一种烟草NUDIX水解酶基因及其应用

技术领域

本发明属于烟草基因工程技术领域，具体涉及一种烟草NUDIX水解酶基因及其应用。

背景技术

烟草作为一种重要的经济作物，其烟叶品质和安全性一直是研究人员关注的重点。淀粉是烟叶中重要的储能物质，是烟叶中糖类物质的重要组成部分。成熟的鲜烟叶中淀粉含量高达40％左右，经调制后，大部分淀粉降解为还原糖，但仍有部分留在烟叶中。淀粉对烟叶品质影响巨大，已有的研究认为，杂气与烟叶淀粉含量呈极显著正相关，也就是烟叶淀粉含量越大，杂气越多。目前，我国烤烟中淀粉含量(质量分数)约为4％～6％，而国外优质烤烟淀粉含量仅为1％～2％。烤后烟叶淀粉残留量过高已成为制约国内烟叶质量提高的重要因素之一。因此，烟草中影响淀粉含量的基因功能的研究将为烟叶品质改善、烟草品种遗传改良提供理论支持，对提高烟草产品品质具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种烟草NUDIX水解酶基因及其应用，以为解决烤烟中淀粉含量过高而影响烟草产品品质的问题，从而为烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定基础。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种烟草NUDIX水解酶基因，碱基序列具体如SEQ ID NO.1所示，含有813个碱基，命名为NtNUDX14。

进一步的，烟草NUDIX水解酶基因，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由270个氨基酸残基组成。

进一步的，烟草NUDIX水解酶基因的PCR扩增制备方法，包括如下步骤：

(1)提取基因组，并反转录为cDNA备用；

(2)设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：

NtNUDX14-F：5’-GCCACGTTATGGACTTCC-3’，

NtNUDX14-R：5’-GTATGTTCTTTAACCATTGCCTG-3’。

进一步的，在步骤(1)中提取基因组时，以烟草品种红花大金元叶片为样品。

上述任一项的烟草NUDIX水解酶基因的应用，该基因表达的蛋白与植物叶片中淀粉含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中直链淀粉、支链淀粉和总淀粉含量明显降低。

进一步的，利用基因沉默技术或者基因超表达方法，通过调节烟草NUDIX水解酶NtNUDX14表达量，来调节控制烟叶中淀粉含量。

进一步的，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有NtNUDX14基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体或超表达载体，转化烟草，筛选获得淀粉含量变化的烟草新品种。

具体例如：利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)的技术，干扰NtNUDX14基因的表达使其沉默，NtNUDX14基因沉默植株中淀粉含量显著下降，进而获得淀粉含量下降的植物新品种。

本发明的有益效果是：

本申请中，通过对特定烟草NUDIX水解酶NtNUDX14的初步研究，发现其与烟草淀粉含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中淀粉含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟叶品质调控、烟草新品种培育提供一定的应用基础和参考借鉴。

附图说明

图1为与对照植株相比，NtNUDX14基因沉默植株中该基因的相对表达量；

图2为病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的淀粉含量比较。

具体实施方式

以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。

生物材料：

本氏烟草，一种本领域常用烟草材料，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵(10cm×10cm)中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等栽培管理。

下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体(tobaccorattle virus，TRV)，具体利用的TRV2(一种常用载体)带有卡那霉素筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoR I和BamH I等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因。

实验试剂：

LB液体培养基，1L含量中含有：10g细菌蛋白胨(bacteriological peptone)；10g氯化钠(NaCl)；5g酵母抽提物(yeast extract)，高温高压灭菌。

YEB液体培养基，1L含量中含有：5g牛肉浸膏(beef extract)；5g细菌蛋白胨(bacteriological peptone)；5g蔗糖(sucrose)；1g酵母抽提物(yeast extract)；2mL 1M硫酸镁(MgSO4)，高温高压灭菌。

