一种产气荚膜梭菌ε毒素快速定量检测卡

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种产气荚膜梭菌ε毒素快速定量检测卡。

背景技术

产气荚膜梭菌ε毒素(epsilon toxin,ETX)是一种由B型和D型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)产生的一种外毒素，毒力仅次于肉毒杆菌毒素和破伤风毒素。ETX首先以无活性的前体毒素合成并分泌到细胞外，分子质量为32.98Kd；其氨基和羧基末端的肽经酶水解切割后被激活，活性毒素分子质量为28.6kD。活性毒素在肺、肾和脑等器官中产生弥漫性血管源性水肿，并引起神经性疾病，如角弓反张、抽搐和躁狂性挣扎，迅速导致死亡。产气荚膜梭菌ε毒素可导致山羊、绵羊和牛等动物的肠毒血症或坏死性肠炎，以及新生羔羊和犊牛腹泻等肠道致死性疾病，对畜牧业造成很大的经济损失。此外，ETX被认为是潜在的生物战剂，已被美国CDC列为必检项目。

由于ETX所导致的以上疾病具有发病急、死亡快及病程短等特点，使得抗生素的治疗没有显著的意义，目前对ETX中毒尚无批准用于预防ETX中毒的人用疫苗，也没有特效的解毒药物，只能采取对症治疗。因此，对毒素污染样品进行快速、灵敏的检测分析是预防及中毒患者诊疗的关键。目前市场上大量使用检测产气荚膜梭菌ε毒素酶标试剂盒，需要酶标仪、温育反应条件、多次洗板等条件，对操作工作环境和专业技术水平较高，另外检测样本还需要复杂的前处理，如采集血液，分离血清等；而快速胶体金虽然检测方便，不需专业技术人员和工作环境，但其检测的灵敏度低，且只能定性，检测线性范围窄。因此，开发一种能克服上述缺陷的产气荚膜梭菌ε毒素的快速定量检测卡具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种产气荚膜梭菌ε毒素快速定量检测试纸条。

本发明所提供的产气荚膜梭菌ε毒素快速定量检测试纸条快速检测试纸条，包括PVC底板、吸水垫、硝酸纤维素膜、标记物垫、样品垫和稀释液垫；所述硝酸纤维素膜固定在PVC底板上，所述硝酸纤维素膜一端搭接吸水垫，另一端搭接稀释液垫；所述标记物垫放置在所述硝酸纤维素膜上且位于所述稀释液垫前方，所述吸水垫的方向定义为前方；所述标记物垫上设置所述样品垫；在所述硝酸纤维素膜上从标记物垫到吸水垫依次设置检测线(T线)和质控线(C线)；在所述标记物垫和检测线(T线)之间设置定量标识线(M线)；

所述标记物垫上包被有标记物标记的鸡IgY抗体、标记物标记的产气荚膜梭菌ε毒素多抗；所述检测线处包被产气荚膜梭菌ε毒素多抗，所述质控线上包被羊抗鸡IgY抗体的IgG。

所述标记物适用胶体金、荧光素、镧系荧光、彩色乳胶、量子点、上转换荧光物质、磁荧光微球、以及酶标记物、化学发光物质；具体可为镧系荧光微球。

作为优选，所述样品垫上面可设置相应的滤物垫，如滤血垫等。

作为优选，所述标记物垫上还加入色素，以显示待测样本液侧流过程，便于肉眼观察或仪器自动监测控制。

作为优选，当色素被稀释液冲洗干净后，在稀释液耗尽后，色素再次流入检测窗口时，应停止结果判读。

作为优选，所述硝酸纤维素膜与所述吸水垫搭接的重叠宽度为1-2mm；所述硝酸纤维素膜与所述稀释液垫搭接的重叠宽度为1-2mm。标记物垫放置在稀释液垫前方，并在标记物垫和稀释液垫之间保留1-10mm硝酸纤维素膜裸露空隙。

