一种H9N2双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒

文献发布时间：2023-06-19 12:11:54

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种H9N2双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)属于A型流感病毒，主要通过呼吸道和消化道传播，可以感染禽类、哺乳动物甚至人，并且具有高度传染性的急性综合症。

AIV的传统检测方法包括病毒的分离及鉴定，分离AIV的常用方法有鸡胚培养分离法、血清学检测(hemagglutination inhibition，HI)、神经氨酸酶抑制试验(Neuraminidase inhibition，NI)、琼脂糖扩散试验(Agarose diffusion，AGP)和酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)等，其中病毒的分离鉴定诊断比较确切，但耗时较长，操作繁琐，不利于快速检测，HI和NI灵敏度低，而且需要对血清中非特异性物质(红细胞凝集物质和血凝抑制物质)进行预处理，操作过程冗长、耗时；AGP方法结果易判定，但其灵敏度同样偏低，不适于大批量样品的检测；ELISA有较好的特异性与稳定性，但重复性差、会受到自身抗体、嗜异性抗体等干扰，影响检测结果。

荧光定量实时逆转录-聚合酶链反应(Real-time quantitative reversetranscription polymerase chain reactin，RT-PCR)是通过扩增样本中病毒基因组RNA片段进行病毒鉴定，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光基团的信号变化来检测扩增反应中产物量的变化，通过扩增产物的循环阈值和标准曲线对病毒进行测定分析，可区分AIV的亚型。

2013年，我国发生了H7N9感染人事件，6个内部基因全部来自于H9N2 AIV，1999年来发生了多次H9N2亚型AIV感染人的事件，给人类健康带来威胁。建立针对H9亚型的HA基因、N2亚型的NA基因的双重实时荧光RT-PCR方法，可以提高工作效率，但是，目前缺少特异性、稳定性好、灵敏性强的用于检测禽流感病毒H9N2亚型的引物对和探针。

发明内容

本发明的目的之一是提供特异性、稳定性好、灵敏性强的用于检测禽流感病毒H9N2亚型的引物对和探针。

本发明的目的之二是提供包含上述引物对和探针的H9N2双重实时荧光RT-PCR检测试剂盒。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

从NCBI上查找H9N2禽流感病毒株的HA基因序列(MG495074.1，SEQ ID NO.1)、NA基因序列(KY794637.1，SEQ ID NO.2)，利用Primer Epress 3.0.1软件，针对保守区设计特异性引物和TaqMan探针序列，引物序列如下：

本发明的特异性型引物序列见表1：

表1引物和探针

所述H9探针5’端由FAM标记，3’端由BHQ1标记；N2探针5’端由HEX标记，3’端由BHQ1标记。

本发明试剂盒包含：2×BIOG

所述阳性对照为含有HA和NA基因片段的线性质粒，所述阴性对照为PBS。

本发明还涉及一种禽流感病毒H9N2亚型实时荧光RT-PCR检测方法，特征在于，包括如下步骤：

1.提取待检测样品RNA；

2.配制荧光定量PCR反应体系，体系如下：

2×BIOG

上述H9N2双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒的使用方法，实时荧光定量PCR反应条件为：42℃20min，95℃10min，(95℃15s，54℃35s，72℃45s)共40个循环，72℃10min；

3.用10倍梯度稀释的含有H9N2基因片段的线性质粒作为标准品进行实时荧光定量PCR，PCR体系如下：

2×BIOG

本发明进一步对所建立的H9N2双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒的特异性、敏感性和稳定性进行分析，其中：

特异性检测：本发明以H2N3、H4N5、H5N5、H5N6、H7N2、H8N4、H10N3、H1N7、H11N9、H9N9、H3N2、H6N6、H9N6、H9N2 RNA为模板，用本试剂盒进行荧光定量RT-PCR检测。

敏感性检测：构建含有H9基因片段、N2基因片段的pcDNA3.1-HA-NA质粒，质粒用微量核酸定量仪NanoDrop进行定量，取10、10

稳定性检测：在同一次试验中，同一个PCR板中，按照10倍梯度稀释，设置三个稀释梯度，对H9N2禽流感病毒阳性核酸进行双重实时荧光RT-PCR检测，每个样本做三个重复，另外在不同PCR板上重复三次，计算各个稀释度样品的三个重复反应所获得的Ct值的变异系数。

本发明的有益效果是：

提供了一种特异性、稳定性、灵敏性都较好的用于检测禽流感病毒H9N2亚型的检测试剂盒。

附图说明

图1 H9N2基因在FAM、HEX通道的扩增结果

图2 H9N9、H9N6基因在FAM通道的扩增结果

图3 H7N2、H3N2基因HEX通道的扩增结果

图4标准曲线

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1

1.主要试剂

H2N3、H4N5、H5N5、H5N6、H7N2、H8N4、H10N3 RNA由香港大学惠赠，H1N7、H11N9 RNA由美国宾夕法尼亚大学惠赠，H9N9、H3N2、H6N6、H9N6、H9N2 RNA由广西壮族自治区疾病控制中心惠赠，QIAamp Viral RNA提取试剂盒购自德国QIAGEN公司，BIOG

