猪病毒性疾病的磁纳米微粒可视化病原检测试剂盒

技术领域

本发明属于纳米材料、分析化学和动物病毒检测领域，涉及猪常见病原的磁纳米微粒可视化检测试剂盒。

背景技术

集约化养猪场是实行高密度、高效率、连续均衡生产的专业化养猪场。集约化养猪场对饲养管理和疫病防控有着极高的要求，一旦病原侵入就很难清除，防控的难点在于多种病原共同作用而产生的混合感染或者继发感染。其发生可增加猪场的不稳定性因素，容易造成整个猪场疾病不断，甚至带来疾病的大流行。

目前常见的危害规模化养猪生产的猪病毒性疾病主要包括：猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)混合感染引起的妊娠母猪的繁殖障碍及各年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病；猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)引起的妊娠母猪流产、不孕或生产死胎；伪狂犬病病毒(PRV)引起的以母猪繁殖障碍和仔猪神经症状为主要特征的高度接触性传染病；猪瘟病毒(CSFV)持续性感染引起的以母猪繁殖障碍为主要特征的非典型性猪瘟；猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染引起的以呕吐、水样腹泻、急性肠炎、脱水和精神沉郁为临床症状的高度传染性的猪肠道疾病。PCV2感染以及其引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wastingsyndrone，PMWS)是上述各类病原感染并致病的最根本原因。PCV2感染本身对猪没有较强的致病性，但是猪对其具有较强的易感性，PCV2感染导致猪免疫力下降，从而使机体更易感染其他病原(感染PCV2的猪更易于感染PPV、PRRSV、CSFV、PRV等病原)，进而使这些病原的感染率和相关疾病的发病率显著升高。多个病原的混合感染不仅造成患病猪生长缓慢，使猪场的生产低下，而且显著提升疾病的诊断难度，使患病猪无法得到及时有效的治疗，病原体的传播不能得到及时有效地截断，导致同一猪场发生进行性扩散感染，最终导致大量猪的患病或死亡。

在诊断方法上，针对上述病原仍普遍采用传统的病原分离鉴定、血清学检测方法以及PCR。病原分离和生化鉴定不仅费时费力，而且敏感性和特异性都较差，血清学诊断方法不仅不能在猪患病的早期得出结果，而且检测的结果受不同实验室的条件的影响。尽管目前已经建立针对PCV2、PRRSV、PPV、CSFV和PRV的单项PCR、部分多重PCR和荧光定量PCR诊断方法，但是这些方法所采用的核酸提取等复杂操作均需在实验室进行，无法快速对非发病或疑似发病猪场进行病原跟踪监测和对发病猪场进行快速有效的病原现场诊断。

中国专利CN1339609A公开了纳米微粒标记基因探针及其制备方法和应用，该专利通过纳米标记基因探针的制备，实现了纳米放大和目视显色，但纳米颗粒与DNA的连接存在制作成本高、稳定性差及使用不便的问题。为此，中国专利CN1415759A公开了纳米微粒与亲和素标记探针及其制备方法和应用，通过制备的亲和素/链霉亲和素/抗生物素-胶体/纳米微粒复合物，可以利用常规的固定相检测探针、生物素标记探针及该复合物进行DNA的检测。但以上两个专利在实际检测应用中仍需要提取样品中的核酸成分，需要依托于实验室的仪器设备，不能实现无仪器化的现场快速检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪病毒性疾病的磁纳米微粒可视化病原检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种猪病毒性疾病的可视化病原检测试剂盒，该试剂盒包括核酸信号可视化检测试剂，所述核酸信号可视化检测试剂包括富集探针、杂交探针和通用探针；富集探针为用于对样品中的目的病原核酸进行一次识别(即核酸信号检测)的特异性核酸分子探针，杂交探针为用于对所述目的病原核酸进行二次识别(即放大核酸信号)的特异性核酸分子探针，通用探针为用于通过募集工具酶可视化所述二次识别的结果(即再次放大核酸信号)且与所述目的病原核酸无同源性的核酸分子探针。

优选的，所述富集探针选自具有如SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.8、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.12、SEQ.ID.NO.14所示的特异性核酸序列的单链DNA探针分子(对应识别并结合猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒的核酸)中的一种或多种；杂交探针选自具有如SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.5、SEQ.ID.NO.7、SEQ.ID.NO.9、SEQ.ID.NO.11、SEQ.ID.NO.13、SEQ.ID.NO.15所示的特异性核酸序列的单链DNA探针分子(对应识别并结合猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒的核酸)中的一种或多种；通用探针为核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示的单链DNA探针分子。

优选的，所述核酸信号可视化检测试剂具体包括功能化磁性微粒和功能化纳米材料颗粒；富集探针的5'端为氨基修饰，并通过该氨基偶联于磁性微粒上，从而形成功能化磁性微粒；杂交探针的5'端为巯基修饰，并通过该巯基偶联于纳米材料(例如，纳米金)颗粒上；通用探针的5'端为巯基修饰，3'端为生物素修饰，通用探针通过该巯基偶联于所述纳米材料颗粒上，从而形成功能化纳米材料颗粒。

