到可注射的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合水凝胶。

实施例3

(1)选取0.05％Na

(2)在75℃条件下，用100ml氯化钙/乙醇/水(摩尔比为1∶2∶8)三元体系溶液溶解5g丝素蛋白纤维，制得5％(w/v)丝素蛋白混合溶液。

(3)在60℃条件下，按照钙∶磷为10∶6的摩尔比例向步骤(2)中得到的丝素蛋白混合溶液中逐渐添加30g磷酸氢二铵，使用氨水调节pH值至10，搅拌反应2h；反应结束后，经透析得到丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合溶液。

(4)将步骤(3)得到的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合溶液用超声功率为250瓦特，超声波功率比为70％，进行超声诱导0.5min，得到可注射的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合水凝胶；也可将步骤(3)得到的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合溶液进行真空冷冻干燥得到分散性好的SF-nHA粉末，质量百分比SF：HA＝4.3：36.9再将4gSF-nHA粉末充分溶于5ml纯水中制得20％(w/v)溶液，用超声功率为250瓦特，超声波功率比为70％，进行超声诱导0.5min，得到可注射的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合水凝胶。

由图1可知，实施例1方法得到的SF-nHA粉末呈白色，分散性好；

图2扫描电镜显示纳米羟基磷灰石均匀的分布在丝素蛋白材料上，界面结合好；

从图3可以看出，物理混合所得的SF-nHA并不均匀，而且纳米羟基磷灰石与丝素蛋白材料有分离迹象存在；

从图4可知，经超声波处理后的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合溶液注入到

从图5可知，经超声波处理后的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合溶液注入到

图6为步骤(3)真空冷冻干燥得到的SF-nHA(丝素蛋白-纳米羟基磷灰石)粉末进一步溶于水并经超声波处理后，转移至注射器中孵育30min得到的可注射水凝胶，在超声波处理参数、丝素蛋白和纳米羟基磷灰石所占比例相同的情况下，使用18G针头检验本发明SF-nHA水凝胶(原位合成)和SF-nHA水凝胶(物理混合)的可注射性，结果显示本发明干燥后溶解得到的SF-nHA水凝胶(原位合成，注射推力小于25N)的可注射性效果远远优于SF-nHA水凝胶(物理混合，注射推力大于80N)。而且本发明SF-nHA水凝胶(原位合成)使用27G针头仍表现出良好的可注射性，注射推力不大于45N。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。