一株杀鱼假交替单胞菌及其在水产养殖中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株杀鱼假交替单胞菌在鱼虾养殖中的应用

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视 为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

自然环境中存在着多种微生物，有些微生物之间可存在相互作用，其中包括共生、共 栖、寄生、拮抗及捕食等。为了控制病原微生物在环境及生物体内的增殖，可利用微生物之间的拮抗特性，达到控制疾病的目的。目前研究开发防病益生菌产品，替代抗生素，已 经成为了微生物资源开发利用的研究热点与重要方向。

近年来，随着国内经济的发展，人民生活水平得到了快速的提高，人们对水产品的需 求量逐年增大。庞大的市场需求及有限的水产养殖面积共同作用，导致了鱼虾养殖密度逐 年增大，由此带来了养殖水环境逐渐恶化，养殖鱼、虾、贝、参病害增多，给养殖业带来了巨大的损失。据统计，已发现的水产养殖病害种类高达200余种，病原包括病毒、细菌、 真菌、寄生虫等。其中因细菌性疾病导致的经济损失占所有病害损失的50％以上，病原菌 可导致鱼类败血症、烂鳃、肠炎等；虾类患烂鳃病、肠炎、急性肝胰腺坏死综合症；贝类 脓包病、海参腐皮症等。为了防治养殖鱼、虾、贝、参细菌病，传统的方法是使用抗菌药 物，但由于长期使用抗生素后，会导致病原菌抗药性及药物残留，降低养殖鱼虾的抵抗力、 破坏养殖环境及微生态平衡等问题，水产养殖中迫切需要一种安全有效的细菌病防控和增 强免疫技术来替代抗生素的应用。

研究发现自然环境中某些微生物能够分泌具有抗菌活性的生物碱、聚酮类化合物和多 肽类化合物，该类物质具有良好的抗菌杀菌效果。在水产养殖中，利用微生物防控技术， 通过直接或间接的作用，能够有效防控多种水产养殖动物疾病，如在养殖池中投放地衣芽 孢杆菌，可调节水质、提高鱼虾贝参肠道功能，降低养殖动物的发病率，提高生长速度。 应用光合细菌能够降低水体中的氨氮、硫化氢等有害物质，改善水产养殖动物的养殖环境， 增强鱼虾、贝、参的抗病力。用乳酸杆菌发酵鱼虾饲料，能够提高饲料的利用率，改善养 殖动物肠道菌群结构，减少病原菌的定殖；但发明人发现，利用病原拮抗菌控制水产养殖 动物细菌病的应用技术报道不多，而且现有的菌株一般功能比较单一，难以实现拮抗病原 菌和免疫功能、促肠道功能的协同作用，使得现有的微生物防控水产养殖中细菌性疾病技 术难以高效施用。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供一株杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)及其在水产养殖中的应用，该菌株具有广谱抗弧菌活性，同时对杀鲑气单胞菌 (Aeromonas salmonicida)具有强的拮抗活性，口服后还可增强鱼类溶菌酶、肿瘤坏死因子 及细胞白介素基因的表达，能显著提高水产养殖动物体液的免疫水平，另外，该菌株还能 够显著提高水产养殖动物肠道微绒毛的长度，对肌肉厚度及绒毛的长度有增大的趋势，有 利于提升水产养殖动物的肠道功能，实现拮抗病原菌、免疫、促肠道功能的协同作用，更 有效地进行水产养殖中细菌病的防控。

为实现上述目的，本发明涉及以下技术方案：

本发明第一方面提供一株杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)2013082515， 该菌株已于2020年11月12日期在武汉的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO:M 2020731。

杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)2013082515菌株分离自健康凡纳滨 对虾养殖池，经注射及投喂凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、中国对虾(Penaeus chinensis)、 牙鲆(Paralichthys olivaceus)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、长牡蛎(Crassostrea gigas)、 海参(Stichopus japonicus)，进行生物安全性评价，证实该菌株生物安全性良好，无致病 性。

