一种检测RBD和NTD中和抗体的方法及产品

技术领域

本发明涉及抗体检测领域，具体而言，涉及检测方法及产品。

背景技术

国内散点突发事件频发，疫苗快速批准上市显得格外迫切。目前已有部分疫苗在全球范围内获得紧急使用授权或附加条件上市。

但是面对全新的病毒，相关的基础研究较多机制研究不透彻的背景下，大量的疫苗设计快速进入临床，在疫苗的有效性、保护周期、质量控制、可及性上仍在有较多的内容需要进一步研究。

国内第一批疫苗主要为灭活疫苗，然而灭活疫苗采用的BPL灭活，Spike 蛋白存在较高比例的融合后构象以及RBD“down”构象，在初步的免疫人群分析中，发现总抗体水平应答相对较低且中和抗体滴度不高的迹象。

另外，从现有的新冠基础研究来看，并非所有个体感染新冠之后会产生足够滴度的中和抗体，存在二次感染风险。中和抗体滴度在1个月达到峰值后会逐步下降，少部分低滴度康复者会降至检测限以下。参考其他冠状病毒，新冠抗体存在的时间可能在1-2年左右，并不能形成长效保护。

SARS-CoV-2的中和抗体可以通过阻断或抑制SARS-CoV-2与宿主细胞之间的相互作用来有效的控制感染。其中研究最为透彻的机制为SARS-CoV-2刺突 Spike蛋白S1亚基上的受体结合区(Receptor Binding Domain,RBD)和宿主细胞受体ACE2的相互作用及后续的构象转变及膜融合。ACE2又称ACEH，名为血管紧张素转化酶2，是一种金属蛋白酶，全长805个氨基酸，是具有单一胞外催化结构域的I型跨膜糖蛋白。受体结合基序(RBM)，是与ACE2接触的受体结合域(RBD)的一部分。

目前研究也分离到很多新的中和抗体，例如结合S1亚基NTD区域的中和抗体。

目前部分疫苗显示出免疫后中和抗体阳转率和滴度偏低的迹象。此外， SARS-CoV-2作为RNA病毒，变异频率非常高，恢复期血清和疫苗的中和效果对部分突变显示出更低的中和能力，这部分突变的积累可能导致免疫逃逸的发生。因此对中和抗体检测的灵敏度和敏感性提出了更高的要求。

现有的产品主要通过RBD-ACE2竞争法检测阻断RBD-ACE2相互作用的中和抗体，对NTD中和抗体抗体无法检出。

为此，提出本发明。

发明内容

本发明提供了以下至少一种实施方式：

在一些实施方式中，本发明涉及一种冠状病毒中和抗体检测方法，包括步骤：

(1)样品与含RBD的片段、试剂1、试剂2接触；

试剂1：ACE2或ACE2片段；

试剂2：结合NTD的中和抗体；

其中，所述试剂1或试剂2中的一种连接有标记物，另一种固定于固相载体；

(2)检测信号。

在一些实施方式中，所述接触方式包括以下任意一种：

(a)样品同时与含有RBM及NTD结构域的蛋白、试剂1、试剂2接触；

(b)样品先与含有RBM及NTD结构域的蛋白、试剂1接触，再与试剂2 接触；

(c)样品先与含有RBM及NTD结构域的蛋白、试剂2接触，再与试剂1 接触；

(d)样品先与含有RBM及NTD结构域的蛋白接触，再与试剂1、试剂2接触；

(e)样品先与含有RBM及NTD结构域的蛋白接触，再与试剂1接触，再与试剂2接触；

(f)样品先与含有RBM及NTD结构域的蛋白接触，再与试剂2接触，再与试剂1接触。

在一些实施方式中，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2或SARS-CoV。

在一些实施方式中，所述样品选自可能含有抗体的任何样品。

在一些实施方式中，所述样品选自血清、血浆、全血、淋巴液、脑脊液、组织液、唾液、尿液或淋巴细胞。

在一些实施方式中，含有RBM及NTD结构域的蛋白可选的是S1蛋白或S 蛋白。

在一些实施方式中，一种冠状病毒中和抗体的检测组件，包括：

(a)以上任一实施方式所述的含RBD的片段；

(b)以上任一实施方式所述的试剂1；

(c)以上任一实施方式所述的试剂2。

在一些实施方式中，固相载体选自磁微粒或Elisa板。

在一些实施方式中，一种冠状病毒中和抗体的检测组件，包括：有RBM及 NTD结构域的蛋白以及试纸；所述试纸上有样本垫、结合垫、层析膜、吸水垫以及背衬板，所述试纸还包括：以上任一实施方式所述的试剂1和试剂2。