优选的，所述富集探针按照每250～500mg磁性微粒加入1nmol富集探针的比例与磁性微粒进行偶联，功能化磁性微粒的工作浓度为9～11mg/mL。

优选的，以物质的量计，所述杂交探针和通用探针按两种探针总的用量为纳米材料颗粒用量的15～30倍与纳米材料颗粒进行偶联，这两种探针之间的物质的量比为1:2～1:10(杂交探针:通用探针)，功能化纳米材料颗粒的工作浓度为90～100nmol/L。

优选的，所述试剂盒还包括核酸释放试剂，可以用于使样品中的病原释放核酸。

优选的，所述核酸释放试剂的成分包括10～30mM Tris-HCl、1～5mM EDTA、15～50mM NaCl、0.1～0.5M盐酸胍以及0.5％～1％(w/v)SDS，pH＝8.0～8.5。

优选的，所述试剂盒还包括杂交缓冲液，可以用于为以上两种特异性核酸分子探针(具体指功能化磁性微粒上的富集探针以及功能化纳米材料颗粒上的杂交探针)与释放的病原核酸的特异性识别及结合提供反应环境，从而形成磁性微粒-病原核酸-纳米材料复合物(简称杂交复合物)。

优选的，所述杂交缓冲液的成分组成为55～65mL 5～10×SSC、50～100μL Tween-20、50～100μL Tween-80以及35～45mL 0.5％～1％(w/v)SDS，pH＝8.0～8.5。

优选的，所述试剂盒还包括工具酶以及稳定、pH值适宜的显色试剂(含有显色底物)和显色终止试剂，用于实现目视显色和定量分析。

优选的，所述工具酶为可以与上述通用探针(具体指杂交复合物中的功能化纳米材料颗粒上的通用探针)通过所修饰的生物素实现特异性结合的经过修饰的辣根过氧化物酶，例如，辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(SA-HRP)，显色试剂包括TMB，显色终止试剂为2～4M H

优选的，所述试剂盒还包括核酸洗脱剂，用于随机消化降解结合有工具酶的杂交复合物中的各种核酸分子(例如，上述单链DNA探针分子)，从而使所述工具酶游离在洗脱体系中，以便与显色试剂进行酶促可视化反应。

优选的，所述试剂盒还包括洗涤剂，洗涤剂用于去除杂质(例如，未与目的病原核酸结合的特异性核酸分子探针、未与杂交复合物结合的工具酶)，从而纯化未结合或结合有工具酶的杂交复合物，例如，采用1～3M PBS。

一种核酸可视化检测方法，该检测方法包括以下步骤：

1)使功能化磁性微粒和功能化纳米材料颗粒与样品中的目的病原核酸或目的非病原核酸通过两次特异性识别形成杂交复合物；

2)使杂交复合物与工具酶特异性结合；洗脱杂交复合物上结合的工具酶；利用洗脱的工具酶进行显色反应；目视下读取显色结果。

优选的，所述功能化磁性微粒的制备方法包括以下步骤：将羧基修饰的磁性微球(例如，磁珠)与氨基修饰的富集探针通过酰胺反应形成肽键，得到用于富集核酸信号的磁性微球，即功能化磁性微粒。

优选的，所述功能化纳米材料颗粒的制备方法包括以下步骤：将纳米金与巯基修饰的杂交探针以及巯基和生物素修饰的通用探针通过形成-Au-S-键连接，得到用于放大富集的核酸信号的纳米金颗粒，即功能化纳米材料颗粒。

优选的，所述步骤1)中，目的病原核酸选自猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒或猪细小病毒释放的核酸；将样品与上述核酸释放试剂混合后于95～100℃加热10～15min，即可使样品中的病原释放核酸，其中，样品用量为500μL～1mL，核酸释放试剂用量为500μL～1mL(与样品按一定比例，例如等量混合)。

优选的，所述步骤1)中，功能化磁性微粒与样品中的核酸的杂交条件为在800μL以上杂交缓冲液中反应40～50min，反应温度为40～42℃，功能化磁性微粒的用量为5μL以上；功能化纳米材料颗粒与结合有功能化磁性微粒的核酸的杂交条件为50～55℃反应50～60min，功能化纳米材料颗粒的用量为5μL以上。

优选的，所述样品选自血清或粪便上清。

优选的，所述步骤2)中，显色反应是指由所述工具酶(例如，SA-HRP)与显色底物(例如，TMB)进行的酶促可视化反应；显色结果的读取具体包括以下步骤：经显色终止试剂(例如，H