菌落特征：在2216E平板上，菌落圆形，凸起，呈黄色、表面较湿润光滑，该菌在TCBS培养基上不生长。

细胞特征：革兰氏染色阴性，短杆状，两端钝圆，无芽孢，大小为0.4～0.7μm×1.5～ 2.0μm，成熟期的细胞，细胞壁上有分泌的小囊泡。

本发明第二方面提供一种微生物制剂，所述微生物制剂包含上述杀鱼假交替单胞菌 2013082515和/或杀鱼假交替单胞菌2013082515的代谢物。

本发明第三方面提供上述杀鱼假交替单胞菌2013082515和/或微生物制剂在水产养殖中 的应用。

本发明第四方面提供一种水产养殖功能饲料，其特征在于，其饲料配方含有上述杀鱼 假交替单胞菌2013082515和/或杀鱼假交替单胞菌2013082515的代谢物。

本发明的一个或多个实施方式至少具有以下有益效果：

本发明所提供的杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)2013082515菌株，具 有广谱抗弧菌活性，同时对杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)具有强的拮抗活性，活 性物质既在胞内也在胞外中存在。可通过泼洒于水产养殖动物(鱼虾贝参)的养殖水体或 通过口服途径使用，应用后能够显著降低养殖动物养殖环境及体能的弧菌及杀鲑气单胞菌 病原数量，达到防控病原菌病的效果，口服后还可增强鱼类溶菌酶、肿瘤坏死因子及细胞 白介素基因的表达；另外，该菌株还能够显著提高水产养殖动物肠道微绒毛的长度，对肌 肉厚度及绒毛的长度有增大的趋势，有利于提升水产养殖动物的肠道功能，实现拮抗病原 菌、免疫和促肠道功能的协同作用，更有效地进行水产养殖中细菌病的防控。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性 实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为杀鱼假交替单胞菌2013082515的形态图；

图2为实施例一中各组对虾的相对保护率；

图3为实施例二中各组牙鲆的相对保护率(注：图中相同的字母代表差异不显著，不同 的字母代表差异显著)；

图4为实施例二中牙鲆免疫相关基因的表达情况；

图5为实施例四中杀鱼假交替单胞菌2013082515胞内外物质抑菌效果；

图6为实施例四中相同抗菌效果时杀鱼假交替单胞菌2013082515的细菌数与新霉素量 的对应关系曲线；

图7为实施例五中杀鱼假交替单胞菌2013082515对多种弧菌的拮抗效果图(图中a、b、 c、d、e、f、g、h、i、j分别代表杀鱼假交替单胞菌2013082515对鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、魔鬼弧菌、坎氏弧菌、需钠弧菌、巴西弧菌和轮虫弧菌 的抑菌效果)；

图8为实施例五中杀鱼假交替单胞菌2013082515抗杀鲑气单胞菌效果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有 指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理 解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本 发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也 意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括” 时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中利用病原拮抗菌控制水产养殖动物细菌病的应用 技术报道不多，而且菌株一般功能比较单一，难以实现拮抗病原菌和免疫功能、促肠道功 能的协同进行，使得现有的微生物防控水产养殖中细菌性疾病技术难以高效施用。

为了解决如上的技术问题，本发明第一方面提出了一株杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)2013082515该菌株已于2020年11月12日期在武汉的中国典型 培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO:M 2020731。

菌落特征：在2216E平板上，菌落圆形，凸起，呈黄色、表面较湿润光滑，该菌在TCBS培养基上不生长。

细胞特征：革兰氏染色阴性，短杆状，两端钝圆，无芽孢，大小为0.4～0.7μm×1.5～ 2.0μm，成熟期的细胞，细胞壁上有分泌的小囊泡。

本发明第二方面提供一种微生物制剂，所述微生物制剂包含上述杀鱼假交替单胞菌 2013082515和/或杀鱼假交替单胞菌2013082515的代谢物。

本发明第三方面提供上述杀鱼假交替单胞菌2013082515和/或微生物制剂在水产养殖中 的应用。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述应用方法为：直接添加到水产养殖的水环境 中或添加到水产养殖的饲料中。

