基质金属蛋白酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及基质金属蛋白酶技术领域，尤其涉及一种基质金属蛋白酶及其制备方法。

背景技术

目前对于基质金属蛋白酶的组成中，是通过几个比较常见的蛋白酶及其对应的活性片段、突变体、变异体之间的组合构成，结构简单，并且，在目前常见的制备工艺中，总会因为其他酶的存在，降低得到的基质金属蛋白酶的纯度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基质金属蛋白酶及其制备方法，能够得到纯度更高的基质金属蛋白酶。

为实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种基质金属蛋白酶，所述基质金属蛋白酶为：

MHPGVLAAFL FLSWTHCRAL PLPSGGDEDD LSEEDLQFAE RYLRSYYHPT

NLAGILKENA ASSMTERLRE MQSFFGLEVT GKLDDNTLDV MKKPRCGVPD

VGEYNVFPRT LKWSKMNLTY RIVNYTPDMT HSEVEKAFKK AFKVWSDVTP

LNFTRLHDGI ADIMISFGIK EHGDFYPFDG PSGLLAHAFP PGPNYGGDAH

FDDDETWTSS SKGYNLFLVA AHEFGHSLGL DHSKDPGALM FPIYTYTGKS

HFMLPDDDVQ GIQSLYGPGD EDPNPKHPKT PDKCDPSLSL DAITSLRGET

MIFKDRFFWR LHPQQVDAEL FLTKSFWPEL PNRIDAAYEH PSHDLIFIFR

GRKFWALNGY DILEGYPKKI SELGLPKEVK KISAAVHFED TGKTLLFSGN

QVWRYDDTNH IMDKDYPRLI EEDFPGIGDK VDAVYEKNGY IYFFNGPIQF

EYSIWSNRIV RVMPANSILW C。

第二方面，本发明提供了一种基质金属蛋白酶的制备方法，适用于如第一方面所述的一种基质金属蛋白酶，包括以下步骤：

获取制备的感受态细胞，并利用对应的质粒对所述感受态细胞进行转化和培养；

对培养的所述感受态细胞进行上清液提取，并利用质粒大抽试剂盒提取出转染级质粒；

将转染缓冲液、转染试剂和所述转染级质粒加入获取的细胞悬浮液中进行质粒转染，得到转染细胞；

基于Ni-IDA亲和层析原理对所述转染细胞进行亲和层析纯化，得到基质金属蛋白酶。

其中，获取制备的感受态细胞，并利用对应的质粒对所述感受态细胞进行转化和培养，包括：

对冻干的质粒离心，并加入复溶溶液后，加入获取的感受态细胞进行转化；

对转化后的所述感受态细胞进行冰浴、热激和冰浴，并在静置3min后，加入200μL的液体培养基，放入摇床37℃，200rpm震荡培养约30nim；

对培养后的损失感受态细胞进行离心和去清，然后对得到的悬浊液进行培养和接种，在37℃，200rpm的培养基中培养16h。

其中，对培养的所述感受态细胞进行上清液提取，并利用质粒大抽试剂盒提取出转染级质粒，包括：

对培养16h后的所述感受态细胞进行裂解和上清液的提取；

将得到的所述上清液移入具有10mL Buffer QBT平衡柱子的质粒大抽试剂盒中，并对抽取得到的质粒DNA进行复溶，得到复溶质粒DNA；

利用1％琼脂糖凝胶对所述复溶质粒DNA进行筛选，得到转染级质粒。

其中，将转染缓冲液、转染试剂和所述转染级质粒加入获取的细胞悬浮液中进行质粒转染，得到转染细胞之前，所述方法还包括；

对获取的样本细胞进行解冻和离心培养，直至细胞密度达到2×106cells/mL时，得到所述细胞悬浮液。

其中，将转染缓冲液、转染试剂和所述转染级质粒加入获取的细胞悬浮液中进行质粒转染，得到转染细胞之前，所述方法还包括：

在转染前2天，将所述细胞悬浮置于培养箱中110rpm，37℃，5％的CO2中培养至1L，接种密度为4-5×105cells/mL；

在转染当天，使细胞密度控制在1.5-2×106cells/mL。

其中，将转染缓冲液、转染试剂和所述转染级质粒加入获取的细胞悬浮液中进行质粒转染，得到转染细胞之前，所述方法包括：

将转染缓冲液、转染试剂放入培养箱或水浴锅37℃预热10-20min。

本发明的一种基质金属蛋白酶及其制备方法，获取制备的感受态细胞，并利用对应的质粒对所述感受态细胞进行转化和培养；对培养的所述感受态细胞进行上清液提取，并利用质粒大抽试剂盒提取出转染级质粒；将转染缓冲液、转染试剂和所述转染级质粒加入获取的细胞悬浮液中进行质粒转染，得到转染细胞；基于Ni-IDA亲和层析原理对所述转染细胞进行亲和层析纯化，得到基质金属蛋白酶，能够得到纯度更高的基质金属蛋白酶。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明提供的一种基质金属蛋白酶的制备方法的步骤示意图。