作为优选，所述定量标识线(M线)置于T线和标记物垫之间可视窗上，便于目测和自动检测仪器识别，以控制提示稀释液的加入时间。

所述定量标识线(M线)设定涵盖：满足设定的加样量、满足设定的加样后第一次免疫反应延时时间、样本液迹移动到壳体上指定的定量标识线(M)位置，或者样本液迹出现在检测窗口。

本发明还提供一种产气荚膜梭菌ε毒素双孔定量检测卡。

本发明所提供的产气荚膜梭菌ε毒素双孔定量检测卡：包括外壳和设置在所述外壳内的产气荚膜梭菌ε毒素快速检测试纸条；所述外壳包括上壳盖和下壳盖，上壳盖与下壳盖扣合；且在上壳盖对应所述试纸条中的检测线“T”和质控线“C”的区间设置检测窗，对应所述样品垫处设置加样孔，对应所述稀释液垫处设置清洗孔；在靠近加样孔侧的所述检测窗边沿和“T”线之间设置“定量标识线”，并在对应的壳体上设置标记。

作为优选，加入样本液后，液迹在达到定量标识线(M线)后，再在清洗孔加入稀释液。所述定量标识线(M线)设定涵盖：满足设定的加样量、满足设定的加样后第一次免疫反应延时时间、样本液迹移动到壳体上指定的定量标识线(M)位置，或者样本液迹出现在检测窗口。

作为优选，加入样本液后，在设定时间内液迹仍不能达到定量标识线的可再补加一些样本，使其液迹能到达定量标识线。确保参加免疫反应的样本液一致。这项优选尤其对基质粘稠样本很重要。

作为优选，当样本液加入后，样本液经过滤物垫、样本垫和标记物垫后，样本液会沿着硝酸纤维素膜向吸水垫和稀释液垫两个方向侧流层析。这种两个侧流层析方向的特征与现有技术具有本质差异：

(1)所述要求，由于增加向“稀释液垫”方向流动，样本与标记垫反应后的液迹不会很快到达T线。随着样本液的耗尽，渗透入硝酸纤维素膜的样本液和标记物将渐渐减慢直至停滞，这个停滞缓冲过程，相比现有技术，增加了样本液和标记物偶联的抗原(或抗体)结合反应时间，达到提高灵敏度的作用；

(2)由于双侧流，被测样本与标记的抗原(或抗体)以标记垫的中心对称分布均匀展开，可改善单侧流形成“反应死角”的现象；

(3)在控制加样量、加稀释液量以及控制免疫反应时间的基础上，增加通过“定量标识线(M)”对第一次的免疫复合物的液量可实施准确的定量控制。

与现有技术中样本液和标记物都是趋于全部释放到硝酸纤维素膜上不同，本发明是在加入样本液后，标记物随样本液流入硝酸硝酸纤维素膜之后，在液迹侧流到定量标识线(M)时，“定量”的样本液和标记物渗透到硝酸纤维素膜，此时标记物垫处于半干半湿状态，标记物垫、样品垫和滤物垫的吸水性远远低于硝酸纤维素膜。因此，当稀释液垫在加入稀释液后，硝酸纤维素膜的湿度将大于样品垫和标记物垫，未进入硝酸纤维素膜的剩余标记物和样本液只能有极少量向层析膜中渗透。稀释液只能将仅存于硝酸纤维素膜上的那部分样本液和标记物层析至吸水垫，故本发明快速检测卡可精确控制进入硝酸纤维素膜的样本液量。现有技术，虽然定量加样，但由于样本之间基质差异，导致进入硝酸纤维素膜的样本总量存有差异，直接影响检测结果的准确性和稳定性。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明提供的试纸条及检测卡结构简单，设计合理，通过加样孔加样品、清洗孔加稀释液，由于稀释液不经过样品垫、滤物垫和标记物垫，可减少标记物与样本溶液结合液从标记物垫中二次释放。并且要求在加入样本液后的液迹到达定量标识线(M)后，再从清洗孔加稀释液的方式，可以很精确的控制样本与标记物垫免疫结合反应的液量，不但提高被检测物的灵敏性、精密性，而且还保留了快诊检测方法的快速和方便特性。