优选的，对于目的病原核酸，若反应体系颜色变化明显则判定样品中存在对应的病原，否则判定样品中不存在对应的病原，从而在现场快速完成病原检测。

优选的，所述检测方法还包括以下步骤：

5)显色反应终止后也可进行显色程度的定量分析，提高病原诊断的准确性，消除人为辨识的误差干扰，降低假阳性。

本发明的有益效果体现在：

本发明的试剂盒采用两种特异性识别探针，即富集探针和杂交探针同时检测样品中的目的病原核酸，检测过程无需从样品中提取核酸；同时，利用通用探针募集工具酶，从而可以通过酶促可视化反应对检测信号进行显示，使得病原检测程序简捷、检测仪器设备需求简单，不需要依托于实验室的仪器设备，并且检测结果具有特异性、准确性、可视化的优点，检测灵敏度可达到PCR法的检测水平，能够满足基层机构和疫源地无任何实验室条件下的病原快速检测的需要，从而为猪病毒性传染病的早发现、早预防和早治疗提供技术支撑，经济和社会意义巨大。

进一步的，本发明对依据目的病原基因序列设计的富集探针、杂交探针进行了优化，获得针对性的检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒等猪常见病原的特异性识别探针(富集探针和杂交探针)，具有特异性强、富集效率和杂交效率高的优势，同时适用于DNA/RNA病原核酸，有利于猪常见病原的现场诊断。

进一步地，本发明的核酸释放试剂采用了0.1～0.5M盐酸胍等经过优化确定的组分，可用于对血清或粪便上清的处理，为核酸的释放提供更佳的pH值环境，并显著抑制在核酸释放过程中核酸酶对核酸的降解，维持病原核酸的稳定。该核酸释放试剂仅需要10～15min即可完成待检测样品中病原核酸的释放，解决了常用苯酚/氯仿法处理时间较长的问题；同时，简化了样品处理操作，不需要离心、抽提等核酸提取操作步骤。

进一步地，本发明的杂交缓冲液优化了组分的比例，从而提供适宜pH的环境，以及提高探针与核酸的特异性杂交效率，减少非特异性杂交。

进一步地，本发明以辣根过氧化物酶标记链霉亲和素作为工具酶，可以与通用探针的经生物素修饰的3’端特异性结合，然后经过洗脱、显色，从而将经功能化纳米材料颗粒放大的核酸信号通过酶促反应的颜色变化，进行肉眼可辨识(目视)的可视化转化，使检测结果直观易读，解决了功能化纳米材料颗粒所完成的核酸信号放大不足以通过颜色变化直观反映样品中病原的存在情况的问题，并可进行精确定量分析。

附图说明

图1为本发明实施例中试剂盒的检测原理图。

图2为核酸分子探针筛选结果图；其中，A：PRRSV探针筛选结果；B：PPV探针筛选结果；C：CSFV探针筛选结果；D：PCV2探针筛选结果；E：TGEV探针筛选结果；F：PEDV探针筛选结果；G：PRV探针筛选结果。

图3为磁纳米微粒可视化特异性检测结果图：(A)针对PRV的探针特异性试验；其中，1：PRV；2：PPV；3：PCV2；4：CSFV；5：PRRSV；6：TGEV；7：PEDV；8：阳性血清；9：健康猪血清；(B)针对PPV的探针特异性试验；其中，1：PRV；2：PPV；3：PCV2；4：CSFV；5：PRRSV；6：TGEV；7：PEDV；8：阳性血清；9：健康猪血清；(C)针对PCV2的探针特异性试验；其中，1：PRV；2：PPV；3：PCV2；4：CSFV；5：PRRSV；6：TGEV；7：PEDV；8：阳性血清；9：健康猪血清；(D)针对CSFV的探针特异性试验；其中，1：PRV；2：PPV；3：PCV2；4：CSFV；5：PRRSV；6：TGEV；7：PEDV；8：阳性血清；9：健康猪血清；(E)针对PRRSV的探针特异性试验；其中，1：PRV；2：PPV；3：PCV2；4：CSFV；5：PRRSV；6：TGEV；7：PEDV；8：阳性血清；9：健康猪血清；(F)针对TGEV的探针特异性试验；其中，1：PRV；2：PPV；3：PCV2；4：CSFV；5：PRRSV；6：TGEV；7：PEDV；8：阳性粪便；9：健康猪粪便；(G)针对PEDV的探针特异性试验，其中，1：PRV；2：PPV；3：PCV2；4：CSFV；5：PRRSV；6：TGEV；7：PEDV；8：阳性粪便；9：健康猪粪便。

图4为磁纳米微粒可视化灵敏度检测结果图；其中，A：PRV倍比稀释的血清样本；B：PPV倍比稀释的血清样本；C：PCV2倍比稀释的血清样本；D：CSFV倍比稀释的血清样本；E：PRRSV倍比稀释的血清样本；F：PEDV倍比稀释的粪便样本；G：TGEV倍比稀释的粪便样本。

