一种白肋烟烘焙过程中美拉德反应产物的判定和检测方法

技术领域

本发明涉及致香成分检测领域，尤其涉及一种白肋烟烘焙过程美拉德反应产物的判定和检测方法。

背景技术

混合型卷烟是一种重要的卷烟产品类型，占有很高的市场份额和较多的消费群体。白肋烟处理工艺是混合型卷烟生产的关键环节，其主要工艺为加料和高温烘焙。美拉德反应是白肋烟加料烘焙处理过程中进行的最主要的反应。该反应是烟叶中的氨基化合物(如氨基酸、胺、多肽或蛋白质等)与糖类物质发生缩合、重排、裂解、聚合等一系列反应的一类复杂反应。白肋烟烘焙过程中的美拉德反应特征产物包括吡嗪、呋喃、吡咯、吡啶、醛、醇、酯、醚等多种类致香成分，构成了混合型卷烟特有香吃味的物质基础，对混合型卷烟的感官质量具有显著影响。美拉德反应特征产物的判定和准确测定对白肋烟处理工艺研究及混合型卷烟产品质量提高都具有重要作用。

目前，已报道的美拉德反应致香产物的鉴定和检测方法多是糖和氨基酸在模型体系中美拉德反应产物的测定方法，而白肋烟中含有多种糖和氨基化合物，其烘焙过程中发生的美拉德反应较模型体系更为复杂，且烟草是全世界公认的最复杂化学体系之一，鉴定出的成分已达9825种，基质极其复杂，已报道模型体系中的美拉德反应致香产物的鉴定和检测方法显然不适用于白肋烟烘焙过程中美拉德反应特征产物的鉴定和检测。目前鲜见专门针对白肋烟烘焙过程中美拉德反应特征产物的鉴定和检测方法。因此，建立一种有效的美拉德反应特征产物的判定方法以及快速、准确的白肋烟烘焙过程美拉德反应特征产物的检测方法是十分必要的。

发明内容

本发明实施例提供一种白肋烟烘焙过程美拉德反应产物的判定方法。本发明提供的白肋烟烘焙过程美拉德反应产物判定方法填补了现有技术空白，具有简单高效、灵敏度高、选择性好和准确度高等优点，适用于白肋烟烘焙过程美拉德反应特征致香产物的检测和判定。

本发明实施例提供一种白肋烟烘焙过程美拉德反应产物的判定方法，包括：将白肋烟叶样品进行粉碎和致香成分萃取，采用气相色谱-三重四级杆串联质谱分析(GC-MS/MS)萃取溶液，对萃取溶液进行致香成分分析，确定烘焙样品较对照样品增加的致香成分，采用变化倍数法对白肋烟烘焙过程中美拉德反应特征致香产物进行判定。

根据本发明实施例提供的一种白肋烟烘焙过程中美拉德反应产物的判定方法，萃取溶剂为甲基叔丁基醚、二氯甲烷、环己烷或甲醇；优选的，所述萃取溶剂为甲醇；内标物为乙酸苯乙酯，浓度为 1～2mg/mL。本发明中，采用上述萃取溶剂，能够对烟草中的致香成分进行有效萃取。尤其是采用上述优选萃取溶剂，能够进一步提高致香成分的有效萃取及萃取效率。

根据本发明实施例提供的一种白肋烟烘焙过程中美拉德反应产物的判定方法，还包括：取3～6g所述烟末样品，加入20～50mL萃取溶剂和40～100μL内标物，超声萃取1～2h，静置5±1min，然后进行气相色谱-三重四级杆串联质谱分析测定；优选的，采用保留时间确认和标准加入法进行定性分析，采用内标法比较两组样品的检测结果。