作为优选，在标记物垫上加入色素，用于示踪标记物释放过程。当样本与标记物结合溶液的带有颜色的液迹，侧流到定量标记线(M)时，提示加稀释液；当稀释液层析完后，随着硝酸纤维素膜湿度减少，残留在标记物垫上的标记物和样本结合液可能又开始向膜上渗透，当再次看到有色的液迹开始出现时，应停止对结果判读。

本发明还利用上述的产气荚膜梭菌ε毒素双孔定量检测卡建立了一种基于可见光激发的镧系荧光免疫层析检测方法，在生物毒素的检测中获得了较高的最低检测限，与配套的小型便携化检测仪器配套使用，具有检测快速、可远程传输结果的优势。未来在生物反恐、生物武器核查等领域具有较高的应用价值和应用前景。产气荚膜梭菌ε毒素高敏荧光检测方法具有灵敏度高、检测仪器小型化、成本低，能解决上述现有技术的不足之处。对于生物恐怖袭击、生物武器核查、突发公共卫生事件以及食品安全等多个领域具有重要意义，为多环境现场检测提供了快速、敏感、准确的检测方法。

附图说明

图1是本发明产气荚膜梭菌ε毒素检测试纸条的结构示意图；

图2是本发明产气荚膜梭菌ε毒素检测卡外壳的俯视图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。

如图1所示，一种产气荚膜梭菌ε毒素快速检测试纸条，包括PVC底板1、吸水垫2、硝酸纤维素膜3、标记物垫5、样品垫8、滤物垫9和稀释液垫4；所述硝酸纤维素膜3固定在PVC底板1上，所述硝酸纤维素膜3左端搭接所述吸水垫2，右端搭接所述稀释液垫4；所述标记物垫5放置在所述硝酸纤维素膜3上且位于所述稀释液垫4前方，所述吸水垫2的方向定义为前方；并在所述标记物垫5和稀释液垫4之间保留了1-10mm硝酸纤维素膜裸露空间；在所述标记物垫5上设置所述样品垫8；在所述硝酸纤维素膜3上所述吸水垫2与标记物垫5之间的区间的沿着从标记物垫5到吸水垫2方向依次设置检测线(T线)7和质控线(C线)6，在所述标记物垫5和检测线(T线)7之间设置定量标识线(M线)13；

所述标记物垫5上浸染标记镧系荧光微球的ETX多抗和标记镧系荧光微球的鸡IgY抗体的；在检测线7上包被ETX多抗，质控线6上包被羊抗鸡IgY抗体的IgG。

作为一种优选，所述标记物垫5中加入有色素的标示物。

如图2所示，一种产气荚膜梭菌ε毒素双孔快速定量检测卡，包括外壳14和设置在所述外壳14内的上述双孔快速定量试纸条；在外壳的上壳上对应检测线7和质控线6的区间设置检测窗口10；在检测窗口边沿设置定量标识线(M线)13(也可用检测窗边沿做定量标识线)；对应样品垫处设置加样孔11，对应稀释液垫4处设置清洗孔12。

本发明还提供了上述产气荚膜梭菌ε毒素双孔快速定量检测卡检测样本的方法。

本发明所提供的检测样本的方法，包括下述步骤：从所述快速检测卡的加样孔加入样本液，然后待样本液水印移动到所述检测卡试纸条中的定量标识线，再从清洗孔加入稀释液，最后通过检测窗口观测或通过相应仪器进行判读结果。

