一种聚硫化氢荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于化学及分析检测领域，具体涉及一种基于聚集诱导发光和分子内质子转移双重机理的聚硫化氢荧光探针及其制备方法和用途。

背景技术

硫化氢(Hydrogen sulfide，H

荧光探针具有快捷、灵敏、，更适合无创可视化检测的优势，在生物传感、光学材料及生物检测和识别等领域得到了广泛的应用。然而，有机荧光染料易于在水性介质中聚集，只能以痕量使用(通常以nM含量使用)，易光漂白，荧光背景增加，并出现随机染色现象，其发光能力降低，产生聚集诱导猝灭(ACQ)。

聚集诱导发光(Aggregation-induced emission，AIE)荧光团在水性介质中聚集发光，可以有效避免常见荧光团的聚集诱导猝灭现象，稳定性好，荧光背景干扰低，抗光漂白。因此，基于AIE的荧光探针具有较好的应用价值和开发前景。

目前已开发了许多用于检测聚硫化氢的荧光探针，但是在实际应用中面临着一些问题，如染料高浓度下易聚集从而淬灭荧光，易被光漂白，生物相容性不好，不能大量使用等，仍需要进一步开发选择性好、灵敏度高，适于生物成像的荧光探针。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种聚硫化氢荧光探针，该探针能够定量的检测生物体内聚硫化氢，具有检测限低(9nM)，荧光响应倍数高(75倍)，灵敏度高，选择性好，较大斯托克斯位移(254nm)的优势。在PBS缓冲液，荧光强度与Na

本发明的另一目的是提供一种上述聚硫化氢荧光探针的制备方法。

本发明的又一发明目的是提供上述聚硫化氢荧光探针在聚硫化氢检测中的应用。

本发明的技术方案如下：

一种聚硫化氢荧光探针，其探针的结构式如下所示：

本发明提供的聚硫化氢荧光探针AIE-PS2设计思路如下：(1)荧光母核：以具有大斯托克斯位移的AIE荧光团(TPE-HBT)为荧光母核。斯托克斯位移较小不仅会引起荧光淬灭，而且激发光和散射光会严重影响检测的准确性。目前，已报道的聚硫化氢荧光探针的斯托克斯位移最大为215nm。本发明的探针AIE-PS2斯托克斯位移可达254nm，有效地避免了因斯托克斯位移小造成的荧光淬灭和灵敏度降低的问题；(2)识别基团：以2-氟-5-硝基苯甲酸酯为聚硫化氢识别基团。这是由于2-氟-5-硝基苯甲酸酯具有亲核性和亲电性，可有效地与H

荧光探针AIE-PS2识别H

为了验证探针AIE-PS2与聚硫化氢的反应原理：将AIE-PS2与四硫化二钠在37℃的条件下于PBS缓冲液中孵育100min。结果显示，AIE-PS2与四硫化二钠反应产生黄色荧光物质，经

本发明提供的聚硫化氢荧光探针AIE-PS2基于AIE与ESIPT双重机理，可协同作用于荧光染料。AIE特性可以通过形成聚集体来促进ESIPT的发射，有利于诱发ESIPT，产生较大的斯托克斯位移，特别是在高极性或氢键供体溶剂中。ESIPT特性可以通过形成分子内氢键来促进分子内运动受限，增强AIE发射。与基于单个AIE或ESIPT机理的荧光探针相比，本发明提供的聚硫化氢荧光探针AIE-PS2具有更加显著的优势：(1)避免了亲水性修饰。常用的亲水性策略是将离子结构引入探针以增强其水溶性，但是高浓度下离子染料结构的电荷可能影响膜电位，扰乱细胞内生理环境。基于AIE与ESIPT双重机理的荧光探针一方面减少了繁琐的合成步骤，另一方面避免了对细胞正常生理环境的干扰，更安全；(2)具有大斯托克斯位移。斯托克斯位移小会造成荧光猝灭，光散射增加，从而影响定量检测；(3)在高浓度下无自淬灭。AIE荧光团克服了ACQ现象，具有更高的光稳定性，有利于生物成像。