根据本发明实施例提供的一种白肋烟烘焙过程中美拉德反应产物的判定方法，还包括：将白肋烟叶样品进行烘干、粉碎，在相对湿度60±3％，温度20±1℃的条件下平衡12～24h，然后将平衡后的白肋烟叶样品在40±1℃温度下烘1～2h后粉碎，过40目筛网，得烟末样品；所述白肋烟叶样品包括经烘焙处理的烘焙样品和未经烘焙处理的对照样品。本发明中，采用上述处理方法得到的烟末样品在保持致香成分不挥发的情况下，保持样品间水分一致。

根据本发明实施例提供的一种白肋烟烘焙过程中美拉德反应产物的判定方法，所述气相色谱条件：色谱柱为DB-WAX 30m×0.25 mm×0.25μm，HP-INNOWax 30m×0.25mm×0.25μm或DB-5 30 m×0.25mm×0.25μm；进样口温度230～260℃；升温程序：初始温度 45～60℃保持2～5min，以1～4℃/min升至200℃，再以3～10℃/min升至240℃，保持5～15min；载气：He，1mL/min；进样量：1μL；进样模式：不分流进样；和/或，所述质谱条件：离子源：电子轰击EI+；电子能量：70eV；离子源温度：230℃；传输线温度：250℃；倍增电压：500V；质量分析器：四级杆；扫描模式：全扫描，扫描范围： 35～350amu。

根据本发明实施例提供的一种白肋烟烘焙过程中美拉德反应产物的判定方法，所述气相色谱条件：色谱柱，DB-WAX 30m×0.25 mm×0.25μm；进样口温度250℃；升温程序：初始温度50℃保持3 min，以2℃/min升至200℃，再以5℃/min升至240℃，保持10min。载气：He，1mL/min；进样量：1μL；进样模式：不分流进样。

本发明中，在白肋烟烘焙过程中美拉德反应产物的判定过程中，通过采用上述气相色谱和质谱条件，能够使得各致香成分得到有效分离，提高了分析的准确性。

根据本发明实施例提供的一种白肋烟烘焙过程中美拉德反应产物的判定方法，所述致香成分分析包括：通过NIST谱库匹配确定目标致香成分，然后比较标准样品与待测样品中目标致香成分保留时间的一致性，分离鉴定出目标致香成分；采用目标致香成分的峰面积与内标峰面积的比值，对样品进行分析。

根据本发明实施例提供的一种白肋烟烘焙过程中美拉德反应产物的判定方法，所述变化倍数法：计算白肋烟加料烘焙后致香成分的含量与未烘焙对照样的比值，选择阈值为2倍；变化倍数≥2，则认为烘焙后该致香成分变化显著，判定为美拉德特征致香产物。

本发明实施例还提供一种白肋烟烘焙过程中美拉德反应产物的检测方法，所述美拉德反应产物通过所述判定方法确定，包括：对白肋烟叶样品的萃取液进行气相色谱-三重四级杆串联质谱分析测定，计算白肋烟烘焙过程中美拉德特征致香产物含量。

根据本发明实施例提供的一种白肋烟烘焙过程中美拉德反应产物的检测方法，包括：取烘焙后的白肋烟叶样品，在40±1℃温度下烘1～2h后粉碎，过40目筛网；准确称取1～3g烟末样品，加入20～60 mL甲醇和20～60μL乙酸苯乙酯内标，超声萃取1～2h，静置5min后，用取上层萃取液经0.45μm过滤后，进行气相色谱-三重四级杆串联质谱分析测定，计算白肋烟烘焙过程中美拉德特征致香产物含量。

根据本发明实施例提供的一种白肋烟烘焙过程中美拉德反应产物的检测方法，气相色谱条件：色谱柱：DB-WAX毛细管柱(30m×0.25 mm×0.25μm)；升温程序：初始温度40～50℃，保持2～5min，以 3～6℃/min的速率升温至55～80℃，再以2～5℃/min速率升温至140～160℃，保持1～3min，以5～10℃/min的速率升温至190～210℃，保持2～4min，再以10～25℃/min的速率升温至230～245℃，保持4～6 min；进样口温度：250℃；进样量：1μL，不分流进样；恒流模式，柱流量1mL/min；和/或，质谱分析条件：EI电离模式，电离能70ev；离子源温度：230℃；传输线温度：250℃；Q1和Q3温度：150℃；碰撞气：N