在本发明的一个或多个实施方式中，杀鱼假交替单胞菌2013082515在水环境中的有效 使用浓度为10

在本发明的一个或多个实施方式中，所述应用具体包括：

(1)制备用于提高水产动物免疫力的制剂；

(2)制备拮抗病原菌的制剂；

(3)制备提升水产动物肠道功能的制剂。

优选的，所述病原菌为杀鲑气单胞菌和/或弧菌。

优选的，所述弧菌为鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、魔鬼弧菌、坎氏弧菌、需钠弧菌、巴西弧菌、轮虫弧菌中的一种或多种。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述提高水产动物免疫力的制剂具体表现为：

(1)促产溶菌化合物；

(2)提高肿瘤坏死因子及细胞白介素基因的表达；

(3)提高水产养殖动物肠道微绒毛的长度，对肌肉厚度及绒毛的长度有增大的趋势。

本发明第四方面提供一种水产养殖功能饲料，其特征在于，其饲料配方含有上述杀鱼 假交替单胞菌2013082515和/或杀鱼假交替单胞菌2013082515的代谢物。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的 实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例一

应用杀鱼假交替单胞菌2013082515于对虾养殖的效果研究

1.材料方法

1.1杀鱼假交替单胞菌2013082515制剂制备

取-80℃保藏的杀鱼假交替单胞菌2013082515菌种，划线于2216E固体培养基，在28℃ 培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于杀鱼假交替单胞菌种子培养液中，28℃摇瓶培养24h 获得种子液，再把种子液接种于杀鱼假交替单胞菌发酵培养基中发酵培养24h，进行有氧发 酵，温度控制在28℃；当发酵液OD600值达到1.5～1.7时，终止发酵，获得发酵菌液，采 用平板计数确定发酵液的菌株浓度。

杀鱼假交替单胞菌2013082515菌株的16S rDNA碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

SEQ ID NO：1：

AGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTC ACCGCAACATTCTGATTTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGA CTCCAATCCGGACTACGACAGGCTTTAAGGGATTCGCTCACTATCGCTAGCTCGCTGCTC TCTGTACCTGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACACGTAAGGGCCATGATGACTTGAC GTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTTCCCGACCGAATC GCTGGCAACTAAGGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACAAC ACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTATCAGAGCTCCCGAAGGCACCAAACCAT CTCTGGTAAGTTCTCTGTATGTCAAGTGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAA ACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGG CCGTACTCCCCAGGCGGTCTACTTAATGCGTTAGCTTTGGAAAAGTTGTCCGAAGACCCCAGCTCCTAGTAGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTC CCCACGCTTTCGTACATGAGCGTCAGTGTTGACCCAGGTGGCTGCCTTCGCCATCGGTAT TCCTTCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGAAATTCTACCACCCTCTATCACACT CTAGTTTGCCAGTTCGAAATGCAGTTCCCAGGTTAAGCCCGGGGCTTTCACATCTCGCTT AACAAACCGCCTGCGTACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTCGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGTCAGTAACGTCACAGC TAGCAGGTATTAACTACTAACCTTTCCTCCTGACTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCC TTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACT GCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCA AACCAGCTAGGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCTTTACCTCACCAACTAGCTAATCCCACTTGGGCCAATCTAAAGGCGAGAGCCGAAGCCCCCTTTGGTCCGTAGACATTATGCGGTATT AGCCATCGTTTCCAATGGTTGTCCCCCACCTCAAGGCATGTTCCCAAGCATTACTCACCC GTCCGCCGCTCGTCATCTTCTAGCAAGCTAGAAATGTTACCGCTCGAC。

杀鱼假交替单胞菌2013082515的理化特征见下表1：

表1.杀鱼假交替单胞菌2013082515的理化特征

+:阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性反应

杀鱼假交替单胞菌2013082515的全菌脂肪酸组成见表2.

