一种快速检测人间充质干细胞IDO1活性的实验方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，更具体的涉及一种快速检测人间充质干细胞IDO1活性的实验方法。

背景技术

人间充质干细胞，是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性——自我更新和多向分化能力，在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。现阶段的应用中，人间充质干细胞的免疫调控功能已被视为其重要的关键作用。而人间充质干细胞在发挥免疫作用的时候也时与各种免疫细胞相互作用或者分泌不同的活性分子来发挥其免疫作用。目前，认为吲哚胺2,3-双加氧酶1(indoleamine2,3-dioxygenase1,IDO1)是介导人间充质干细胞免疫调控功能的重要活性因子之一，检测人间充质干细胞分泌的哚胺2,3-双加氧酶1活性是反映人间充质干细胞免疫调控功能的重要方法。

但是在检测吲哚胺2,3-双加氧酶1活性的同时需要通过对人间充质干细胞的培养，现阶段对人间充质干细胞的培养过程中存在因为细胞接种密度过高导致细胞贴壁严重等现象，影响检测结果，导致对人间充质干细胞的免疫调控功能评价存在误差。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的第一方面提供了一种快速检测人间充质干细胞IDO1活性的实验方法，包括以下步骤：

S1：人间充质干细胞培养；

S2：取上清液检测吲哚胺2，3-双加氧酶1活性；

S1步骤人间充质干细胞的培养在MM3培养基进行；

S1步骤所述的人间充质干细胞培养包括以下步骤：

1）人间充质干细胞在MM3培养基培养20-36小时；

2）然后将部分培养基替换为含γ干扰素的MM3培养基培养，另一部分更换为MM3培养基培养，继续进行20-36小时；

含γ干扰素的MM3培养基和MM3培养基培养的体积比为1：（0.5-2）；

γ干扰素在MM3培养基中的质量浓度为5ng/mL-100ng/mL。

作为一种优选的技术方案，MM3培养基的配置成份包括血清替代物和间充质干细胞无血清培养基。

作为一种优选的技术方案，所述的血清替代物和间充质干细胞无血清培养基的体积比为0.5~1：18~21。

作为一种优选的技术方案，S1步骤所述的人间充质干细胞培养的条件设置为：温度为35.5-38.0℃，二氧化碳体积浓度为1-10%。

作为一种优选的技术方案，S1步骤所述的人间充质干细胞培养的条件设置为：温度为37.0℃，二氧化碳体积浓度为5%。

作为一种优选的技术方案，S2步骤包括犬尿氨酸标准溶液的配置。

有益效果：经本申请研发的快速检测人间充质干细胞IDO1活性的实验方法具有以下优点：

1.通过对人间充质干细胞培养方法的改进和优化，解决了细胞之前高密度接种出现的细胞贴壁、数量减少等现象的出现，进而提高了检测结果准确性，提升了对人间充质干细胞免疫调控功能的准确预估与评价；

2.通过对人间充质干细胞培养基组成成份的大量创造性实验，选择的培养基中避免了污染和细菌等出现，保证了细胞的生长情况；

3.通过犬尿氨酸溶液、三氯乙酸溶液、二甲氨基苯甲醛溶液的确定，及其质量浓度的选择，可以保证本申请的测试结果重复性高、稳定性高，进一步提升对人间充质干细胞功能的评价准确性。