所述仪器如金标读数仪、荧光分析仪、上转换分析仪等。

具体使用时，从加样孔11加入样品液(一般样品液加入量为5-50μL)，样品液经过滤物垫9、样品垫8和标记物垫5后进入硝酸纤维素膜3，由于稀释液垫4和吸水垫2均为干燥状态，并且样品垫8和标记物垫5的液体承载量之和远小于两侧的吸水垫2和稀释液垫4，因此样品液会带着标记物向层析膜两侧双向渗透，直至耗尽，使包含免疫反应复合物标记物的样品液将停留在硝酸纤维素膜3上的定量标识线附近。相比现有技术，本发明使样本液与标记物垫中偶联的生物原料获得更多的反应时间，且不会到达检测线7。当样品液与标记物经过一定反应时间后(一般为0.5-5分钟)样本液流动的液迹出现在检测窗口的定量标识线(M)时，将稀释液(稀释液可以是纯净水，也可以是PBS缓冲液)加入清洗孔12，稀释液首先经过稀释液垫4，稀释液垫4中可包含用于消除非特异性反应的试剂组份(如阻断剂)，稀释液与其混合后进入硝酸纤维素膜3，将已经释放的带有标记所示踪物的样本免疫复合液进行稀释，在吸水垫2作用下，随着稀释液向吸水垫2方向流动，与T、C线上包被的抗原(或抗体)进行免疫结合，并被捕获停留在T、C线上，剩余物质通过侧向层析继续在硝酸纤维素膜上流动被吸水垫吸收，直至完成免疫层析。通过检测窗10观测或通过仪器检测、判读。

在初始状态硝酸纤维素膜3是处于干燥状态，样品液和标记物会快速释放到硝酸纤维素膜3上，基本不受样品差异影响，之后残留在标记物垫5中的标记物和样品液会缓慢进入到硝酸纤维素膜3，此时的释放过程的快慢受样品差异影响较大，会影响免疫层析的稳定性。基于此，本发明将加样孔设置在硝酸纤维素膜中间偏稀释孔位置，样品液和标记物渗透到层析膜上后会向两侧层析，直至样本液耗尽并停留在层析膜定量标识线附近，此时，加入稀释液，由于硝酸纤维素膜3的湿度大于标记物垫5，标记物垫5中残留的标记物向硝酸纤维素膜3中继续释放，其量与开始两侧分流停在硝酸纤维素膜3的量是极少的。

本发明通过稀释液注入后终止标记物继续释放的双孔结构设计，可根据要求阻止样品液和标记物释放到硝酸纤维素膜3中，确保进入硝酸纤维素膜3的样品液和标记物的数量稳定，提高免疫层析法的稳定性和精密度。本发明通过样品液和稀释液分开加样的方式，可改善依靠样品液自清洗的清洗效率，最大限度地保证检测窗10中硝酸纤维素膜3的背景洁净度。

本发明实现除控制第一次样本加样量、免疫反应时间定量外，再加一种对被测样本与标记物质反应量的控制，从而提高了侧流层析检测方法的灵敏度和精密度。

下面对本检测卡的制作过程进行具体说明。

下述实施例中：

鸡IgY购自杭州启泰生物科技有限公司；

羊抗鸡IgY的IgG购自杭州启泰生物科技有限公司；

产气荚膜梭菌ε毒素多抗由本实验室制备:产气荚膜梭菌ε毒素(GI:1282172312，序列：mkknlvksla iasavisiys ivnivsptnv iakeisntvs nemskkasyd nvdtliekgryntkynylkr mekyypnama yfdkvtinpq gndfyinnpk veldgepsmn yledvyvgka lltndtqqeqklksqsftck ntdtvtattt htvgtsiqat akftvpfnet gvslttsysf antntntnsk eithnvpsqdilvpanttve viaylkkvnv kgnvklvgqv sgsewgeips ylafprdgyk fslsdtvnks dlnedgtiningkgnysavm gdelivkvrn lntnnvqeyv ipvdkkeksn dsnivkyrsl sikapgik)作为抗原，免疫大耳白兔，收集血清，纯化得到产气荚膜梭菌ε毒素多抗；