图2是本发明提供的质粒转化感受态细胞的流程图。

图3是本发明提供的质粒大提的流程图。

图4是本发明提供的转染级质粒测定结果图。

图5是本发明提供的质粒瞬时转染细胞流程图。

图6是本发明提供的Ni-IDA亲和层析纯化流程图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

请参阅图1，本发明提供一种基质金属蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：

S101、获取制备的感受态细胞，并利用对应的质粒对所述感受态细胞进行转化和培养。

具体的，如图2所示，1、将冻干的质粒离心，3000rpm/min，2min，加入TE复溶。

2、吸取80-100ng的复溶后质粒加入已制备的DH5a感受态细胞中。

3、将转化后的感受态细胞冰浴静置30min。

4、取出静置后的感受态细胞立即放入42℃水浴中，热激90s。

5、将热激后的感受态细胞放回冰浴，静置3min。

6、取出静置后的感受态细胞，向其中加入200μL的LB液体培养基，放入摇床37℃，200rpm震荡培养约30nim。

7、将培养后的感受态细胞取出离心，3000rpm，2min。

8、去掉200μL的上清，留100μL左右上清悬浮沉淀，吸取50μL悬液涂在含有氨苄抗性的平板上。

9、将平板放入培养箱，37℃，过夜或者说是不超过12小时。

10、从新鲜的培养板中挑取单克隆于2-5mL LB培养基，37℃，200rpm培养8h。

11、按1/500比例接种于200mL LB培养基中，37℃，200rpm培养16h。

S102、对培养的所述感受态细胞进行上清液提取，并利用质粒大抽试剂盒提取出转染级质粒。

具体的，如图3所示，A、细菌培养、收获和裂解

1、200mL培养16h后的菌液于4℃冷冻离心机离心，6000rpm，15min，倒掉上清。

2、加入10mL Buffer P1重新悬浮细菌沉淀，混匀。

3、加入10mL Buffer P2，轻柔翻转4-6次混合，室温静置5min。

4、加入10mL预冷的Buffer P3(缓冲器)，轻柔翻转4-6次混合。

B、提取上清

5、将裂解液倒入滤筒内，不要套入滤筒活塞，室温放置10min。从喷嘴处取下滤筒的帽子，缓慢轻柔的将活塞推入滤筒并过滤裂解液于50mL管子中。

6、加入2.5mL buffer ER于过滤后的裂解液中，翻转10次左右使其混合均匀，冰浴30min。

C、结合、洗涤和抽提质粒DNA

7、向QIAGEN-tip 500中加入10mL Buffer QBT平衡柱子，通过重力使其自然流空。

8、将第6步得到的过滤裂解液移入QIAGEN-tip柱中，使其自然流下通过树脂。

9、用30mL Buffer QC洗涤QIAGEN-tip柱子2次。

10、用15mL Buffer QN抽提DNA。

D、沉淀、洗涤和复溶质粒DNA

11、加入10.5mL(0.7倍体积)室温异丙醇到洗脱液中沉淀DNA。立刻混匀，4℃，13000rpm，离心30min，小心弃上清。

12、加入5mL室温的去内毒素的70％乙醇，13000rpm，离心10min，小心弃上清避免碰到沉淀。

13、空气中干燥沉淀5-10min，用适量的去内毒素的Buffer TE重新溶解质粒DNA。

E、转染级质粒DNA质粒质量测定

14、1％琼脂糖凝胶分析抽提的质粒，结果如图4所示。

15、转染级质粒DNA质粒质量测定，如表1所示。

表1转染级质粒DNA质粒质量测定结果

S103、将转染缓冲液、转染试剂和所述转染级质粒加入获取的细胞悬浮液中进行质粒转染，得到转染细胞。

具体的，如图5所示，1、转染前2天将细胞悬浮培养至1L，接种密度为4-5×105cells/mL，置于培养箱中110rpm，37℃，5％CO2培养。

2、转染当天使细胞密度控制在1.5-2×106cells/mL。

3、将转染缓冲液、转染试剂等提前放入培养箱或水浴锅37℃预热(10-20min)