1M 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)储备液：ddH

200mM乙酰丁香酮(Acetosyringone，As)储备液：二甲基亚砜(DSMO)溶解，-20℃储存备用。

实施例1

本实施例就烟草NtNUDX14基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。

(1)烟草NtNUDX14基因克隆

根据前期对于烟草基因组及相关NtNUDX14基因研究，选择特异编码序列为目标片段，设计PCR扩增用引物序列如下：

NtNUDX14-F：5’-GCCACGTTATGGACTTCC-3’，

NtNUDX14-R：5’-GTATGTTCTTTAACCATTGCCTG-3’。

以烟草红花大金元叶片(先提取基因组，再反转录为cDNA)的cDNA为模板，进行PCR扩增获得NtNUDX14基因。

PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，53℃退火15s，72℃延伸1min，34个循环后，72℃彻底延伸5min。

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。

(2)构建重组TRV2-NtNUDX14载体

将步骤(1)中的PCR扩增产物进行EcoRI、BamHI双酶切，同时对空载体TRV2进行EcoRI、BamHI双酶切，分别回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行连接。

将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/L Kan的LB固体培养基上，37℃过培养夜。

挑选阳性单菌落扩增后进一步进行PCR鉴定，并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体TRV2-NtNUDX14。

需要说明的是，烟草NtNUDX14基因，包括813个碱基，碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

烟草NUDIX水解酶蛋白NtNUDX14，包括270个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

在实施例1基础上，利用农杆菌介导的VIGS技术，进一步将所构建的重组TRV2-NtNUDX14载体转化了烟草植株，并就相关植物表型变化情况做了验证分析，具体实验过程简介如下。

(1)转化农杆菌

需要说明的是，参考实施例1操作及现有技术，同时制备了TRV2-GFP重组载体作为对照，具体转化过程为：

将TRV2-GFP(载体对照)及TRV2-NtNUDX14的阳性克隆质粒，分别通过电击转化方式转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，利用含50mg/L Kan和50mg/L Rif的YEB平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2d后，利用菌落PCR筛选带有目的基因的农杆菌。

(2)制备转染用菌液

将步骤(1)中筛选所得阳性农杆菌克隆在5mL的YEB液体培养基(含50mg/L Kan和50mg/L Rif)中，28℃、250rpm条件下培养过夜。

取50uL过夜培养物接种至50mL的YEB液体培养基(含50mg/L Kan)中，培养至OD

室温放置3h左右后，作为转染用菌液。

(3)瞬时转化

以3-4w(周)苗龄的本氏烟草叶片为实验材料，利用1mL规格注射器，将步骤(2)中所制备转染用菌液注射至烟草叶片中，注射后的烟草继续在人工培养箱内培养，观察表型变化。

进一步通过qRT-PCR对NtNUDX14基因表达情况进行了检测，结果如图1所示，可以看出，TRV2-NtNUDX14的侵染植株中，NtNUDX14的表达量显著降低，qRT-PCR引物如下：

NtNUDX14-F：5’-AAGGTTCCTGGCATTGTCTTT-3’，

NtNUDX14-R：5’-TGGTCATCATCCAACATTCCT-3’。

进一步地，对实验组(TRV2-NtNUDX14浸染植株)和对照组(TRV2-GFP浸染植株)中的叶片淀粉含量情况进行了检测(检测方法参照：格锐思生物的支链-直链-总淀粉含量试剂盒(分光光度法))，结果如图2所示。

从图2结果可以看出，实验组中直链淀粉、支链淀粉和总淀粉含量与对照组相比均有显著下降，总淀粉含量下降59.8％。这进一步表明，通过沉默NtNUDX14基因，可对烟草叶片中植物淀粉的含量进行调控，进而可为烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定一定技术基础。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 云南中烟工业有限责任公司

<120> 一种烟草NUDIX水解酶基因及其应用

<130> WPC211437

<141> 2021-05-25

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 813

<212> DNA

<213> 人工序列(NtNUDX14)