图5为磁纳米微粒可视化检测第一次重复性试验结果图；其中，A：PRV重复性试验，1～3为4×10

图6为磁纳米微粒可视化检测第二次重复性试验结果图：A：PRV重复性试验，1～3为4×10

图7为磁纳米微粒可视化检测第三次重复性试验结果图：A：PRV重复性试验，1～3为4×10

图8为检测结果标准色板对照图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

本发明建立一种快速、准确、特异、经济的可用于感染现场诊断的磁纳米微粒可视化诊断方法(Ultrasensitive Nanoparticle Visualization detection，UNVs)，以期实现对发病家畜(例如，猪)群体感染病原的现场快速诊断。该方法通过将磁珠富集核酸、纳米金放大核酸信号与酶促可视化反应相结合，实现了检测过程无仪器化，反应产物无需复杂后处理，反应结果可以直接肉眼观察(肉眼可见阳性样品的反应液变成黄色，阴性样品的反应液则为无色)。检测方法特异性好、准确度高、反应在4h以内均可完成，灵敏度可达到常规PCR检测水平。

(一)核酸分子探针的设计和筛选

从美国国家生物技术信息中心(NCBI)的Genbank库中下载7种猪常见病原全部毒株的基因组序列，并进行全基因组序列比对，分别找出复制酶区域高度特异保守片段，并以此设计核酸分子探针(利用引物设计软件Primer 5设计)。

参见图2，接着结合前期研究，从设计的探针中筛选针对各个病毒的复制酶区域的高度保守序列的共29条核酸分子探针；其中包括富集探针、杂交探针。

为了消除磁性微粒等不良因素影响，提高检测的准确性、特异性，参照试验结果验证(29条核酸分子探针OD450数值，表1)，进一步筛选出具有良好的捕获病原核酸和放大病原核酸信号能力的核酸分子探针，具体序列共15条，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成并进行修饰：

修饰后的通用探针：

5'SH-TTTTTTTTTTTTTTTCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTG-biotin 3'

修饰后的猪伪狂犬病毒(PRV)富集探针：

5'NH

T

修饰后的猪伪狂犬病毒(PRV)杂交探针：

5'SH-T

修饰后的猪圆环病毒2型(PCV2)富集探针：

5'NH

修饰后的猪圆环病毒2型(PCV2)杂交探针：

5′SH-T

修饰后的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)富集探针：

5'NH

修饰后的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)杂交探针：

5'SH-T

修饰后的猪瘟病毒(CSFV)富集探针：

5'NH

修饰后的猪瘟病毒(CSFV)杂交探针：

5'SH-T

修饰后的猪流行性腹泻病毒(PEDV)富集探针：

5'NH

修饰后的猪流行性腹泻病毒(PEDV)杂交探针：

5'SH-T

修饰后的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)富集探针：

5'NH

修饰后的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)杂交探针：

5'SH-T

修饰后的猪细小病毒(PPV)富集探针：

5'NH

修饰后的猪细小病毒(PPV)杂交探针：

5'SH-T

其中，为验证核酸分子探针有效性，针对特定病原核酸中对应于富集探针和杂交探针间序列且分别向该序列5'端和3'端外延长10bp作为标准阳性模板(委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。所使用毒株：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)毒株(GenBank No.HQ401282)，猪圆环病毒2型(PCV2)毒株(GenBank No.MH492006.1)，猪细小病毒(PPV)毒株(GenBank No.MK993540)，猪流行性腹泻病毒(PEDV)毒株(GenBankNo.AF353511)，猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)毒株(GenBank No.HQ462571)，猪瘟病毒(CSFV)毒株(GenBank No.AY775178)，猪伪狂犬病毒(PRV)毒株(GenBank No.MH582511.1)。上述毒株均可从西北农林科技大学病理实验室获得。猪伪狂犬病毒(PRV)标准阳性模板序列参见SEQ.ID.NO.16。猪细小病毒(PPV)标准阳性模板序列参见SEQ.ID.NO.17。猪圆环病毒2型(PCV2)标准阳性模板序列参见SEQ.ID.NO.18。猪瘟病毒(CSFV)标准阳性模板序列参见SEQ.ID.NO.19。猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)标准阳性模板序列参见SEQ.ID.NO.20。猪流行性腹泻病毒(PEDV)标准阳性模板序列参见SEQ.ID.NO.21。猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)标准阳性模板序列参见SEQ.ID.NO.22。

表1.核酸分子探针筛选结果(OD450数值)

注：阴性对照指健康猪血清/粪便，阳性对照指对应的病毒标准阳性模板；病毒指标准血清/粪便阳性样品，由健康猪血清/粪便与单种病毒混合而成；P1、P2表示2个候选的富集探针，O1、O2表示2个候选的杂交探针；加粗的OD450数值对应筛选结果。

(二)试剂盒的组成、使用方法和保存期

1.试剂盒的组成

试剂盒的试剂依据功能分区，分为A、B、C、D共4部分，其中A区域为病原核酸释放试剂，B区域为病原核酸富集试剂，C区域为信号放大试剂，D区域为结果可视化试剂。试剂盒所涉及的核酸分子包括以上筛选获得的富集探针、杂交探针、通用探针和标准阳性模板。