附图说明

图1为本发明实施例1，S1步骤中步骤1）细胞培养24小时后图片；

图2为本发明实施例1，S1步骤中步骤2）更换培养基后细胞培养24小时后图片。

具体实施方式

参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。

如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。

说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。

此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。

为了解决上述问题，本发明的第一方面提供了一种快速检测人间充质干细胞IDO1活性的实验方法，包括以下步骤：

S1：人间充质干细胞培养；

S2：取上清液检测吲哚胺2，3-双加氧酶1活性；

S1步骤人间充质干细胞的培养在MM3培养基进行；

S1步骤所述的人间充质干细胞培养包括以下步骤：

1）人间充质干细胞在MM3培养基培养20-36小时；

2）然后将部分培养基替换为含γ干扰素的MM3培养基培养，另一部分更换为MM3培养基培养，继续进行20-36小时；

含γ干扰素的MM3培养基和MM3培养基培养的体积比为1：（0.5-2）；

γ干扰素在MM3培养基中的质量浓度为5ng/mL-100ng/mL。

在一些优选的实施方式中，含γ干扰素的MM3培养基和MM3培养基培养的体积比为1：1。

在一些优选的实施方式中，MM3培养基的配置成份包括血清替代物和间充质干细胞无血清培养基。

血清替代物，型号EPAGMP-500，购于EliteCell生物医药集团公司；间充质干细胞无血清培养基，MSC NutriStem

在一些优选的实施方式中，所述的血清替代物和间充质干细胞无血清培养基的体积比为0.5~1：18~21。

在一些优选的实施方式中，所述的血清替代物和间充质干细胞无血清培养基的体积比为0.5~0.8：18~21。

在一些优选的实施方式中，所述的血清替代物和间充质干细胞无血清培养基的体积比为1：36。

在一些优选的实施方式中，所述的血清替代物和间充质干细胞无血清培养基的体积比为1：30。

在一些优选的实施方式中，所述的血清替代物和间充质干细胞无血清培养基的体积比为1：21。

在一些优选的实施方式中，所述的血清替代物和间充质干细胞无血清培养基的体积比为1：18。

在一些优选的实施方式中，S1步骤所述的人间充质干细胞培养包括以下步骤：

1）人间充质干细胞在MM3培养基培养24小时；

2）然后将一半培养基替换为含γ干扰素的MM3培养基培养，另一半更换为MM3培养基培养，继续进行24小时。

在实验过程中，申请人经过大量创造性实验探究得到，在人间充质干细胞培养过程中，首先采用MM3培养基培养24小时，然后采用一半含γ干扰素（IFNγ）的MM3培养基培养，一半为MM3培养基培养再继续培养24小时的培养方式，可以解决在细胞培养过程中出现的细胞贴壁，细胞数量减少等现象，从而避免了测试数据存在差异。另外，申请人在实验过程中发现，本申请提供的人间充质干细胞吲哚胺2，3-双加氧酶1活性的实验方法可以减少多次细胞培养，减少细胞培养的成本，提升实验数据的稳定性，避免多次重复实验，减少了实验多次重复进行导致的人力、物力的浪费。

在一些优选的实施方式中，γ干扰素在MM3培养基中的质量浓度为5ng/mL-100ng/mL。

在一些优选的实施方式中，γ干扰素在MM3培养基中的质量浓度为5ng/mL-50ng/mL。

在一些优选的实施方式中，γ干扰素在MM3培养基中的质量浓度为5ng/mL-20ng/mL。

在一些优选的实施方式中，γ干扰素在MM3培养基中的质量浓度为10ng/mL。

在本申请，所述的含γ干扰素的MM3培养基为：0.4mL，孔板中加入MM3培养基和γ干扰素母液，使MM3培养基中γ干扰素的质量浓度为10ng/mL即可。γ干扰素母液的浓度不做规定。