其中，所述试剂1连接有标记物，并设于结合垫上，所述试剂2固定于层析膜；或；所述试剂2连接有标记物，并设于结合垫上，所述试剂1固定于层析膜。

在一些实施方式中，所述含有RBM及NTD结构域的蛋白设于样品垫上。

在一些实施方式中，以上任一实施方式所述的检测方法、以上任一实施方式所述的检测组件在抗体检测或制备抗体检测试剂中的应用。

附图说明

图1示出双竞争检中和抗体方法学原理，图中M表示固相载体，NTD-NAb 表示NTD中和抗体，RBD-NAb表示RBD中和抗体。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

本文中，“中和抗体”中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体，能够与病原微生物表面的抗原结合，从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体，防止侵入细胞。

本文中，“样品”可理解为可能含有抗体的任何样品，在一些实施方式中，样品来自于感染或主动免疫后的样品；在一些实施方式中，样品选自体液、排泄物、细胞；例如血清、血浆、全血、淋巴液、脑脊液、组织液、唾液、尿液、淋巴细胞等，但不限于此。

本文中，“标记物”可理解为能够直接产生信号；或直接或间接促发特定物质产生信号，标记物可直接或间接连接至被标记物上。例如通常用于免疫检测的标记物，包括金属粒子、荧光标记物、发色团标记物、电子致密标记物、化学发光标记物、电化学发光标记物、放射性标记物、核酸标记物、多肽标记物或酶，但不限于此。在一些实施方式中，标记物可以是胶体金、荧光素、荧光微球、吖啶酯、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、胶乳微球、三联钌、鲁米诺类、Eu螯合物。

本文中，“固相载体”可理解为能够与被固定物(如蛋白、多肽)固定，例如通常用于免疫检测的固相载体，包括塑料、微粒或膜载体。塑料例如可以是聚苯乙烯；微粒例如可以是磁微粒；膜载体例如可以是硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜。

本文中，“检测信号”可理解为采取能够识别信号物质的方式，获取或识别检测信号强弱或水平。

本文中，“接触”可理解为允许其发生结合。接触时间不作具体限定，不同的实施方式和检测平台，接触时间有所差异，但属于本领域技术人员可以理解的范畴。

本文中，“含有RBM及NTD结构域的蛋白”可以理解为由重组技术构建的仅有RBM和NTD氨基酸组成的重组蛋白，也可以是冠状病毒上的天然蛋白或重组的天然蛋白，其中包括RBM和NTD的氨基酸序列，例如S1蛋白或S 蛋白。

本发明在抗体检测，尤其是中和抗体检测上，具有能够同时检测RBD中和抗体和NTD中和抗体，检测的中和抗体更全面并且具有更高的灵敏度和/或检出率，可以覆盖更全的中和抗体。本发明具有通用性，不限于特定的免疫检测平台，不限于特定物种。

在一些实施方式中，本发明提供检测方法，包括步骤：

(1)样品与含有RBM及NTD结构域的蛋白、试剂1、试剂2接触；

试剂1：ACE2或ACE2片段；

试剂2：结合NTD的中和抗体；

所述试剂1或试剂2中的一种连接有标记物，另一种固定于固相载体；

(2)检测信号。

在一些实施方式中，步骤(1)选自以下方式中的任意一种：

(a)样品同时与含有RBM及NTD结构域的蛋白、试剂1、试剂2接触；

(b)样品先与含有RBM及NTD结构域的蛋白、试剂1接触，再与试剂2 接触；

(c)样品先与含有RBM及NTD结构域的蛋白、试剂2接触，再与试剂1 接触；

(d)样品先与含有RBM及NTD结构域的蛋白接触，再与试剂1、试剂2接触；

(e)样品先与含有RBM及NTD结构域的蛋白接触，再与试剂1接触，再与试剂2接触；

(f)样品先与含有RBM及NTD结构域的蛋白接触，再与试剂2接触，再与试剂1接触。

在一些实施方式中，所述病原体为冠状病毒。其中，常见的感染人的冠状病毒包括HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、 MERS-CoV或SARS-CoV-2。在一些实施方式中，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。所述SARS-CoV-2包括其野生型及变异型。