识别聚硫化氢的荧光探针AIE-PS2的合成路线如下：

识别聚硫化氢的荧光探针AIE-PS2，包括以下步骤：

第一步：在三氟乙酸存在的条件下，化合物TPE-OH和六亚甲基四胺进行回流反应，制备化合物TPE-CHO；

第二步：在H

第三步：在三乙胺存在的条件下，化合物TPE-HBT和化合物2进行化学反应，制备荧光探针AIE-PS2。

在一种优选方案中，在第一步中，化合物TPE-OH和六亚甲基四胺的摩尔比为1:5～15，在不影响本发明效果的情况下，可以进一步优选为1:10。

在一种更优选方案中，化合物TPE-OH和三氟乙酸的质量体积比为1:50～70g/mL，例如，化合物TPE-OH和三氟乙酸的质量体积比为1:60g/mL。

进一步地，反应时间为2～10h，可以再优选为3～6h，例如4h。

对于本发明而言，在第二步中，本发明采用化合物TPE-CHO和化合物1进行反应，制备化合物TPE-HBT，在一种优选方案中，化合物TPE-CHO和化合物1的摩尔比为1:2.5～4.5，进一步优选为1:3.5。其中，化合物1为2-氨基苯硫醇。

进一步地，在反应的过程中，在H

在一种优选方案中，反应时间为20～40℃，该温度范围即通常理解的室温。

进一步地，反应时间为2～10h，可以再优选为3～6h，例如4h。

在第三步中，在三乙胺存在的条件下，化合物TPE-HBT和化合物2进行化学反应，制备荧光探针AIE-PS2，在一种优选方案中，化合物TPE-HBT和化合物2的摩尔比为1:1.5～4.5，进一步优选为1:2.5。

其中，化合物2为2-氟-5-硝基苯甲酰氯，可以由2-氟-5-硝基苯甲酸与二氯亚砜进行酰化反应制备得到。

进一步地，化合物TPE-HBT和三乙胺的摩尔比为1:20～30，在不影响本发明效果的情况下，可以进一步优选为1:24.4。

进一步地，在第三步中，以化合物TPE-HBT和化合物2为原料，制备荧光探针AIE-PS2时，反应温度较低，例如，在冰浴的条件下进行反应。

进一步地，反应时间为8～24h，可以再优选为10～18h，例如12h。

本发明制备的荧光探针AIE-PS2可以用于定量检测聚硫化氢，特别用于细胞水平的聚硫化氢检测。

采用本发明的技术方案，优势如下:

本发明提供的识别聚硫化氢的荧光探针AIE-PS2，具有较大的斯托克斯位移(254nm)，选择性好、灵敏度高、检测限低(9nM)、荧光响应倍数高(75倍)及良好生物相容性的优点。

在PBS缓冲液，荧光强度与Na

本发明提供的荧光探针AIE-PS2是可视化和定量检测聚硫化氢的有效工具，为H

附图说明

图1是化合物TPE-CHO的

图2是化合物TPE-HBT的

图3是化合物TPE-HBT的

图4是荧光探针AIE-PS2的

图5是荧光探针AIE-PS2的HRMS图谱，HRMS(ESI

图6是荧光探针AIE-PS2与Na

图7是DMSO/水混合溶液中不同含水率下TPE-HBT的荧光光谱与动态光散射(DLS)；其中，(A)TPE-HBT(10μM)在不同比例的含水率下的荧光光谱；在600nm处，由下往上各曲线代表的含水率依次为30％、40％、0％、10％、20％、50％、60％、70％、80％、90％和99％；(B)TPE-HBT(10μM)在DMSO/水为1:99条件下的DLS粒径图；

图8是荧光母核TPE-HBT在溶剂中的电镜图；其中，荧光母核TPE-HBT在丙酮中的电镜图(A)以及其对应的局部放大图(B)；荧光母核TPE-HBT在丙酮:水＝1/9混合溶液中的电镜图(C)以及其对应的局部放大图(D)；