表2

1.2实验对虾

实验用凡纳滨对虾体长6～7cm，购于某对虾养殖公司，实验前经实验室暂养7d后用于 实验。

1.3杀鱼假交替单胞菌2013082515在养殖水体及养殖饲料中的添加剂量

根据表3的设计浓度，向养殖对虾的水体及饲料中添加杀鱼假交替单胞菌2013082515， 水体添加的次数每3d添加一次，饲料添加的方法是每天预制新鲜含菌饲料。实验设置空白 对照组，对照组中的水体及饲料中均不添加杀鱼假交替单胞菌2013082515，每个组设置3 个平行。

表3

1.4实验养殖管理

实验虾暂养于水泥池中，稳定1周后用于实验，实验共进行30d。实验各组对虾养殖于 50L的水族箱中，连续充气，水温控制在28～30℃、盐度25、pH 7.5～7.6,日投喂3次，投饵量为体重的3％，日换水量30％。

1.5水体及对虾肠道中弧菌的检测方法

采用TCBS平板涂布方法，检测水体中弧菌总数及对虾肠道中的弧菌总数

1.6对虾的抗弧菌感染力

实验结束后，取各组对虾10尾，用浓度5×10

2.结果

2.1养殖对虾的存活率

实验对虾养殖30d后，统计各组对虾的存活率，结果见表4。可知在水体及饲料中，添 加杀鱼假交替单胞菌2013082515，均能够显著提高对虾的存活率，在水体及饲料中添加该 菌，对提高对虾存活率效果差异不显著。

表4

注：表中相同的字母代表差异不显著，不同的字母代表差异显著。

2.2养殖水体及对虾体内弧菌总数

实验对虾养殖30d后，统计各组养殖水体及对虾肠道内的弧菌总数，结果见表5。可以 看出在水体中添加杀鱼假交替单胞菌2013082515，能够显著降低对虾养殖环境及对虾肠道 中的弧菌数量，在饲料中添加该菌，能够显著降低对虾肠道中的弧菌数量，高浓度添加组 也能够降低水体中的弧菌密度。

表5

注：表中相同的字母代表差异不显著，不同的字母代表差异显著。

2.3对虾的抗弧菌感染力测试

实验对虾养殖30d后，取各组的对虾10尾，采用5×10

实施例二：

杀鱼假交替单胞菌2013082515对牙鲆养殖的效果研究

1.材料方法

1.1杀鱼假交替单胞菌2013082515制剂制备

取-80℃保藏的杀鱼假交替单胞菌2013082515菌种，划线于2216E固体培养基，在28℃ 培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于杀鱼假交替单胞菌种子培养液中，28℃摇瓶培养24h 获得种子液，再把种子液接种于杀鱼假交替单胞菌发酵培养基中发酵培养24h，进行有氧发 酵，温度控制在28℃；当发酵液OD600值达到1.5～1.7时，终止发酵，获得发酵菌液，采 用平板计数确定发酵液的菌株浓度。

1.2实验牙鲆

实验用牙鲆体长12～14cm，购于某牙鲆养殖企业，实验前经实验室暂养10d后用于实 验。

1.3杀鱼假交替单胞菌2013082515在牙鲆养殖水体及养殖饲料中的添加剂量

根据表6的设计浓度，向养殖牙鲆的水体及饲料中添加杀鱼假交替单胞菌2013082515， 水体添加的次数每3d添加一次，饲料添加的方法是每天预制新鲜含菌饲料。实验设置空白 对照组，对照组中的水体及饲料中均不添加杀鱼假交替单胞菌2013082515，每个组设置3 个平行。

表6

1.4实验养殖管理

实验各组牙鲆养殖于100L的水族箱中，连续充气，水温控制在22℃～25℃、盐度25、 pH 7.5～7.6,日投喂3次，投饵量为体重的2％，日换水量30％。实验共进行30d。

1.5水体及牙鲆肠道中弧菌的检测方法

采用TCBS平板涂布方法，检测水体中弧菌总数及牙鲆肠道中的弧菌总数。

1.6牙鲆的抗杀鲑气单胞菌感染力测试

实验结束后，取各组牙鲆15尾，用浓度5×10

1.7牙鲆的溶菌酶(LZM)、细胞白介素(IL-1β)及肿瘤坏死因子(TNF-α)基因表达量

实验结束后，取各组牙鲆3尾，分离其中肾，取等量组织测定其溶菌酶、细胞白介素及 肿瘤坏死因子3种免疫相关基因表达量，评价杀鱼假交替单胞菌2013082515对牙鲆肠道免 疫功能的影响。