镧系荧光微球购自成都微瑞生物科技有限公司。

实施例1、制备产气荚膜梭菌ε毒素检测卡

产气荚膜梭菌ε毒素检测卡检测原理(夹心法)：

如图1所示的检测卡，在质控线6处包被羊抗鸡IgY的IgG，检测线7包被ETX多抗。当含有ETX样本加入时，经过标记物垫时，ETX与标记有ETX多抗的镧系荧光微球结合形成复合物，当流至定量标识线(M)，加稀释液让复合物在硝酸纤维素膜上流动，标记镧系荧光微球的ETX多抗就被T线包被的ETX多抗捕获，形成双抗体夹心复合物固定在T线上，使检测线(T)显荧光，检测线(T)捕获的ETX结合物与标记镧系荧光物的含量成正比。当样本中不含有或含少量ETX抗原时，检测线上的ETX多抗就捕获不到标记有ETX多抗的镧系荧光微球，从而使检测线不显荧光；标记有鸡IgY的镧系荧光微球被质控线上的羊抗鸡IgY的IgG捕获，而使质控线显荧光。经镧系荧光免疫分析仪检测，得到检测线和参考线的荧光比值，通过预置相应的“标准曲线”换算，即可测得被测样本中产气荚膜梭菌ε毒素的含量。实现快速、精确产气荚膜梭菌ε毒素定量检测。

下面对产气荚膜梭菌ε毒素检测卡的制作过程进行具体说明，采用镧系荧光微球做为标记物。

步骤一，把硝酸纤维素膜(Sartorius CN140)粘贴在PVC底板上，采用点膜喷金专用机器在硝酸纤维素膜上喷涂已稀释至0.3mg/ml的羊抗鸡IgY的IgG形成质控线(C线)和已稀释至1.5mg/ml的ETX多抗形成检测线(T线)，喷量为1μl/cm，然后在37℃的温度下烘制16小时；

步骤二，制备标记有鸡IgY的镧系荧光微球和标记有ETX多抗的镧系荧光微球，将1mL的镧系荧光微球加入到5mL的MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液(0.05M，pH7.2)中，再加入10mg碳二亚胺(EDC)和10mg N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐搅拌溶解，室温反应30分钟后进行离心操作，将离心沉淀物用50mM硼酸缓冲液(pH8.2)复溶，加入2mg透析过的鸡IgY，在室温条件下搅拌反应24小时，然后离心、封闭后，再在稀释液中保存(保存环境温度为2～8℃)，即得标记有鸡IgY的镧系荧光微球；采用上述同样的方法标记ETX多抗的镧系荧光微球；

步骤三，把标记有鸡IgY和标记有ETX多抗的镧系荧光微球分别稀释至浓度0.1μg/ml和4μg/ml混合在一起，采用点膜喷金机器将其喷涂在聚酯膜上构成标记物垫，喷量为2.5μl/cm，然后在37℃的温度下烘制8小时；

步骤四，把标记物垫切成8mm长，样品垫也切成8mm长，然后通过双面胶叠加粘在一起，然后用连续切割机切成5mm宽的加样条，并把它们组装在检测卡外壳上盖的加样孔下面；

步骤五，把305mm长、12mm宽的稀释垫和305mm长、17mm宽的吸水垫对应粘在PVC底板上的硝酸纤维膜两端，组装成大卡，再用连续切割机切成4.15mm宽的试纸条，装配在检测卡外壳下盖内，把检测卡的上、下盖扣合在一起即得到产气荚膜梭菌ε毒素检测卡。

进行检测时，在加样孔中加入40μL样本，3分种后样本液迹移至定量标识线(M)时，再在清洗孔中加入80μL清洗液层析17分钟，最后通过荧光分析仪器进行判读结果。

制备产气荚膜梭菌ε毒素检测标准曲线：

配置含有产气荚膜梭菌ε毒素的标准溶液8份，浓度分别为0、0.1、0.5、1、5、10、25、50ng/mL。将上述不同浓度的标准液50uL分别加入装配好的双孔检测卡的中间加样孔内，然后在后面的加样孔中加入80uL稀释液，总层析免疫反应时间为20分钟，通过镧系荧光免疫分析仪进行检测，计算出标准品对应的检测线和质控线的荧光信号强度比值，并根据此数据进行线性回归制出产气荚膜梭菌ε毒素的标准曲线。