4、DNA-转染试剂混合物：向转染缓冲液中加入DNA和转染试剂混匀，37℃温育10min。

5、将DNA-转染试剂混合物加入待转染细胞中，放入培养箱中110rpm，37℃，5％的CO2培养。

6、收集：转染后培养约5-6天，取出细胞培养物，离心，收集上清或细胞。

S104、基于Ni-IDA亲和层析原理对所述转染细胞进行亲和层析纯化，得到基质金属蛋白酶。

具体的，如图6所示，A、Ni-IDA亲和层析原理

Ni-IDA亲和层析的原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与过渡金属离子Ni2+发生特殊的相互作用，利用这个原理可以把富含这类氨基酸的蛋白质吸附，从而达到分离的目的。由于这个原因，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。

B、亲和层析纯化过程

1、取转染培养6天后的细胞培养液用离心机12500rpm，10min离心，收集上清液，用0.22um膜过滤。

2、将过滤后的上清液装入透析袋中,按透析体积为1:20在4℃环境下透析至缓冲液A：25mM Tris，150mM NaCl，pH8.0中2-3h，然后换液透析过夜。

3、Ni-IDA填料装柱，1.6×20m，柱床体积为3-5mL。

4、用缓冲液A平衡2-5个床体积，流速为1mL/min。

5、将透析结束后的样品上样，流速为1mL/min，取流出液，用于SDS-PAGE检测。

6、用缓冲液A再洗2-5个床体积，流速为1mL/min。

7、用分别含30、300mM咪唑的缓冲液A进行阶段洗脱，流速为2mL/min，收集各阶段洗脱峰，并取样采用SDS-PAGE检测分析融合蛋白的分子量大小和纯度。

所述方法还包括：细胞无血清悬浮培养

1、提前将水浴锅打开37℃；培养基提前在37℃预热。

2、从液氮罐中取出冻存的HEK293/CHO细胞。

3、把冻存细胞立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动使其快速融化(大概1-2min)，取出。

4、用75％乙醇消毒管外壁，放入生物安全柜内,转移到含10mL培养基的15mL离心管中，离心800rpm，5min。

5、离心后的细胞去掉上清，取少许新鲜培养基重悬细胞，再转移到培养瓶中，加入新鲜培养基轻轻摇动，使细胞分散均匀，取细胞计数及活力检测，使密度控制在3-4×105cells/mL，活力>95％。

6、置于培养箱中110rpm，37℃，5％CO2培养。

7、细胞培养2-3天，密度达到2.0×106cells/mL左右时需对细胞进行传代。

8、从培养瓶中取出部分培养物弃掉，再向培养瓶中补加新鲜培养基，对剩余的细胞培养物稀释(留下的细胞培养物根据细胞密度、培养体积、稀释后密度等而定)。

9、放入培养箱中110rpm，37℃，5％CO2，继续培养。

10、每天需对细胞密度及活力检测，当细胞密度达到2×106cells/mL左右时，要对细胞进行传代。

本发明提高一种基质金属蛋白酶，基质金属蛋白酶(MMP3)：

MHPGVLAAFL FLSWTHCRAL PLPSGGDEDD LSEEDLQFAE RYLRSYYHPT

NLAGILKENA ASSMTERLRE MQSFFGLEVT GKLDDNTLDV MKKPRCGVPD

VGEYNVFPRT LKWSKMNLTY RIVNYTPDMT HSEVEKAFKK AFKVWSDVTP

LNFTRLHDGI ADIMISFGIK EHGDFYPFDG PSGLLAHAFP PGPNYGGDAH

FDDDETWTSS SKGYNLFLVAAHEFGHSLGL DHSKDPGALM FPIYTYTGKS

HFMLPDDDVQGIQSLYGPGD EDPNPKHPKT PDKCDPSLSL DAITSLRGET

MIFKDRFFWR LHPQQVDAEL FLTKSFWPEL PNRIDAAYEH PSHDLIFIFR

GRKFWALNGY DILEGYPKKI SELGLPKEVK KISAAVHFED TGKTLLFSGN

QVWRYDDTNH IMDKDYPRLI EEDFPGIGDKVDAVYEKNGY IYFFNGPIQF

EYSIWSNRIV RVMPANSILW C。

本发明的一种基质金属蛋白酶及其制备方法，获取制备的感受态细胞，并利用对应的质粒对所述感受态细胞进行转化和培养；对培养的所述感受态细胞进行上清液提取，并利用质粒大抽试剂盒提取出转染级质粒；将转染缓冲液、转染试剂和所述转染级质粒加入获取的细胞悬浮液中进行质粒转染，得到转染细胞；基于Ni-IDA亲和层析原理对所述转染细胞进行亲和层析纯化，得到基质金属蛋白酶，能够得到纯度更高的基质金属蛋白酶。

以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。