1.1试剂盒的A区域

100mL(水溶液)病毒核酸释放试剂(A0)的配方为：10mM Tris-HCl、1mM EDTA、15mMNaCl、0.2M盐酸胍以及0.5％(g/mL)SDS，pH＝8.0。

1.2试剂盒的B区域

HB杂交缓冲液(B1)的配方为：5×SSC(60mL)、50μL Tween-20，50μL Tween-80以及0.5％(g/mL)SDS(40mL)，pH＝8.0。

1mL B2(猪伪狂犬病毒富集探针与磁性微粒结合产物)一支；1mL B3(猪细小病毒富集探针与磁性微粒结合产物)一支；1mL B4(猪圆环病毒2型富集探针与磁性微粒结合产物)一支；1mL B5(猪瘟病毒富集探针与磁性微粒结合产物)一支；1mL B6(猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒富集探针与磁性微粒结合产物)一支；1mL B7(猪流行性腹泻病毒富集探针与磁性微粒结合产物)一支；1mL B8(猪传染性胃肠炎病毒富集探针与磁性微粒结合产物)一支；

所述B区域中，试剂B2～B8分别含有由猪7种不同病原对应的富集探针和磁性微球结合而形成的功能化磁性微粒，具体制备方法如下：先将商品化的直径为1μM的羧基化磁珠(100mg/mL)用TE缓冲液(1M Tris(pH＝8.0)10mL、100mM EDTA10mL，以及ddH

1.3试剂盒的C区域

500mL wash洗涤剂(C1)，具体为2M PBS。

5mL wash洗脱剂(C2)，成分组成为：1U/μL DNase I、50mM Tris-acetatep(pH＝7.5)、10mM CaCl

200μL工具酶溶液(C3)，成分组成为：1mg/mL辣根过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素(SA-HRP)、10mM PBS、稳定剂以及50％(v/v)甘油，pH＝7.2，使用时用无菌无酶水稀释，比例为1:3000～1:5000。

1mL C4(猪伪狂犬病毒杂交探针、通用探针与纳米金结合产物)一支；1mL C5(猪细小病毒杂交探针、通用探针与纳米金结合产物)一支；1mL C6(猪圆环病毒2型杂交探针、通用探针与纳米金结合产物)一支；1mL C7(猪瘟病毒杂交探针、通用探针与纳米金结合产物)一支；1mL C8(猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒杂交探针、通用探针与纳米金结合产物)一支；1mL C9(猪流行性腹泻病毒杂交探针、通用探针与纳米金结合产物)一支；1mL C10(猪传染性胃肠炎病毒杂交探针、通用探针与纳米金结合产物)一支；

所述C区域中，试剂C4～C10分别含有由猪7种不同病原对应的杂交探针与通用探针及纳米金颗粒结合而形成的功能化纳米材料颗粒，具体制备方法如下：取商品化的纳米金溶液(直径15nm，10nM)于1.5mL EP管中，以9000g转速离心50min，弃去上清并重悬于无菌无酶水中。加入筛选出的针对猪7种不同病原之一的巯基修饰的杂交探针和通用探针，使两种核酸分子探针总量(杂交探针:通用探针摩尔比为1:2；使两种核酸分子探针终浓度总计为3μM)相对于纳米金的用量比为30:1(物质的量比)，室温孵育48h，并在期间逐步加入各12μL(1mol/L)NaCl和PB盐溶液(由0.1M Na

1.4试剂盒的D区域

显色试剂(TMB混合水溶液，D1)，成分组成为：24mL 0.2M Na

50mL显色终止试剂(D2)，具体为3M H

2.使用方法

2.1检测原理

参见图1，在目的病原核酸的介导下通过功能化磁珠募集功能化纳米金，通过功能化纳米金携带的大量通用探针(数量远远多于杂交探针)将目的病原核酸信号放大，随后利用通用探针的生物素募集辣根过氧化酶标记的链亲和素，再通过洗脱获得募集的辣根过氧化酶，并使底物显色，从而在经过对病原核酸的特异性募集以及对核酸信号的特异性放大后，实现在无严格仪器要求条件下对相应病原的可视化检测。

2.2检测流程

1)病原核酸的释放：取500μL制备好的样品(例如：血清样品，粪便样品经适量1MPBS浸泡沉淀后吸取上清)与500μL A0混合后一般采用100℃煮沸15min，得到病原核酸释放产物。