图9是荧光探针AIE-PS2与聚硫化氢反应后的荧光光谱与UV光谱；其中，(A)TPE-HBT，AIE-PS2和Na

图10是探针AIE-PS2(5μM)与不同浓度Na

图11是探针AIE-PS2与Na

图12是探针AIE-PS2对聚硫化氢的选择性，其中，(A)AIE-PS2(5μM)与Na

图13是探针AIE-PS2对聚硫化氢的选择性，其中，(A)AIE-PS2(5μM)与Na

图14是探针AIE-PS2对聚硫化氢的选择性，(A)AIE-PS2(5μM)与Na

图15是探针AIE-PS2对细胞存活率的影响，其中，(A)MCF-7细胞与AIE-PS2(0,5,10,15,20,30,40,50μM)孵育24h细胞的存活率；(B)MCF-7细胞与AIE-PS2(10μM)孵育不同时间(0,6,12,18,24h)细胞的存活率；

图16是探针AIE-PS2检测聚硫化氢的荧光成像，其中，(A)MCF-7细胞与AIE-PS2(10μM)在37℃下孵育30min；(B)细胞用N-甲基马来酰亚胺(NMM，1mM)预处理1h，然后与AIE-PS2(10μM)孵育30min；(C)将细胞与AIE-PS2(10μM)孵育30min，然后再与Na

图17为图16中(A)、(B)、(C)和(D)相应的细胞明场图；

图18是探针AIE-PS2检测内源性聚硫化氢的荧光成像，其中，(A)LPS(1μg/mL)诱导MCF-7细胞16h，然后与AIE-PS2(10μM)孵育30min；(B)将细胞与DL-炔丙基甘氨酸(PAG，200μM)预孵育30min，然后在37℃与LPS(1μg/mL)进一步孵育16h，然后将细胞与AIE-PS2(10μM)孵育30min；(C)以上图片(AB)中细胞的平均荧光强度；

图19是图18中(A)和(B)相应的细胞明场图。

具体实施方式

通过以下实施例并结合附图对本发明的聚硫化氢荧光探针作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。

一、实施方法

1、材料与仪器

1.1试剂

其余试剂都是国产分析纯

1.2仪器

1.3溶液的配置

探针溶液的配制：将AIE-PS2(6.47mg，0.01mmol)溶解于二甲亚砜(10mL)中，配成浓度为1mM的探针溶液。

Na

Na

Na

L-半胱氨酸(L-Cys)储备液的配制：将Cys(12.10mg，0.1mmol)溶于去离子水(10mL)中，配成浓度为10.0mM的储备液，将储备液稀释成1.0mM和100μM的溶液备用。

同型半胱氨酸(Hcy)储备液的配制：将Hcy(13.5mg，0.1mmol)溶于去离子水(10mL)中，配成浓度为10.0mM的储备液，将储备液稀释成1.0mM和100μM的溶液备用。

谷胱甘肽(GSH)储备液的配制：将GSH(30.7mg，0.1mmol)溶于去离子水(10mL)中，配成浓度为10.0mM的储备液，将储备液稀释成1.0mM和10mM的溶液备用。

其他分析物(Cys-polysulfide，GSSG，Na

以上所有配制溶液均现配现用。

1.4细胞

种属和品系：人乳腺癌细胞MCF-7。来源：中国科学院细胞库。

二、实施例

2.1探针AIE-PS2制备

TPE-CHO的制备：将化合物TPE-OH(0.5g，1.37mmol)加入至由六亚甲基四胺(1.92g，13.7mmol)和三氟乙酸(30mL)混合后得到的溶液中进行搅拌回流反应，反应时间为4h，待反应结束后，将得到的反应液用蒸馏水(30mL)淬灭反应，并用CH

TPE-HBT的制备：将化合物TPE-CHO(20mg，0.054mmol)和2-氨基苯硫醇(化合物1，20μL，0.187mmol)溶解在20mL甲醇中，加入30％H

2-氟-5-硝基苯甲酰氯的制备：将2-氟-5-硝基苯甲酸(204mg，1.1024mmol)加入至15mL二氯亚砜中，在80℃的条件下回流反应8h，待反应结束后，将得到的反应液减压浓缩，得到淡黄色固体2-氟-5-硝基苯甲酰氯(化合物2)，收率为60％。TLC(silica，DCM:MeOH，20:1，v/v)：R