根据本发明实施例提供的一种白肋烟烘焙过程中美拉德反应产物的检测方法，所述气相色谱条件：DB-WAX毛细管柱30m×0.25 mm×0.25μm；升温程序：初始温度50℃，保持3min，以5℃/min 的速率升温至65℃，再以3℃/min速率升温至150℃，保持1min，以8℃/min的速率升温至200℃，保持3min，再以20℃/min的速率升温至240℃，保持5min。进样口温度：250℃；进样量：1μL，不分流进样；恒流模式，柱流量1mL/min。

本发明中，采用上述特定色谱条件，既能够使所测美拉德特征致香产物得到有效分离，同时缩短分析时间，提高检测效率。

本发明的有益效果至少在于：本发明提供的方法填补了现有技术空白，采用GC-MS/MS结合变化倍数法，建立了一种有效的针对白肋烟烘焙过程中美拉德反应特征产物的鉴定和检测方法。该方法具有简单高效、灵敏度高、选择性好和准确度高等优点，适用于白肋烟烘焙过程中美拉德反应特征致香产物的检测和判定。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中白肋烟烘焙过程中美拉德反应特征产物的MRM总离子流色谱图(编号1-28成分，对应名称见表3)；

图2为实施例1中白肋烟烘焙过程中美拉德反应特征产物的 MRM总离子流色谱图(编号29-34成分，对应名称见表3)。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。

实施例1

本实施例提供了一种白肋烟烘焙过程美拉德反应特征致香产物的检测和判定方法。

1)美拉德特征致香产物判定：

取某品牌牌号1卷烟的白肋烟叶组正常加里料烘焙前样品两份，一份作为对照样品不进行烘焙处理，另一份为烘焙样品，按正常烘焙程序进行烘焙处理。待烘焙样品完成烘焙处理后，将两组样品置于恒温恒湿箱内，在相对湿度60±3％，温度20±1℃的条件下平衡12h。将平衡后的样品放置在烘箱中，在40℃温度下烘1h后粉碎，过40目筛网。

准确称取5g烟末样品，每份样品5个重复，分别加入30mL甲醇和60μL苯甲酸正丙酯内标(1mg/mL)，迅速盖上盖，超声萃取1h，静置5min后，用取上层萃取液经0.45μm针式滤器过滤后，进行GC- MS/MS测定。

色谱条件：色谱柱，DB-WAX(30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度250℃；升温程序：初始温度50℃保持3min，以2℃/min升至200℃，再以5℃/min升至240℃，保持10min。载气：He，1mL/min；进样量：1μL；进样模式：不分流进样。

质谱条件：离子源：电子轰击(EI+)；电子能量：70eV；离子源温度：230℃；传输线温度250℃；倍增电压：500V；质量分析器：四级杆；扫描模式：全扫描，扫描范围：35-350amu。

以GC-MS全扫描方式分析萃取溶液样品，通过NIST谱库匹配确定目标致香成分，然后比较标准样品与待测样品中目标致香成分保留时间的一致性。共分离鉴定出73种香气成分，见表1。

采用各目标致香成分的峰面积与内标峰面积的比值(相对峰面积)，对样品进行半定量分析。确定烘焙样品较对照样品明显增加的致香成分共有33种(表2)。采用变化倍数法对白肋烟烘焙过程中美拉德反应特征致香产物进行判定。计算白肋烟加料烘焙后致香成分的含量与未烘焙对照样的比值，选择阈值为2倍，变化倍数≥2，则认为烘焙后该致香成分变化显著，判定为美拉德特征致香产物，共确定美拉德特征致香产物25种，见表2。