2)病原核酸的富集：B2～B8中的任意一种试剂5μL与800μL B1及病原核酸释放产物混匀后，40℃反应50min；得到第一反应产物。

3)病原核酸信号的放大：C4～C10中的对应一种溶液5μL(与步骤2针对的病原相同)和第一反应产物反应混匀后，50℃反应1h，得到第二反应产物。

4)纯化除杂：用1mL C1并借助磁力架，洗去第二反应产物中残留的杂交缓冲液成分和尚未结合的核酸分子探针，得到第三反应产物(形成三明治结构的杂交复合物)。

5)第三反应产物与100μL经无菌无酶水稀释(1:3000)后的C3中的工具酶(SA-HRP)发生特异性结合反应(37℃，1h)，得到第四反应产物。

6)纯化除杂：用1mL C1并借助磁力架，洗去第四反应产物中未结合工具酶，得到第五反应产物。

7)第五反应产物与20～50μL C2溶液在37℃充分反应10min，使第五反应产物中连接工具酶的核酸分子探针随机消化断裂，通过磁力架进行消化产物磁分离，收集游离的工具酶上清，得到第六反应产物。

8)第六反应产物与100μL D1混合，催化D1进行酶促可视化反应(37℃，10min，避光)，形成第七反应产物。

9)在第七反应产物中加入50μL D2终止酶促可视化反应，观察第七反应产物颜色变化，并结合酶标仪读数结果进行判定：若终止酶促可视化反应后第七反应产物黄色有明显变化，且酶标仪读取的OD450数值≥2.1倍的阴性对照，则判断目标病原(参照步骤2、3选择的与病原对应的试剂)存在，否则(若黄色变化不明显或无颜色变化，且OD450数值＜2.1倍的阴性对照)判断目标病原不存在。另外，利用OD450数值还可以对病原感染程度进行分析(图8)。

3.保存期

新组装的试剂盒在-20℃保存下，6个月后检测结果依然稳定有效。

(三)特异性试验

选取以上筛选到的核酸分子探针，分别以仅包含猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒的标准血清/粪便阳性样品作为待检样品，按所述使用方法进行检测，验证针对不同病原设计的核酸分子探针的特异性。试剂盒有效性判断：有明显颜色变化(黄色)，样品OD450数值≥2.1倍阴性对照。

其中荧光定量检测的PRV标准血清阳性样本的病毒量为5.398×10

针对不同病原的核酸分子探针分别检测PRV、PPV、PCV2、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV的标准血清/粪便阳性样品、阳性对照(阳性模板)、阴性对照(健康猪血清/粪便)的结果如图3所示。

如图3A所示，仅PRV的阳性对照和标准血清阳性样品反应管有明显颜色变化，而其它供试样品和阴性对照无明显颜色变化，结合表2PRV特异性OD450数值说明，针对PRV的磁纳米微粒可视化诊断方法能够进行特异性检测。如图3B所示，仅PPV的阳性对照和标准血清阳性样品反应管有明显颜色变化，而其它供试样品和阴性对照无明显颜色变化，结合表2PPV特异性OD450数值说明，针对PPV的磁纳米微粒可视化诊断方法能够进行特异性检测。如图3C所示，仅PCV2的阳性对照和标准血清阳性样品反应管有明显颜色变化，而其它供试样品和阴性对照无明显颜色变化，结合表2PCV2特异性OD450数值说明，针对PCV2的磁纳米微粒可视化诊断方法能够进行特异性检测。如图3D所示，仅CSFV的阳性对照和标准血清阳性样品反应管有明显颜色变化，而其它供试样品和阴性对照无明显颜色变化，结合表2CSFV特异性OD450数值说明，针对CSFV的磁纳米微粒可视化诊断方法能够进行特异性检测。如图3E所示，仅PRRSV的阳性对照和标准血清阳性样品反应管有明显颜色变化，而其它供试样品和阴性对照无明显颜色变化，结合表2PRRSV特异性OD450数值说明，针对PRRSV的磁纳米微粒可视化诊断方法能够进行特异性检测。如图3F所示，仅TGEV的阳性对照和标准粪便阳性样品反应管有明显颜色变化，而其它供试样品和阴性对照无明显颜色变化，结合表2TGEV特异性OD450数值说明，针对TGEV的磁纳米微粒可视化诊断方法能够进行特异性检测。如图3G所示，仅PEDV的阳性对照和标准粪便阳性样品反应管有明显颜色变化，而其它供试样品和阴性对照无明显颜色变化，结合表2PEDV特异性OD450数值说明，针对PEDV的磁纳米微粒可视化诊断方法能够进行特异性检测。

表2.磁纳米微粒可视化特异性试验的OD450数值

(四)灵敏度试验

为了确定本发明的磁纳米微粒可视化诊断方法的最小检出量，分别对含有不同病毒的标准血清/粪便阳性样品进行定量检测并计算病毒拷贝数(其中PRV标准血清阳性样本的病毒量为5.398×10