1.8杀鱼假交替单胞菌2013082515对牙鲆肠道肌肉层厚度、绒毛高度、杯细胞数量及微绒 毛高度影响

实验结束后，取各组牙鲆3尾，分离其中肠进行组织固定及切片，HE染色后进行显微 观察，测定其肠肌肉厚度、绒毛及微绒毛长度，评价杀鱼假交替单胞菌2013082515对牙鲆 肠道的功能影响。

2.结果

2.1养殖牙鲆的存活率

实验牙鲆养殖30d后，统计各组牙鲆的存活率，结果见表7。可知各组牙鲆在养殖过程 中均具有较高的存活率，组间的养殖存活率差异不显著。

表7

注：表中相同的字母代表差异不显著。

2.2养殖水体及对牙鲆肠道内弧菌总数

实验牙鲆养殖30d后，分析各组养殖水体及牙鲆肠道内的弧菌总数，结果见表8。可以 看出在水体中添加杀鱼假交替单胞菌2013082515，能够显著降低牙鲆养殖水环境及肠道中 的弧菌数量，在饲料中添加该菌，5×10

表8

注：表中相同的字母代表差异不显著，不同的字母代表差异显著。

2.3添加杀鱼假交替单胞菌2013082515对牙鲆的抗杀鲑气单胞菌感染力影响

实验牙鲆养殖30d后，取各组的牙鲆15尾，采用5×10

2.4添加杀鱼假交替单胞菌2013082515对牙鲆免疫相关基因的影响

实验牙鲆养殖30d后，分析各组牙鲆肾脏的免疫相关基因表达，结果见图4所示。可以 看出无论在水体中还是在饲料中添加杀鱼假交替单胞菌2013082515，能够显著提高牙鲆溶 菌酶、细胞白介素及肿瘤坏死因子的基因表达水平。其中饲料中添加的2个组，溶菌酶的 相对表达量高水体中添加组，水体中添加浓度为5×10

2.5添加杀鱼假交替单胞菌2013082515对牙鲆的肠粘膜影响

实验牙鲆养殖30d后，分析各组牙鲆中肠的肌肉厚度、绒毛及微绒毛高度值，结果见 表9所示。可以看出无论在水体中还是在饲料中添加杀鱼假交替单胞菌2013082515，能够 显著提高牙鲆肠道微绒毛的长度，对肌肉厚度及绒毛的长度有增大的趋势，但与对照差异 不明显。表明杀鱼假交替单胞菌2013082515应用后能够提高牙鲆的肠道功能。

表9

注：表中同一列的中相同的字母代表差异不显著，不同的字母代表差异显著 实施例三：

应用杀鱼假交替单胞菌2013082515于海湾扇贝育苗的效果研究

1.材料方法

1.1杀鱼假交替单胞菌2013082515制剂制备

取-80℃保藏的杀鱼假交替单胞菌2013082515菌种，划线于2216E固体培养基，在28℃ 培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于杀鱼假交替单胞菌种子培养液中，28℃摇瓶培养24h 获得种子液，再把种子液接种于杀鱼假交替单胞菌发酵培养基中发酵培养24h，进行有氧发 酵，温度控制在28℃；当发酵液OD600值达到1.5～1.7时，终止发酵，获得发酵菌液，采 用平板计数确定发酵液的菌株浓度。

1.2实验用海湾扇贝幼体

实验用海湾扇贝幼体为D型幼虫。

1.3杀鱼假交替单胞菌2013082515在海湾扇贝幼体培育水体中的添加剂量

根据表10的设计浓度，向养殖海湾扇贝幼体培育水体中添加杀鱼假交替单胞菌2013082515，每天添加一次。实验设置空白对照组，对照组中的水体及饲料中均不添加杀鱼假交替单胞菌2013082515，每个组设置3个平行。