探针AIE-PS2的制备：将2-氟-5-硝基苯甲酰氯(化合物2，20g，0.1mmol)溶于二氯甲烷中，滴加到含TPE-HBT(20mg，0.041mmol)和三乙胺(139.137μL，1.0mmol)的无水二氯甲烷溶液中，在冰浴的条件下过夜反应12h。待反应结束后，将得到的反应液减压浓缩，去除二氯甲烷，残留物用水洗涤(30mL)，二氯甲烷萃取(3×20mL)，减压浓缩得到粗品。粗品用乙酸乙酯(20mL)进行重结晶，得到淡黄晶体AIE-PS2，产率为66.1％。TLC(silica，PE:EA，10:1，v/v)：R

2.2探针AIE-PS2识别聚硫化氢的机理

探针AIE-PS2(64.8mg，0.1mmol)溶于DMSO(15mL)中，加入溶有Na

2.3扫描电镜分析

TPE-HBT(6.48mg，0.01mmol)溶于丙酮(10mL)中，配成浓度为0.1mM的母液，分别用丙酮与水稀释，得到TPE-HBT(浓度为0.01mM)的纯丙酮溶液与TPE-HBT(浓度为0.01mM)丙酮-水混合液(含水量为90％)。取一滴滴至硅片上，待自然晾干，喷金后采用Tenoe-VS场发射序列扫描电子显微镜进行分析测试。

2.4荧光光谱的测定

将探针AIE-PS2溶解于DMSO中，四硫化二钠或二硫化二钠(以Na

2.5检测限的测定

探针的荧光发射光谱重复测定10次，并计算其荧光强度的标准偏差。随后将探针AIE-PS2与一定浓度范围的Na

2.6紫外光谱的测定

紫外光谱采用UV-2401PC紫外-可见分光光度计测定。将探针加入石英比色皿中，加入20.0mM磷酸盐缓冲液将其稀释后，加入Na

2.7探针AIE-PS2细胞毒性的测定

采用MTT法测定探针AIE-PS2的细胞毒性。将MCF-7细胞以50,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，放入5％CO

2.8细胞培养与细胞水平聚硫化氢成像研究

将MCF-7细胞(来自中国科学院细胞库)接种于细胞培养液(DMEM，含有10％的小牛血清、青霉素/链霉素(100μg/mL)，于37℃、5％CO

2.9数据处理

使用SPSS软件进行统计分析。数据以均数±标准差(Mean±SD)表示，多组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析(one-way ANOVA)。P＜0.05表示差异有统计学意义。

三、效果验证

1.1 TPE-HBT的AIE性能

化合物TPE-HBT在DMSO中具有良好的溶解性，而在H

不同体积比例的DMSO/H

1.2荧光探针AIE-PS2与Na

首先，我们检测探针AIE-PS2与Na

1.3荧光探针AIE-PS2与Na

将AIE-PS2与不同浓度的Na

1.4荧光探针AIE-PS2与Na

如图11所示，将探针AIE-PS2与Na

1.5荧光探针AIE-PS2检测Na

为了检测探针AIE-PS2的选择性，我们将探针与活性硫(RSS，包括Na

2细胞水平聚硫化氢荧光成像

2.1细胞毒性测试

在进行细胞荧光成像之前，首先需要进行对探针AIE-PS2的细胞毒性测试。以人乳腺癌MCF-7细胞为检测细胞株，以MTT法检测探针AIE-PS2的细胞毒性。如图15所示，将不同浓度的探针AIE-PS2(0μM，5μM，10μM，15μM，20μM，30μM，40μM，50μM)与MCF-7细胞孵育24h，结果发现，细胞存活率仍在90％以上。将AIE-PS2(10μM)与MCF-7孵育6，12，18，24h后细胞存活率仍在90％以上。由此说明AIE-PS2对MCF-7细胞存活率几乎没有影响，具有低毒性。

2.2外源性聚硫化氢的细胞荧光成像

探针AIE-PS2在体外测试条件下具有良好的灵敏度与选择性，随后继续探究探针能否检测细胞中的聚硫化氢并进行荧光成像。将MCF-7细胞接种于标准共聚焦培养皿中，加入探针AIE-PS2孵育30min后可见微弱红色荧光(图16A)；将细胞提前1h给予N-甲基马来酰亚胺(NMM，H

2.3内源性聚硫化氢的细胞荧光成像

考察探针AIE-PS2能否在活细胞中进行内源性聚硫化氢荧光成像。胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)是内源性聚硫化氢的合成酶，而脂多糖(LPS)可诱导CSE mRNA表达，从而促进内源性H

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。