用产气荚膜梭菌ε毒素标准品配制5ng/mL的标准溶液，按实施例加样方式加入40μL样品，当液迹流到定量标识线，加80μL稀释液(PBS)免疫层析12min，然后用成都微瑞生物科技有限公司生产的WR-1608型荧光免疫分析仪对检测卡进行检测，获取检测线和质控线的荧光信号，荧光分析仪通过蓝牙把检测数据传到客户端，客户端根据检测数据计算出检测线的荧光信号强度值和质控线的荧光信号强度比值，客户端通过扫描此批检测卡的条形码从云平台获得被检测产气荚膜梭菌ε毒素标准曲线，再根据标准曲线与质控线和检测线的荧光信号强度比值的对照关系计算得出待测样本中产气荚膜梭菌ε毒素的含量。

检测结果为5.08ng/mL。按上述方法操作，当加入40μL样本和80uL稀释液时，稀释液为PBS，检测结果为5.08ng/mL。结果显示样本加入量偏差，对结果影响不大。

重复性实验数据：将上述样本按40μL加入样本，然后加入80μL稀释液，重复10次结果分别为：5.08ng/mL、5.12ng/mL、4.92ng/mL、4.84ng/mL、4.93ng/mL、5.06ng/mL、5.15ng/mL、5.10ng/mL、4.91ng/mL、5.09ng/mL，偏差小于15％。

灵敏度实验：

用产气荚膜梭菌ε毒素标准品配制5ng/mL的标准液，并将其稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍，分别加样和检测，结果如下：5.11ng/mL、2.32ng/mL、0.92ng/mL、0.51ng/mL、0ng/mL。结果证明灵敏度能够达到0.5ng/mL。

上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不限以限制于本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 成都微瑞生物科技有限公司

<120> 一种产气荚膜梭菌ε毒素快速定量检测卡

<130> GNCZJ210471

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Lys Lys Asn Leu Val Lys Ser Leu Ala Ile Ala Ser Ala Val Ile

1 5 10 15

Ser Ile Tyr Ser Ile Val Asn Ile Val Ser Pro Thr Asn Val Ile Ala

20 25 30

Lys Glu Ile Ser Asn Thr Val Ser Asn Glu Met Ser Lys Lys Ala Ser

35 40 45

Tyr Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asn Thr Lys

50 55 60

Tyr Asn Tyr Leu Lys Arg Met Glu Lys Tyr Tyr Pro Asn Ala Met Ala

65 70 75 80

Tyr Phe Asp Lys Val Thr Ile Asn Pro Gln Gly Asn Asp Phe Tyr Ile

85 90 95

Asn Asn Pro Lys Val Glu Leu Asp Gly Glu Pro Ser Met Asn Tyr Leu

100 105 110

Glu Asp Val Tyr Val Gly Lys Ala Leu Leu Thr Asn Asp Thr Gln Gln

115 120 125

Glu Gln Lys Leu Lys Ser Gln Ser Phe Thr Cys Lys Asn Thr Asp Thr

130 135 140

Val Thr Ala Thr Thr Thr His Thr Val Gly Thr Ser Ile Gln Ala Thr

145 150 155 160

Ala Lys Phe Thr Val Pro Phe Asn Glu Thr Gly Val Ser Leu Thr Thr

165 170 175

Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr Asn Ser Lys Glu Ile

180 185 190

Thr His Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val Pro Ala Asn Thr Thr

195 200 205

Val Glu Val Ile Ala Tyr Leu Lys Lys Val Asn Val Lys Gly Asn Val

210 215 220

Lys Leu Val Gly Gln Val Ser Gly Ser Glu Trp Gly Glu Ile Pro Ser

225 230 235 240

Tyr Leu Ala Phe Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Phe Ser Leu Ser Asp Thr

245 250 255

Val Asn Lys Ser Asp Leu Asn Glu Asp Gly Thr Ile Asn Ile Asn Gly

260 265 270

Lys Gly Asn Tyr Ser Ala Val Met Gly Asp Glu Leu Ile Val Lys Val

275 280 285

Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr Val Ile Pro Val Asp

290 295 300

Lys Lys Glu Lys Ser Asn Asp Ser Asn Ile Val Lys Tyr Arg Ser Leu

305 310 315 320

Ser Ile Lys Ala Pro Gly Ile Lys

325