<400> 1

atgtcaacaa ccccaccttc tcaactcagc cacatcatca atcttccagc ccaactcgat 60

caacccgtta ccattgtcgc tgctcccggc gtctccgata cgcagaatgc tattgaatcc 120

tcattgttca agcagtggtt aaagaacata caaactgaag caggaattct ggctaatgga 180

gctatgtctc taagacaagt tcttattcag ggtgtagata tgtttggaaa gcgtttgggg 240

tttctaaagt tcaaagcaga tattattgat aaggagacgg gtcaaaaggt tcctggtatt 300

gtctttgcac ggggtccagc tgttgcagtg ctaatccttt tggattctga gggtgagacg 360

tatgctgtgc ttacagaaca ggttagggtc cctgttggga ggctaatttt ggaattgcca 420

gcaagaatgt tggatgatga ccaaggtgac tttgctggaa cagcagttcg agaggttgag 480

gaagaaactg gaatccacct gaatgttcat gatatggtcg acctcacagc gtttctcgac 540

acatcgactg ggggcagagt ttttccttct cctggtggct gtgatgagga gatcagtttg 600

tttctataca gaggaaatgt cagcaaagag aaaatccaac aactgcaagg gaaagaaact 660

ggactacgtg accatgggga gctgattaag gtgcatgtgg ttccatatga taaactatgg 720

cgtgccacag ctgatgcaaa agctctgacc gcaattgccc tctatgagat ggccaaaaga 780

gatgggctgc tgccttgctc gacgacaagt taa 813

<210> 2

<211> 270

<212> PRT

<213> 人工序列(NtNUDX14)

<400> 2

Met Ser Thr Thr Pro Pro Ser Gln Leu Ser His Ile Ile Asn Leu Pro

1 5 10 15

Ala Gln Leu Asp Gln Pro Val Thr Ile Val Ala Ala Pro Gly Val Ser

20 25 30

Asp Thr Gln Asn Ala Ile Glu Ser Ser Leu Phe Lys Gln Trp Leu Lys

35 40 45

Asn Ile Gln Thr Glu Ala Gly Ile Leu Ala Asn Gly Ala Met Ser Leu

50 55 60

Arg Gln Val Leu Ile Gln Gly Val Asp Met Phe Gly Lys Arg Leu Gly

65 70 75 80

Phe Leu Lys Phe Lys Ala Asp Ile Ile Asp Lys Glu Thr Gly Gln Lys

85 90 95

Val Pro Gly Ile Val Phe Ala Arg Gly Pro Ala Val Ala Val Leu Ile

100 105 110

Leu Leu Asp Ser Glu Gly Glu Thr Tyr Ala Val Leu Thr Glu Gln Val

115 120 125

Arg Val Pro Val Gly Arg Leu Ile Leu Glu Leu Pro Ala Arg Met Leu

130 135 140

Asp Asp Asp Gln Gly Asp Phe Ala Gly Thr Ala Val Arg Glu Val Glu

145 150 155 160

Glu Glu Thr Gly Ile His Leu Asn Val His Asp Met Val Asp Leu Thr

165 170 175

Ala Phe Leu Asp Thr Ser Thr Gly Gly Arg Val Phe Pro Ser Pro Gly

180 185 190

Gly Cys Asp Glu Glu Ile Ser Leu Phe Leu Tyr Arg Gly Asn Val Ser

195 200 205

Lys Glu Lys Ile Gln Gln Leu Gln Gly Lys Glu Thr Gly Leu Arg Asp

210 215 220

His Gly Glu Leu Ile Lys Val His Val Val Pro Tyr Asp Lys Leu Trp

225 230 235 240

Arg Ala Thr Ala Asp Ala Lys Ala Leu Thr Ala Ile Ala Leu Tyr Glu

245 250 255

Met Ala Lys Arg Asp Gly Leu Leu Pro Cys Ser Thr Thr Ser

260 265 270