在一些优选的实施方式中，S1步骤所述的人间充质干细胞培养的条件设置为：温度为35.5-38.0℃，二氧化碳体积浓度为1-10%。

在一些优选的实施方式中，S1步骤所述的人间充质干细胞培养的条件设置为：温度为37.0℃，二氧化碳体积浓度为5%。

在一些优选的实施方式中，S2步骤包括犬尿氨酸标准溶液的配置。

在一些优选的实施方式中，犬尿氨酸标准溶液的摩尔浓度为500μmol/L。

在一些优选的实施方式中，所述的犬尿氨酸标准溶液的配置方法包括以下步骤：

称取犬尿氨酸母液与超纯水混合，配置成摩尔浓度为500μmol/L的犬尿氨酸标准溶液。

在一些优选的实施方式中，三氯乙酸溶液的质量浓度为30%。

在一些优选的实施方式中，对二甲氨基苯甲醛溶液的质量浓度为2%。

犬尿氨酸kynurenine，古武弥四郎、岩尾次郎（1931）在饲以色氨酸的兔尿中发现L-型犬尿氨酸，证明是色氨酸的代谢中间产物。

本申请中犬尿氨酸母液购于上海麦克林试剂官网；无菌水购于美国Peprotech公司。

在一些优选的实施方式中，S2步骤所述的取上清液检测吲哚胺2，3-双加氧酶1活性的具体操作包括以下步骤：

取培养后的上清，离心，取160μL上清与40μL质量浓度为30%三氯乙酸溶液反应，反应后离心，取上清和质量浓度为2%对二甲氨基苯甲醛溶液等体积混合，静置后检测492nm吸光度值。同时用犬尿氨酸标准液，与质量浓度2%对二甲氨基苯甲醛溶液等体积混合，静置后检测492nm吸光度值。

质量浓度为30%三氯乙酸溶液的配置方法包括以下步骤：

称取1.5g三氯乙酸加入3 mL升超纯水中，涡旋混匀，使三氯乙酸充分溶解，补加超纯水，定容到5 mL，得到质量浓度为30%三氯乙酸溶液。

质量浓度2%对二甲氨基苯甲醛溶液的配置方法包括以下步骤：

称取0.2g对二甲氨基苯甲醛，与10mL冰醋酸涡旋混匀，得到质量浓度为2%的对二甲氨基苯甲醛溶液。

三氯乙酸（TAC）、对二甲氨基苯甲醛（PDAB）购于上海麦克林试剂官网；无菌水购于美国Peprotech公司；冰醋酸购于国药集团。

在本申请中，申请人发现通MM3培养基培养的人间充质干细胞较含胎牛血清的培养基得到的间充质干细胞的生长条件更加稳定，在测试吲哚胺2，3-双加氧酶活性的时候可以避免杂质或者细菌的感染，尤其在血清替代物和间充质干细胞无血清培养基的体积比为0.5~1：18~21时，培养后的细胞在检测吲哚胺2，3-双加氧酶1活性时得到的数据具有稳定、重复性好的特点。

下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售得到的。

实施例

实施例1

一种快速检测人间充质干细胞IDO1活性的实验方法，包括以下步骤：

S1：人间充质干细胞培养：

1）人间充质干细胞在MM3培养基培养24小时；

2）然后将一半培养基替换为含γ干扰素的MM3培养基培养，另一半更换为MM3培养基培养，继续进行24小时；

S2：取上清液检测吲哚胺2，3-双加氧酶1活性：

取培养后的上清，离心，取160μL上清与40μL质量浓度为30%三氯乙酸溶液反应，反应后离心，取上清和质量浓度为2%对二甲氨基苯甲醛溶液等体积混合，静置后检测492nm吸光度值。同时用犬尿氨酸标准液，与质量浓度2%对二甲氨基苯甲醛溶液等体积混合，静置后检测492nm吸光度值。

所述的含γ干扰素的MM3培养基为：0.4mL孔板中加入MM3培养基和γ干扰素母液，使MM3培养基中γ干扰素的质量浓度为10ng/mL即可。γ干扰素母液的浓度不做规定。