表3.磁纳米微粒可视化灵敏度试验的OD450数值

(五)重复性试验

本发明分别选取3个不同浓度标准血清/粪便阳性样品(分别为4×10

结果显示(表4～表10)，组内与组间的最大变异系数均小于1％，说明磁纳米微粒可视化诊断方法组内与组间重复性良好，可以获得比较稳定的数据。

表4.CSFV重复性试验结果

表5.PRRSV重复性试验结果

表6.PRV重复性试验结果

表7.PPV重复性试验结果

表8.PCV2重复性试验结果

表9.PEDV重复性试验结果

表10.TGEV重复性试验结果

(六)临床样本分析

选取了共499份不同病原的血清/粪便临床样本，运用本发明提供的磁纳米微粒可视化诊断方法和普通PCR检测方法进行平行试验。

结果表明(表11)：在猪细小病毒的51个血清样本中，使用常规的针对PPV的PCR检测发现16个阳性样本和35个阴性样本，而使用针对PPV的磁纳米微粒可视化诊断方法发现17个阳性样本和34个阴性样本。针对PPV的磁纳米微粒可视化诊断方法的阳性率(33.30％)高于PCR检测的阳性率(31.37％)。

表11.针对PPV的临床检测结果比较

结果表明(表12)：在猪伪狂犬病毒的76个血清样本中，使用常规的针对PRV的PCR检测发现17个阳性样本和59个阴性样本，而使用针对PRV的磁纳米微粒可视化诊断方法发现20个阳性样本和56个阴性样本。针对PRV的磁纳米微粒可视化诊断方法的阳性率(26.30％)高于PCR检测的阳性率(22.37％)。

表12.针对PRV的临床检测结果比较

结果表明(表13)：在猪圆环病毒2型的60个血清样本中，使用常规的针对PCV2的PCR检测发现18个阳性样本和42个阴性样本，而使用针对PCV2的磁纳米微粒可视化诊断方法发现19个阳性样本和41个阴性样本。针对PCV2的磁纳米微粒可视化诊断方法的阳性率(31.7％)高于PCR检测的阳性率(30％)。

表13.针对PCV2的临床检测结果比较

结果表明(表14)：在猪瘟病毒的83个血清样本中，使用常规的针对CSFV的PCR检测发现23个阳性样本和60个阴性样本，而使用针对CSFV的磁纳米微粒可视化诊断方法发现30个阳性样本和53个阴性样本。针对CSFV的磁纳米微粒可视化诊断方法的阳性率(36.14％)高于PCR检测的阳性率(27.70％)。

表14.针对CSFV的临床检测结果比较

结果表明(表15)：在猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的79个血清样本中，使用常规的针对PRRSV的PCR检测发现25个阳性样本和54个阴性样本，而使用针对PRRSV的磁纳米微粒可视化诊断方法发现28个阳性样本和51个阴性样本。针对PRSV的磁纳米微粒可视化诊断方法的阳性率(35.40％)高于PCR检测的阳性率(31.60％)。

表15.针对PRRSV的临床检测结果比较

结果表明(表16)：在猪流行性腹泻病毒的68个粪便样本中，使用常规的针对PEDV的PCR检测发现23个阳性样本和45个阴性样本，而使用针对PEDV的磁纳米微粒可视化诊断方法发现27个阳性样本和41个阴性样本。针对PEDV的磁纳米微粒可视化诊断方法的阳性率(39.70％)高于PCR检测的阳性率(33.80％)。

表16.针对PEDV的临床检测结果比较

结果表明(表17)：在猪传染性胃肠炎病毒的82个粪便样本中，使用常规的针对TGEV的PCR检测发现27个阳性样本和55个阴性样本，而使用针对TGEV的磁纳米微粒可视化诊断方法发现29个阳性样本和53个阴性样本。针对TGEV的磁纳米微粒可视化诊断方法的阳性率(35.40％)高于PCR检测的阳性率(32.90％)。

表17.针对TGEV的临床检测结果比较

根据上述临床样本分析，针对已经具有临床症状的临床期样本和常规PCR检测为阳性的临床阶段样本，通过7种病原的Real-time PCR检测和本发明中所建立磁纳米微粒可视化诊断方法分别检测，结果完全一致，说明本发明中所建立的分别针对7种病原的磁纳米微粒可视化诊断方法对临床样本的检验具有准确性。

本发明进一步试验验证了磁纳米微粒可视化诊断方法检测准确性，将该方法和常规PCR检测平行比对后，针对临床前期样本检出结果不一致的问题，在试验中对两种方法检测不一致的临床前期样品(磁纳米微粒可视化诊断方法检测为阳性，常规PCR检测为阴性的样品)进行了两次重复检测，检测结果分别与第一次试验结果一致。为确诊，在试验后期对这些样品进行病原的分离鉴定，结果均为阳性，与磁纳米微粒可视化诊断方法检测结果一致。