表10

1.4实验养殖管理

各组海湾扇贝幼体培育池为数个体积2m×2m×1.2m的水泥池，培养水温22～23℃，光照 500-800Lux，培养过程中根据实际生产，投喂等鞭金藻，密度控制在5～10×10

1.5水体中弧菌的检测方法

采用TCBS平板涂布方法，检测水体中弧菌总数及幼体中的弧菌总数

1.6海湾扇贝幼体变态成活率

实验结束后，统计各池中眼点幼虫的密度，计算海湾扇贝幼体变态成活率

2.结果

2.1海湾扇贝育苗水体中弧菌总数

幼体培养11d后，分析各组育苗水体及扇贝幼体内的弧菌总数，结果见表11。可以看 出在扇贝幼体育苗水体中添加杀鱼假交替单胞菌2013082515，能够显著降低水环境及扇贝 幼体内的弧菌数量。且随着添加量的增大，水体中弧菌的密度有降低的趋势，差异显著性 分析显示，各实验组的弧菌密度均低于空白对照组，而添加浓度5×10

表11

注：表中相同的字母代表差异不显著，不同的字母代表差异显著。

2.2海湾扇贝幼体变态成活率

海湾扇贝幼体从D型幼体经11d培育后至眼点幼体，统计各组的幼体变态成活率，结 果见表12。可知不同组中，随着杀鱼假交替单胞菌2013082515的添加量增大，幼体成活率 有增大的趋势，差异显著性分析显示，各实验组的成活率均高于空白对照组，而添加浓度5×10

表12

注：表中相同的字母代表差异不显著。

实施例四

杀鱼假交替单胞菌2013082515胞内及胞外抗菌物抗菌活性的测定

1.材料方法

1.1.胞外活性物质的制备

采用玻璃纸覆盖平板法制备杀鱼假交替单胞菌2013082515的胞外产物，将杀鱼假交替 单胞菌2013082515接种于2216E斜面上，28℃培养过夜后，转接于2216E液体培养基中， 28℃培养18h后，取0.1mL杀鱼假交替单胞菌2013082515菌悬液均匀涂布于表面覆盖有无菌玻璃纸的平板上，28℃恒温培养36h后，取出玻璃纸用PBS缓冲液将玻璃纸上的菌苔 洗下来，收集于1.5mL离心管中制成菌悬液，测其浓度1.3×10

1.2胞内活性物质的制备

取本实施例1.1离心后获得的菌体，用PBS缓冲洗涤2次后，加10mL PBS缓冲液重悬，使其终浓度为2×10

1.3杀鱼假交替单胞菌2013082515胞内外抗菌物抗菌活性定性测试

取100μL鳗弧菌菌悬液(浓度为10

准确称取新霉素(购于sigma)0.1g溶于1mL PBS缓冲液中，配制成1×10

2.结果

2.1杀鱼假交替单胞菌2013082515胞内外物质抑菌效果

杀鱼假交替单胞菌2515经培养36h之后，用新霉素做药物测其胞内外抗菌物质对鳗弧 菌的拮抗效果见图5。可知杀鱼假交替单胞菌2013082515胞内和胞外均含有抑菌物质，对 鳗弧菌具有极强的抑菌效果。

注：图中1～4分别代表代表杀鱼假交替单胞菌2013082515胞内物质、胞外物质、新霉素 及PBS的抑菌活性。

2.2杀鱼假交替单胞菌2013082515抗菌效能

以新霉素为参比用抗生素，用于定量评价杀鱼假交替单胞菌2013082515的抗菌活性。 通过设置不同浓度的新霉素测定其对鳗弧菌的抑菌大小，得新霉素的质量数与抑菌圈大小 的关系为y＝0.1071x+0.6818(y为新霉素质量对数值，x为抑菌圈直径，R2＝0.9917)。分析不同浓度杀鱼假交替单胞菌2013082515胞内外抗菌物质的抑菌圈大小，得杀鱼假交替单胞菌2013082515的细菌数与新霉素量的对应关系曲线如图6所示，由图6可以推算相同抗菌效果时杀鱼假交替单胞菌2013082515数量与新霉素质量对应关系。可知，杀鱼假交替单胞菌2013082515的胞内外抗菌物质的活性极强，可替代新霉素药物使用。