在一些实施方式中，样品选自体液、排泄物、细胞；例如血清、血浆、全血、淋巴液、脑脊液、组织液、唾液、尿液、淋巴细胞等，但不限于此。

在一些实施方式中，含有RBM及NTD结构域的蛋白可以是重组的至少含有RBM和NTD序列重组蛋白，也可以直接使用病毒的SI或S蛋白(包含了R BM和NTD序列)。其中，RBD为受体结合区(Receptor Binding Domain)， NTD为N末端结构域(N terminal domain)。在一些实施方式中，所述配体选自 SARS-CoV-2S蛋白的RBD、SARS-CoV-2S蛋白的NTD。在一些实施方式中，含SARS-CoV-2S蛋白RBD的片段可以是S蛋白及其涵盖RBD的片段，例如 S蛋白参考Gene ID:43740568。在一些实施方式中，SARS-CoV-2S蛋白的R BD的序列可参考文献WrappDaniel,Wang Nianshuang,Corbett Kizzmekia S, et al.Cryo-EM structure of the2019-nCoV spike in the prefusion conformatio n，以及与其序列一致性至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列，且这些氨基酸序列仍具有配体结合受体和/或抗体的功能。在一些实施方式中，SARS-CoV-2S蛋白的NT D的序列可参考文献A neutralizing human antibody binds to the N-terminal do main of the spike protein of SARS-CoV-2，以及与其序列一致性至少70％、75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列，且这些氨基酸序列仍具有配体结合受体和/或抗体的功能。“RBM”是“RBD”中的受体结合域，氨基酸序列是SNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKS NLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQ或与其序列一致性至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％的氨基酸序列。用于检测RBD中和抗体的抗原至少需要“RBM”片段。

在一些实施方式中，“ACE2”是指任何物种的ACE2，且包括得自任何物种的ACE2亚型、片段、变体(包括突变体)、或同系物。在一些实施方式中， ACE2是哺乳动物(例如，兽亚纲、真哺乳亚纲、真兽亚纲、原兽亚纲、统兽总目、灵长目(猴、非人灵长类、或人)的ACE2。在一些实施方式中，ACE2是人、蝙蝠、穿山甲、麝猫、或猪的ACE2。在一些实施方式中，ACE2是人的ACE2，序列可参考Gene ID:59272，以及与其序列一致性至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列，且这些氨基酸序列仍具有受体结合配体的功能。

在一些实施方式中，本发明还涉及一种冠状病毒中和抗体的检测组件，所述组件包括：

(1)以上任一实施方式所述的含有RBM及NTD结构域的蛋白；

(2)以上任一实施方式所述的试剂1；

(3)以上任一实施方式所述的试剂2；

在一些实施方式中，固相载体选自磁微粒或Elisa板。

在一些实施方式中，本发明还涉及一种冠状病毒中和抗体的检测组件，包括：含有RBM及NTD结构域的蛋白以及试纸；所述试纸上有样本垫、结合垫、层析膜、吸水垫以及背衬板，所述试纸还包括以上任一实施方式所述的试剂1 和试剂2；其中，所述试剂1连接有标记物，并设于结合垫上，所述试剂2固定于层析膜；或；所述试剂2连接有标记物，并设于结合垫上，所述试剂1固定于层析膜。

在一些实施方式中，所述含有RBM及NTD结构域的蛋白设于样品垫上。

本文中“组件”可理解为套件，例如常规的试剂盒、层析试纸、试剂卡等免疫产品常规形式。

本发明还涉及以上任一实施方式所述的检测方法，或以上任一实施方式所述的检测组件在抗体检测或制备抗体检测试剂中的应用。

以检测SARS-COV-2中和抗体为例说明本发明的原理：

(1)将S蛋白与阳性样品接触，S蛋白与S蛋白总抗体结合(包括S蛋白NTD的总抗体和中和抗体，RBD的总抗体和中和抗体，以及其他总抗体和中和抗体)

(2)与(1)中免疫复合物与试剂中的NTD中和抗体接触，与样品中的 NTD中和抗体水平产生等效竞争关系，

(3)与(2)中生成的免疫复合物与试剂中的ACE2接触，与样品中的RBD 中和抗体水平产生等效竞争关系，产生信号，从而实现双中和表位的加成竞争，识别NTD中和抗体水平和RBD中和抗体水平的总和，相比传统方法，实现中和抗体更全面地检出。

本申请的各方面和实施方式将参照附图和以下实施例进行讨论。其他方面和实施方式对于本领域技术人员是清楚的。尽管本申请已经结合示例性实施方式进行了描述，很多等同修改和变化在给出本申请时对于本领域技术人员是清楚的。因而，本申请的示例性实施方式是示例性的，非限制性的。可以对所述实施方式做出多种变化，而不脱离本申请的宗旨和范围。