本发明具体具有以下特点：

1)检测时间短：从样品核酸的释放到完成结果判断，整个检测流程在4h以内完成，大幅度提高检测速度。

2)特异性好：采用的核酸分子探针，针对不同猪常见病原的复制酶高度保守区域设计，对病原具有高度特异性，且分步纯化，避免纳米微粒、未结合杂质等假阳性问题的影响。

3)结果直观：该方法将磁珠富集核酸、纳米金放大核酸信号和酶促可视化反应结合，检测结果清晰明显，可用肉眼直接观察样品存在待检病原与否。

4)检测结果准确：该方法与普通PCR相比有更高的检出率，经多次验证，与病毒分离检测结果一致。

5)仪器设备需求简单，只需水浴锅、磁力架即可完成检测，不需要离心机、PCR仪等实验室仪器。

6)操作简单：稍具分子生物学基础的人员即可完成操作。

7)对人身和环境更加安全：检测过程中不涉及EB等有毒试剂，具有良好的应用前景。

总之，本发明提供了一种实用的可在感染现场进行快速准确病原检测的诊断试剂盒和方法，实现了血清或粪便样品中病原核酸的释放、核酸信号富集和放大以及可视化转化，样品与功能化磁性微粒、功能化纳米材料颗粒可以直接进行杂交反应，完全省略了样品核酸的提取步骤，提高了病原诊断检测特异性和敏感性，为家畜(例如，猪)主要疫病的临床前期筛查提供了一套准确、直观、方便可行的现场诊断技术。

<110> 西北农林科技大学

<120> 猪病毒性疾病的磁纳米微粒可视化病原检测试剂盒

<160> 22

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 通用探针

<400> 1

tttttttttt tttttcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtg 45

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> PRV富集探针特异性序列

<400> 2

gccaccagga agttgagcga gacga 25

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> PRV杂交探针特异性序列

<400> 3

cgctgcgtgt agacaaagac c 21

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> PCV2富集探针特异性序列

<400> 4

aaggttaagg ttgaattctg gccctgctc 29

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> PCV2杂交探针特异性序列

<400> 5

cccgcagcca tcttggccag atcc 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> PRRSV富集探针特异性序列

<400> 6

ctcactacaa gaaccagaac ccgcc 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> PRRSV杂交探针特异性序列

<400> 7

acccagcata agattcagat gttca 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> CSFV富集探针特异性序列

<400> 8

aactgtcctc ctcataaagg ctcca 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> CSFV杂交探针特异性序列

<400> 9

ccagcctcta cggttccttg gtttc 25

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> PEDV富集探针特异性序列

<400> 10

gcctcagaat agtatgagac ggcttc 26

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> PEDV杂交探针特异性序列

<400> 11

cctgtagata gtagcaagtg gctcagac 28

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> TGEV富集探针特异性序列

<400> 12

actcatcata agaagccaaa caggctttgc at 32

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> TGEV杂交探针特异性序列

<400> 13

gtgtctgcct tgcagtccta gagcac 26

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> PPV富集探针特异性序列

<400> 14

ataggatgcg aggaaagacc agaac 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> PPV杂交探针特异性序列

<400> 15

tagccttgga gccgtggagc gagcc 25

<210> 16

<211> 411

<212> DNA

<213> PRV

<400> 16

cgcgcctccg tcgtctcgct caactttttg gtggcggccg ccgagaacgg ggacgacgcg 60

ctgcgcgccc acgtgacgac caactaccgc gaccggcgca cggccgcgcg cctcgagcgc 120

ttcgcggccg tgctgcgcgc catgatccgg agccacgtgt tcccgcaccg cgcgctgcac 180

gtcctcggag ggctcctggg ccacgtgacg caggaccggc tggccagcgt cacgtgcgtg 240

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gggctccgct tcgtgtacct ggtcttcgtc tacacgcagc gccaccgccg c 411

<210> 17

<211> 385

<212> DNA

<213> PPV

<400> 17

taaagttaga ataggatgcg aggaaagacc agaacataca caaccaataa gagacagaat 60

gttaaacata cacctaacca gaaaactgcc aggtgatttt ggacttttag aagaaactga 120

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<210> 18

<211> 304

<212> DNA

<213> PCV2

<400> 18

gggtgattgg ggagcagggc cagaattcaa ccttaacctt tcttattctg tagtattcaa 60

agggtataga gattttgttg gtcccccctc ccgggggaag aaagtcgtca atattaaatc 120

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<210> 19

<211> 373

<212> DNA

<213> CSFV

<400> 19

gaattatgat tggagccttt atgaggagga cagtttgatg attacacaat tggaaatcct 60

caataatttg ttgatatcag aagaactacc gatggcagta aaaaatataa tggccaggac 120

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<210> 20

<211> 525

<212> DNA

<213> PRRSV

<400> 20

actggtgggt tgaacatctg aatcttatgc tgggtttcca gacggatcca aagaagacaa 60

ccatcacaga ctcaccatca ttcctaggtt gcaggataat aaatgggcgc cagctagtcc 120

ctaaccgtga caggatcctc gcggccctcg cctaccacat gaaggcaagt aatgtttctg 180

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ggaagaagtc cagaatgtgc gggtactgcg gggccccggc tccgtacgcc actgcctgtg 420

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<210> 21

<211> 596

<212> DNA

<213> PEDV

<400> 21

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<210> 22

<211> 394

<212> DNA

<213> TGEV

<400> 22

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gctctaggac tgcaaggcag acacgtattc ctat 394