表1白肋烟烘焙后致香成分的定性分析结果

表2白肋烟加料烘焙后致香成分的含量与对照样的比值

2)美拉德特征致香产物测定：

取适量烘焙后的白肋烟样品，在40℃温度下烘1h后粉碎，过40 目筛网。准确称取2g烟末样品，每份样品3个重复，分别加入40mL 甲醇和40μL苯甲酸正丙酯内标，迅速盖上盖，超声萃取1h，静置 5min后，用取上层萃取液经0.45μm针式滤器过滤后，进行气相色谱 -三重四级杆串联质谱分析(GC-MS/MS)测定，计算白肋烟烘焙过程中美拉德特征致香产物含量。

色谱条件：DB-WAX毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；升温程序：初始温度50℃，保持3min，以5℃/min的速率升温至65℃，再以3℃/min速率升温至150℃，保持1min，以8℃/min的速率升温至200℃，保持3min，再以20℃/min的速率升温至240℃，保持5 min。进样口温度：250℃；进样量：1μL，不分流进样；恒流模式，柱流量1mL/min。

质谱分析条件：EI电离模式，电离能70ev；离子源温度：230℃；传输线温度：250℃；Q1和Q3温度：150℃；碰撞气：N

表3各分析物及内标MRM质谱参数

标准溶液按以下方法配置

准确称取2.5g乙酸苯乙酯标准品，用甲醇定容于50mL容量瓶中，得质量浓度为50mg/mL的内标储备液。移取100μL内标储备液于50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，得质量浓度为100μg/mL的内标标准工作液。分别称取香气标准物质各0.1g(精确至0.1mg)，用甲醇溶解后定容于100mL容量瓶中，配制成质量浓度为1mg/mL的一级混合标准溶液，移取500μL一级混合标准溶液50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，得质量浓度为10μg/mL的二级混合标准溶，由二级混合标准溶液，再分别加入50μL的内标标准工作液，用配制成 7级标准工作溶液，浓度范围为5-2000ng/mL。

本发明方法检出限、加标回收率和重复性：

以标准工作溶液最低浓度3倍信噪比作为检出限，采用标准加入法考察美拉德特征致香成分的回收率(n＝5)，分别在样品处理当日不同时间点和不同处理天数进样分析(n＝5)，计算日内和日间精密度，结果见表4。

表4各分析物的检出限、回收率和精密度

某品牌牌号1卷烟的白肋烟叶组烘焙后美拉德特征致香产物测定结果如表5所示。

表5某品牌牌号1卷烟白肋烟烘焙后美拉德特征致香产物测定结果

实施例2

本实施例提供一种白肋烟烘焙过程美拉德反应特征致香产物的检测和测定方法，与实施例1不同之处在于白肋烟样品及白肋烟烘焙过程美拉德反应特征致香产物的检测方法：

取某品牌牌号2号混合型卷烟烘焙后的白肋烟样品，在40℃温度下烘1.5h后粉碎，过40目筛网。准确称取3g烟末样品，每份样品3个重复，分别加入50mL甲醇和50μL乙酸苯乙酯内标，迅速盖上盖，超声萃取1.5h，静置5min后，用取上层萃取液经0.45μm针式滤器过滤后，进行GC-MS/MS测定，计算白肋烟烘焙过程中美拉德特征致香产物含量。

气相色谱条件为：色谱柱：DB-WAX毛细管柱(30m×0.25 mm×0.25μm)；升温程序：初始温度45℃，保持5min，以6℃/min 的速率升温至60℃，再以4℃/min速率升温至155℃，保持2min，以 6℃/min的速率升温至210℃，保持2min，再以25℃/min的速率升温至245℃，保持4min。进样口温度：250℃；进样量：1μL，不分流进样；恒流模式，柱流量1mL/min。

质谱分析条件为：EI电离模式，电离能70ev；离子源温度：230℃；传输线温度：250℃；Q1和Q3温度：150℃；碰撞气：N

牌号2卷烟的白肋烟叶组烘焙后美拉德特征致香产物测定结果如表6所示。

表6牌号2卷烟白肋烟烘焙后美拉德特征致香产物测定结果

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。