实施例1 NTD中和抗体固定于磁微粒

1.1将1um磁微粒和pH 5.0的0.1M MES缓冲液混合，混匀，放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒；接着在磁颗粒中加入MES缓冲液将磁珠充分悬起，按上述方法再进行分离并重悬。

1.2取洗涤好的磁颗粒，加入10mg/ml碳二亚胺(EDAC)在25℃反应30min，置于血液混匀仪上，中速混匀。

1.3加入NTD中和抗体(采用单细胞PCR技术从SARS-CoV-2感染者恢复后的外周血中筛选获得，购自广东菲鹏生物有限公司)，在25℃避光反应3h，得到包被产物；加入淬灭缓冲液(10mM PBS、1g/100ml BSA、40mM甘氨酸， pH为7.4)在25℃避光反应1h以终止封闭反应，离心收集固定于磁微粒的抗体或抗原。NTD中和抗体也可以用GenBank:MT712309.1(L链)和GenBank:MT712296.1(H链)的序列。

实施例2 ACE2连接标记物

取人ACE2，超滤离心，置换为pH 5.0的0.1M MES缓冲液，离心，然后加入吖啶酯，混匀后进行标记(标记的温度为37℃，时间为4h)；标记反应结束后，加入封闭缓冲液(pH 8.0的10％BSA缓冲液为封闭缓冲液)，进行封闭(1h)；封闭后超滤离心，除去未偶联的吖啶酯，超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存，用于试剂配制。

实施例3含SARS-COV-2S1蛋白的稀释液配置

S1蛋白购自广东菲鹏生物有限公司，用100mmol/L PB，0.1％150mmol/L NaCl，0.1％proclin-300，2mmol/L EDTA*2Na，0.1％BSA，pH6.0的缓冲液配置 SARS-COV-2S1蛋白浓度为1.0ug/mL的稀释液。

对比例1现有的替代病毒中和测试方法试剂制备

试剂1：按上述的实施例1制备ACE2包被磁珠试剂。

试剂2：按上述的实施例2制备RBD标记吖啶酯的标记试剂。

测试例1

方案1：以假病毒中和实验方法对样本进行赋值，方法参考文献Protocol andReagents for Pseudotyping Lentiviral Particles with SARS-CoV-2 Spike Proteinfor Neutralization Assays中的测试方法。

方案2：现有的替代病毒中和测试：以半自动化学发光免疫分析仪(Thermo) 为检测工具，方法学模式为竞争法，样本量50uL，50ul磁珠包被的ACE2 (0.25mg/ml),40ul吖啶酯标记的RBD标记液(1ug/ml)。反应杯中加入样品 50ul，再加入50ul磁珠包被的ACE2(0.25mg/ml)和40ul吖啶酯标记的RBD 标记液(1ug/ml)，37℃反应15min，检测发光值。

方案3：本发明测试：以半自动化学发光免疫分析仪(Thermo)为检测工具，方法学模式为双竞争法。反应杯中加入样品50ul，再加入50ul含SARS-COV-2S1 蛋白的稀释液(实施例3)，37℃孵育30min，再加入50ul的磁珠包被的NTD 中和抗体(0.25mg/ml)和40ul吖啶酯标记的ACE2(1ug/ml)，37℃孵育15min，检测发光值。

测试结果

使用4种样品检测本发明的可行性，样本1：PBS(阴性质控品)、样本2： NTD中和抗体的样品、样本3：G3抗体的样品(G3是RBD中和抗体)、样本 4：样本2和样本3的混合样品。

结果如下表所示：

注：抑制率＝1-样本检测信号/阴性质控品检测信号。

结论分析：从上表数据可以看出，方案2仅能够检出阻断RBD的中和抗体，而对NTD的中和抗体不能检测出来，本发明的方案3不仅能够检出RBD中和抗体还能够检测出NTD的中和抗体。此外，相较于现有技术方案，本发明方案对RBD中和抗体(G3)的检测抑制率由25.9％提升到46.9％，对混合样本检测抑制率由27％提升到69.9％，提示了更高的检测灵敏度。

实施例4包被ACE2和标记NTD中和抗体方案测试

4.1磁微粒固定

将磁微粒洗涤，重悬于MES缓冲液中，加入碳二亚胺(EDAC)反应，置于血液混匀仪上中速混匀；加入人ACE2(购自广东菲鹏生物有限公司)，室温避光反应，得到包被产物；加入淬灭缓冲液在室温避光反应以终止封闭反应，收集固定于磁微粒的ACE2。