S1步骤所述的人间充质干细胞培养的条件设置为：温度为37.0℃，二氧化碳体积浓度为5%。

犬尿氨酸标准溶液的配置方法包括以下步骤：

称取犬尿氨酸母液与超纯水混合，配置成摩尔浓度为500μmol/L的犬尿氨酸标准溶液。

质量浓度为30%三氯乙酸溶液的配置方法包括以下步骤：

称取1.5g三氯乙酸加入3 mL升超纯水中，涡旋混匀，使三氯乙酸充分溶解，补加超纯水，定容到5 mL，得到质量浓度为30%三氯乙酸溶液。

质量浓度2%对二甲氨基苯甲醛溶液的配置方法包括以下步骤：

称取0.2g对二甲氨基苯甲醛，与10mL冰醋酸涡旋混匀，得到质量浓度为2%的对二甲氨基苯甲醛溶液。

MM3培养基的配置成份包括血清替代物和间充质干细胞无血清培养基，血清替代物和间充质干细胞无血清培养基的体积比为1：30。

血清替代物，型号EPAGMP-500，购于EliteCell生物医药集团公司；间充质干细胞无血清培养基，MSC NutriStem

实施例2

一种快速检测人间充质干细胞IDO1活性的实验方法，包括以下步骤：

S1：人间充质干细胞培养：

1）人间充质干细胞在MM3培养基培养24小时；

2）然后更换MM3培养基培养，继续进行24小时；

S2：取上清液检测吲哚胺2，3-双加氧酶1活性：

取培养后的上清，离心，取160μL上清与40μL质量浓度为30%三氯乙酸溶液反应，反应后离心，取上清和质量浓度为2%对二甲氨基苯甲醛溶液等体积混合，静置后检测492nm吸光度值。同时用犬尿氨酸标准液，与质量浓度2%对二甲氨基苯甲醛溶液等体积混合，静置后检测492nm吸光度值。

S1步骤所述的人间充质干细胞培养的条件设置为：温度为37.0℃，二氧化碳体积浓度为5%。

犬尿氨酸标准溶液的配置方法包括以下步骤：

称取犬尿氨酸母液与超纯水混合，配置成摩尔浓度为500μmol/L的犬尿氨酸标准溶液。

质量浓度为30%三氯乙酸溶液的配置方法包括以下步骤：

称取1.5g三氯乙酸加入3 mL升超纯水中，涡旋混匀，使三氯乙酸充分溶解，补加超纯水，定容到5 mL，得到质量浓度为30%三氯乙酸溶液。

质量浓度2%对二甲氨基苯甲醛溶液的配置方法包括以下步骤：

称取0.2g对二甲氨基苯甲醛，与10mL冰醋酸涡旋混匀，得到质量浓度为2%的对二甲氨基苯甲醛溶液。

MM3培养基的配置成份包括血清替代物和间充质干细胞无血清培养基，血清替代物和间充质干细胞无血清培养基的体积比为1：30。

血清替代物，型号EPAGMP-500，购于EliteCell生物医药集团公司；间充质干细胞无血清培养基，MSC NutriStem

实施例3

一种快速检测人间充质干细胞IDO1活性的实验方法，包括以下步骤：

S1：人间充质干细胞培养：

1）人间充质干细胞在MM3培养基培养24小时；

2）然后培养基替换为含γ干扰素的MM3培养基培养，继续进行24小时；

S2：取上清液检测吲哚胺2，3-双加氧酶1活性：

取培养后的上清，离心，取160μL上清与40μL质量浓度为30%三氯乙酸溶液反应，反应后离心，取上清和质量浓度为2%对二甲氨基苯甲醛溶液等体积混合，静置后检测492nm吸光度值。同时用犬尿氨酸标准液，与质量浓度2%对二甲氨基苯甲醛溶液等体积混合，静置后检测492nm吸光度值。

所述的含γ干扰素的MM3培养基为：0.4mL孔板中加入MM3培养基和γ干扰素母液，使MM3培养基中γ干扰素的质量浓度为10ng/mL即可。γ干扰素母液的浓度不做规定。