2.主要仪器设备

ABI7300 fast实时荧光PCR仪购自美国Thermo fisher公司，AB104-N电子分析天平购自梅特勒-托利多上海有限公司，Sigma 3K-15高速冷冻离心机购自德国Sigma公司，MilliQ Integral超纯水仪购自美国Milipore公司；

从NCBI上查找HgN2禽流感病毒株的HA基因序列(MG495074.1，SEQ ID NO.1)、NA基因序列(KY794637.1，SEQ ID NO.2)，利用Primer Epress 3.0.1软件，针对保守区设计特异性引物和TaqMan探针序列，引物序列见表1，H9-P荧光发射基团为FAM，N2-P荧光发射基团为HEX，淬灭基团为BHQ-1；

3.根据说明书，配制荧光RT-PCR检测体系，具体配制体系见表2，RT-PCR反应程序见表3；

表2 RT-PCR反应体系

表3 RT-PCR反应程序

结果判定标准为：Ct值≤33，判定为阳性；Ct值≥35，判断为阴性；Ct值在33-35之间为可疑，重复一次，如果Ct值仍在33-35之间，则为阳性，每个样本设置三个重复。

实施例2特异性验证

实验步骤同实施例1，分别以H2N3、H4N5、H5N5、H5N6、H7N2、H8N4、H10N3、H1N7、H11N9、H9N9、H3N2、H6N6、H9N6、H9N2 RNA为模板，利用本试剂盒进行荧光定量RT-PCR扩增。

由图1可知，只有H9N2禽流感病毒核酸在FAM检测通道和HEX检测通道都出现相应的特异性荧光扩增曲线，由图2可知，H9N9、H9N6由于含有H9基因，因此在FAM检测通道出现扩增曲线，而HEX检测通道则无扩增曲线，由图3可知，H7N2、H3N2由于含有N2在HEX检测通道出现扩增曲线，而FAM检测通道则无扩增曲线，其他流感病毒两个荧光通道都无扩增曲线，说明该方法具有很强的特异性。

实施例3灵敏度验证

H9N2禽流感病毒HA基因、NA基因的阳性质粒的构建及鉴定，用针对H9N2禽流感病毒的HA基因、NA基因特异性引物分别进行普通PCR扩增，HA基因引物序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示，NA基因引物序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示，其扩增范围包括荧光定量RT-PCR扩增区域，将HA基因、NA基因PCR反应结束后，混合，加20μl CloningEnhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用Not I、Sma I酶切pcDNA3.1质粒，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coli DH5α，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒扩大培养，抽提质粒，使用BssHII酶切重组质粒，获得线性化质粒DNA，作为构建标准曲线的阳性质粒，命名为pcDNA3.1-H9-N2。

pcDNA3.1-H9-N2阳性质粒用微量核酸定量仪NanoDrop进行定量，取10、10

2×BIOG

实验结果表明，由pcDNA3.1-H9-N2阳性质粒构建的标准曲线的循环阈值(Ct值)与模板浓度Log值具有良好的线性关系，相关系数为0.999，灵敏度为57拷贝/μl。

实施例4稳定性验证

在同一次试验中，同一个PCR板中，按照10×梯度稀释，设置10

从试验结果可得，同一个PCR板中的变异系数在0.15-0.27％之间，不同PCR板的变异系数在0.39-0.49％之间，说明本方法双重RT-PCR检测方法误差小、重复性好，可对H9N2禽流感病毒进行稳定、可靠的检测。

表3 H9N2禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法的批内重复结果

表4 H9N2禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法的批间重复结果

序列表

<110> 广州博识生物科技有限公司

<120> 一种H9N2双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1683

<212> DNA

<213> Influenza A virus

<400> 1

atggaaacag tatcactaat aactatacta ctagtagcaa cagtgagcaa tgcagataaa 60

gtctgcatcg gctatcaatc aacaaactcc acagaaactg tggacacact aacagaaaac 120

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tggttgactc gaaagaacgg cgagtaccct atccaagacg cccaatacac aaataatcaa 540

gggaagaaca ttcctttcat gtggggcata aatcacccac ccaccgatac tacgcagaga 600

gatctgtaca cgagaactga cacaacaacg agtgtggcaa cagaagaaat aaataggatc 660

ttcaaaccat tgataggacc aaggcctctt gtcaacggtt tgatgggaag aattgattat 720

tattggtcgg tattgaaacc aggtcaaaca ctgcgaataa aatctgatgg gaatctaata 780

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gggttccagc actcaaatga ccaaggggtt ggtatggcag cagatagaga ctcaacccaa 1140

aaggcaatta ataaaataac atccaaagtg aataatatag tcgacaaaat gaacgagcaa 1200

tatggaatca ttgatcatga attcagtgag gtagaaacta gacttaacat gatcaataat 1260

aagattgatg atcaaatcca ggatatatgg gcatataatg cagaattgct agttttgctt 1320

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taa 1683

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<212> DNA

<213> Influenza A virus

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<211> 21

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