实施例五

杀鱼假交替单胞菌2013082515抗多种弧菌及杀鲑气单胞菌效果测定

1.材料与方法

采用滤纸片法测定拮抗菌的抑菌效果，具体步骤包括：用无菌镊子分别在涂布鳗弧菌、 哈维氏弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、魔鬼弧菌、坎氏弧菌、需钠弧菌、巴西弧 菌、轮虫弧菌及杀鲑气单胞菌的平板上等距离放置4片直径6mm的无菌滤纸片，向2片滤纸片 上分别加入5μL的拮抗菌发酵液(浓度为2.5×10

2.结果

2.1杀鱼假交替单胞菌2013082515对10种弧菌及杀鲑气单胞菌的拮抗效果

测试杀鱼假交替单胞菌2013082515对鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶 藻弧菌、魔鬼弧菌、坎氏弧菌、需钠弧菌、巴西弧菌和轮虫弧菌的抑菌效果，抗菌效果见图7。 测试杀鱼假交替单胞菌2013082515对杀鲑气单胞菌的抑菌效果，抗菌效果见图8。结果显示 杀鱼假交替单胞菌2013082515对10种弧菌及杀鲑气单胞菌均具有一定的拮抗效果。对其抑菌 圈大小进行统计，结果见表13，可知杀鱼假交替单胞菌2013082515对多种弧菌及杀鲑气单胞 菌均具有极强的拮抗效果。

表13

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> 一株杀鱼假交替单胞菌及其在水产养殖中的应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1359

<212> DNA

<213> 杀鱼假交替单胞菌2013082515菌株的16S rDNA碱基序列

<400> 1

agcaacccac tcccatggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg 60

caacattctg atttgcgatt actagcgatt ccgacttcat ggagtcgagt tgcagactcc 120

aatccggact acgacaggct ttaagggatt cgctcactat cgctagctcg ctgctctctg 180

tacctgccat tgtagcacgt gtgtagccct acacgtaagg gccatgatga cttgacgtcg 240

tccccacctt cctccggttt atcaccggca gtctccttag agttcccgac cgaatcgctg 300

gcaactaagg ataggggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acaacacgag 360

ctgacgacag ccatgcagca cctgtatcag agctcccgaa ggcaccaaac catctctggt 420

aagttctctg tatgtcaagt gtaggtaagg ttcttcgcgt tgcatcgaat taaaccacat 480

gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcatttgagt tttaaccttg cggccgtact 540

ccccaggcgg tctacttaat gcgttagctt tggaaaagtt gtccgaagac cccagctcct 600

agtagacatc gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct 660

ttcgtacatg agcgtcagtg ttgacccagg tggctgcctt cgccatcggt attccttcag 720

atctctacgc atttcaccgc tacacctgaa attctaccac cctctatcac actctagttt 780

gccagttcga aatgcagttc ccaggttaag cccggggctt tcacatctcg cttaacaaac 840

cgcctgcgta cgctttacgc ccagtaattc cgattaacgc tcgcaccctc cgtattaccg 900

cggctgctgg cacggagtta gccggtgctt cttctgtcag taacgtcaca gctagcaggt 960

attaactact aacctttcct cctgactgaa agtgctttac aacccgaagg ccttcttcac 1020

acacgcggca tggctgcatc aggcttgcgc ccattgtgca atattcccca ctgctgcctc 1080

ccgtaggagt ctggaccgtg tctcagttcc agtgtggctg atcatcctct caaaccagct 1140

agggatcgtc gccttggtga gcctttacct caccaactag ctaatcccac ttgggccaat 1200

ctaaaggcga gagccgaagc cccctttggt ccgtagacat tatgcggtat tagccatcgt 1260

ttccaatggt tgtcccccac ctcaaggcat gttcccaagc attactcacc cgtccgccgc 1320

tcgtcatctt ctagcaagct agaaatgtta ccgctcgac 1359