S1步骤所述的人间充质干细胞培养的条件设置为：温度为37.0℃，二氧化碳体积浓度为5%。

犬尿氨酸标准溶液的配置方法包括以下步骤：

称取犬尿氨酸母液与超纯水混合，配置成摩尔浓度为500μmol/L的犬尿氨酸标准溶液。

质量浓度为30%三氯乙酸溶液的配置方法包括以下步骤：

称取1.5g三氯乙酸加入3 mL升超纯水中，涡旋混匀，使三氯乙酸充分溶解，补加超纯水，定容到5 mL，得到质量浓度为30%三氯乙酸溶液。

质量浓度2%对二甲氨基苯甲醛溶液的配置方法包括以下步骤：

称取0.2g对二甲氨基苯甲醛，与10mL冰醋酸涡旋混匀，得到质量浓度为2%的对二甲氨基苯甲醛溶液。

MM3培养基的配置成份包括血清替代物和间充质干细胞无血清培养基，血清替代物和间充质干细胞无血清培养基的体积比为1：30。

血清替代物，型号EPAGMP-500，购于EliteCell生物医药集团公司；间充质干细胞无血清培养基，MSC NutriStem

实施例4

一种快速检测人间充质干细胞IDO1活性的实验方法，包括以下步骤：

S1：人间充质干细胞培养：人间充质干细胞在MM3培养基培养48小时；

S2：取上清液检测吲哚胺2，3-双加氧酶1活性：

取培养后的上清，离心，取160μL上清与40μL质量浓度为30%三氯乙酸溶液反应，反应后离心，取上清和质量浓度为2%对二甲氨基苯甲醛溶液等体积混合，静置后检测492nm吸光度值。同时用犬尿氨酸标准液，与质量浓度2%对二甲氨基苯甲醛溶液等体积混合，静置后检测492nm吸光度值。

S1步骤所述的人间充质干细胞培养的条件设置为：温度为37.0℃，二氧化碳体积浓度为5%。

犬尿氨酸标准溶液的配置方法包括以下步骤：

称取犬尿氨酸母液与超纯水混合，配置成摩尔浓度为500μmol/L的犬尿氨酸标准溶液。

质量浓度为30%三氯乙酸溶液的配置方法包括以下步骤：

称取1.5g三氯乙酸加入3 mL升超纯水中，涡旋混匀，使三氯乙酸充分溶解，补加超纯水，定容到5 mL，得到质量浓度为30%三氯乙酸溶液。

质量浓度2%对二甲氨基苯甲醛溶液的配置方法包括以下步骤：

称取0.2g对二甲氨基苯甲醛，与10mL冰醋酸涡旋混匀，得到质量浓度为2%的对二甲氨基苯甲醛溶液。

MM3培养基的配置成份包括血清替代物和间充质干细胞无血清培养基，血清替代物和间充质干细胞无血清培养基的体积比为1：30。

血清替代物，型号EPAGMP-500，购于EliteCell生物医药集团公司；间充质干细胞无血清培养基，MSC NutriStem

实施例5

一种快速检测人间充质干细胞IDO1活性的实验方法，其具体实施方式同实施例1，与实施例1不同的是S1步骤所述的人间充质干细胞培养的条件设置为：温度为37.0℃，二氧化碳体积浓度为10%。

实施例6

一种快速检测人间充质干细胞IDO1活性的实验方法，其具体实施方式同实施例1，与实施例1不同的是血清替代物和间充质干细胞无血清培养基的体积比为1：50。

实施例7

一种快速检测人间充质干细胞IDO1活性的实验方法，其具体实施方式同实施例1，与实施例1不同的是对二甲氨基苯甲醛溶液的质量浓度为5%。

实施例8

一种快速检测人间充质干细胞IDO1活性的实验方法，其具体实施方式同实施例1，与实施例1不同的是三氯乙酸溶液的质量浓度为10%。

性能测试：

1.实验结果稳定测试：将本申请实施例1-8提供的检测人间充质干细胞吲哚胺2，3-双加氧酶1活性的实验方法进行实验结果稳定性测试，检测实验重复进行五次，记录最大值和最小值之间的差值，并将结果统计于下表1。

表1：

通过以上性能测试结果显示，经本申请提供的检测人间充质干细胞吲哚胺2，3-双加氧酶1活性的实验方法平行实验数据相差较小，说明实验结果稳定性高。

2.细胞培养情况：将实施例1-4培养的人间充质干细胞在显微镜下进行观察，判断细胞的粘连、贴壁现象，规定，细胞分散均匀、无贴壁现象的记为优；出现贴壁、粘连、团聚现象的记为良；出现严重贴壁、团聚、粘连现象的记为差，并将结果统计于下表2。

表2：

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。