4.2连接吖啶标记物

取NTD中和抗体重悬于MES缓冲液中，然后加入吖啶酯，混匀后进行标记，标记反应结束后，加入10％BSA封闭；离心，除去未偶联的吖啶酯，收集 NTD中和抗体吖啶标记物。

4.3检测

以半自动化学发光免疫分析仪(Thermo)为检测工具，反应杯中加入样品，含SARS-COV-2S1蛋白的稀释液(实施例3)，37℃孵育充分反应，加吖啶酯标记的NTD中和抗体，37℃孵育充分反应，再加入磁珠包被的的ACE2，37℃孵育充分反应，检测发光值。

本实施例与方案3效果相当，也可以到达上述的同时检NTD和RBD的中和抗体和提高灵敏度的效果。

实施例5

以半自动化学发光免疫分析仪(Thermo)为检测工具，反应杯中加入样品，含SARS-COV-2S1蛋白的稀释液(实施例3)，磁珠包被的NTD中和抗体，37℃孵育充分反应，再加入吖啶酯标记的ACE2，37℃孵育充分反应，检测发光值。

本实施例与方案3效果相当，也可以到达上述的同时检NTD和RBD的中和抗体和提高灵敏度的效果。

实施例6基于本发明的方法制备胶体金层析试剂盒

6.1.胶体金的制备

胶体金溶液通过如下方法制备：向煮沸的纯化水中添加终浓度为万分之四的1％氯金酸溶液，继续煮沸3min，加0.1M的柠檬酸钠(按每100ml氯金酸溶液中添加580μl的量)，继续搅拌加热10min，冷却至室温，即制备出胶体金溶液，2-8℃保存备用。

6.2.胶体金标记

采用人ACE2蛋白，其连接胶体金的步骤如下：向胶体金溶液中添加K2CO3，向调好pH的溶液中添加人ACE2，偶联5min，向其中添加10％的BSA终止偶联反应；离心之后弃上清，沉淀复溶后2-8℃保存备用。

6.3.结合垫的制备

将连接了胶体金的ACE2溶液按照10％稀释比例稀释，并铺匀在玻璃纤维上，放置于37℃干燥房干燥过夜，得结合垫。

6.4.层析膜制备

T线包被：NTD中和抗体稀释至1.0mg/ml，使用喷金滑膜仪包被于硝酸纤维素膜上，放置于37℃烘箱干燥2h以上，得层析膜。

6.5样品垫处理

用1XPBST将SARS-COV-2S蛋白(购自广东菲鹏生物有限公司)稀释到 1ug/ml，铺在样品垫上，37度烘干1h待用。

6.6组装

将上述样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫依次搭接组装于被衬板上，裁切成2.7mm，制成相应的检测组件。

检测方法：将待测样本加载到样品垫上。

实施例7

参照实施6的方法，不同点在于将SARS-COV-2S蛋白配置成稀释液。检测时稀释液与样品接触后同时加载到样品垫上。

对比例2 ACE2竞争法检中和抗体

1.胶体金标记

胶体金制备同实施例6。对RBD抗原(购自自广东菲鹏生物有限公司)标金，向胶体金溶液中添加K

2.结合垫的制备

将连接了胶体金的RBD溶液按照10％稀释比例稀释，并铺匀在玻璃纤维上，放置于37℃干燥房干燥过夜，得结合垫。

3.层析膜制备

T线包被：人ACE2蛋白稀释至0.8mg/mL，使用喷金滑膜仪包被于硝酸纤维素膜上，放置于37℃烘箱干燥2h以上，得层析膜。

4.组装

将上述样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫依次搭接组装于被衬板上，裁切成2.7mm，制成相应的检测组件。

5.检测方法：将待测样本加载到样品垫上。

结果：实施例6和实施例7与对比例2相比都能有更好的中和抑制效率，以及能够检测RBD和NTD中和抗体，而对比例2无法检出NTD中和抗体。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

本领域技术人员通过理解本发明应当能够清楚本发明能够补充检测NTD中和抗体的原理是在于本发明改进设计的反应原理上实现的，通过样品中的中和抗体和含有RBM及NTD结构域的蛋白中的RBD区和ACE2构成第一竞争反应，可以检测出RBD的中和抗体；通过样品中的中和抗体和含有RBM及NTD结构域的蛋白中的NTD区和NTD中和抗体构成第二竞争反应，可以检测出NTD中和抗体(如图1所示)，当然这里的第一、第二仅为了方便理解不同的竞争反应没有顺序上的限定，可以互换。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。