抗炎症组合物

技术领域

本发明涉及能够治疗或预防由中性粒细胞引起的炎症的组合物。更具体来说，涉及一种药物组合物，其含有使溶菌酶与壳聚糖键合而成的复合物，用于治疗或预防由中性粒细胞引起的炎症。

背景技术

中性粒细胞是存在于血液中的多形核白细胞的一种，其从血管朝向炎症部位地在组织内迁移。迁移的中性粒细胞会在炎症部位吞噬异物。另外，中性粒细胞会被活化而生成活性氧(过氧化氢、羟基自由基等)并释放到细胞外，或将蛋白水解酶等颗粒成分释放到细胞外。该活性氧、颗粒成分具有较强的细胞毒作用，并具有抑制炎症反应的能力。另一方面，已知：如果由于在炎症部位蓄积并被活化的中性粒细胞而产生了过量的活性氧，则会对炎症部位以外的细胞组织引起损伤作用(不良影响)(非专利文献1～3)。迄今为止，对于该中性粒细胞引起的损伤作用，已经研究了使用氨基葡萄糖、植物精油来抑制中性粒细胞的过量的活化(非专利文献2和3)。但是，对于使溶菌酶与壳聚糖键合而成的复合物与中性粒细胞的关系，至今为止，尚无相关研究。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:国际公开WO2017/038872号小册子

专利文献2:国际公开WO2017/138476号小册子

专利文献3:日本特开2017-226615号

非专利文献

非专利文献1:太田安彦等、“关于TNF-α导致的中性粒细胞呼吸爆发反应”、生物资料分析Vol.35,No.4、2012年、第322页～第328页

非专利文献2:长冈功等、“氨基葡萄糖的中性粒细胞功能抑制作用及其机制”、炎症·再生Vol.22,No.5、2002年9月、第461页～第468页

非专利文献3:丸山奈保、安部茂、“植物精油的抗真菌·抗炎症效果～在真菌感染症治疗中的可能性～”J.Japan Association on Odor Enviroment、Vol.43,No.3、2012年、第199页～第210页

发明内容

本发明的目的在于，提供用于治疗或预防由中性粒细胞引起的炎症的药物组合物、治疗剂、预防剂、以及它们的制造方法。

本发明的目的还在于，使用含有使溶菌酶与壳聚糖键合而成的复合物的药物组合物，治疗或预防由中性粒细胞引起的炎症。

本发明的发明人等对于使溶菌酶与壳聚糖键合而成的复合物与中性粒细胞的关系进行了深入研究，结果发现：使溶菌酶与壳聚糖键合而成的复合物可以抑制炎症部位中的中性粒细胞的粘附反应。其结果是得出了如下结论，并完成了本发明：在炎症部位中，中性粒细胞过量地被活化，过量地产生活性氧，对于作为结果引起的炎症反应，通过对该炎症部位赋予使溶菌酶与壳聚糖键合而成的复合物，从而可以抑制该炎症反应。具体来说，本发明可以为以下的方式。

〔1〕一种药物组合物，含有使溶菌酶与壳聚糖键合而成的复合物，用于治疗或预防由中性粒细胞引起的炎症。

〔2〕根据上述〔1〕所述的药物组合物，其中，上述壳聚糖是分子量为1000Da～30000Da的水溶性壳聚糖。

〔3〕根据上述〔1〕或〔2〕所述的药物组合物，其中，上述药物组合物中，以0.01mg/ml～50mg/ml含有上述复合物。

〔4〕根据上述〔1〕～〔3〕中任1项所述的药物组合物，其中，上述药物组合物中，以0.001质量％～5.0质量％含有上述复合物。

〔5〕根据上述〔1〕～〔4〕中任1项所述的药物组合物，其中，进一步含有萜烯醇、脂肪酸和/或该脂肪酸的盐。

〔6〕根据上述〔1〕～〔4〕中任1项所述的药物组合物，其中，进一步含有碳原子数8～12的脂肪酸或该脂肪酸的盐。

〔7〕根据上述〔6〕所述的药物组合物，其中，上述脂肪酸为癸酸或月桂酸。

〔8〕根据上述〔1〕～〔7〕中任1项所述的药物组合物，其中，进一步含有萜烯醇，该萜烯醇为萜品烯-4-醇、桧木醇或牻牛儿醇。

〔9〕根据上述〔1〕～〔8〕中任1项所述的药物组合物，其中，由中性粒细胞引起的炎症为皮炎或脓皮症。

〔10〕一种使溶菌酶与壳聚糖键合而成的复合物的用途，是制造用于治疗或预防由中性粒细胞引起的炎症的药物组合物的用途。

根据本发明，可以提供用于治疗或预防由中性粒细胞引起的炎症的药物组合物、治疗剂、预防剂、以及它们的制造方法。

另外，可以使用含有使溶菌酶与壳聚糖键合而成的复合物的药物组合物，治疗或预防由中性粒细胞引起的炎症。

附图说明

图1为合成使溶菌酶与壳聚糖键合而成的复合物时的反应的示意图。

图2a为表示溶菌酶-壳聚糖复合物的浓度与中性粒细胞粘附率(％)的关系的图表。

图2b为表示癸酸的浓度与中性粒细胞粘附率(％)的关系的图表。

图3a为表示对不含溶菌酶-壳聚糖复合物和癸酸的、对照组的中性粒细胞用结晶紫进行染色后的显微镜照片。

图3b为表示对使用了溶菌酶-壳聚糖复合物0.2mg/ml和癸酸0.4mg/ml的混合物的情况的中性粒细胞用结晶紫进行染色后的显微镜照片。

图3c为表示对使用了溶菌酶-壳聚糖复合物0.2mg/ml的情况的中性粒细胞用结晶紫进行染色后的显微镜照片。

图3d为表示对使用了癸酸0.4mg/ml的情况的中性粒细胞用结晶紫进行染色后的显微镜照片。

图4为表示使用了各种被检物质的情况的中性粒细胞粘附率(％)的图表。

具体实施方式

＜药物组合物＞

本发明涉及一种药物组合物，其含有使溶菌酶与壳聚糖键合而成的复合物，用于治疗或预防由中性粒细胞引起的炎症。以下，对本发明进行具体说明。

“使溶菌酶与壳聚糖键合而成的复合物”是指使溶菌酶与壳聚糖通过例如美拉德反应等键合而成的复合物(参照图1)。通过使将溶菌酶与水溶性壳聚糖通过美拉德反应而键合，从而使溶菌酶中的大部分或全部的抗原结构被掩盖，因此具有即使人摄入溶菌酶-壳聚糖复合物也不易引起过敏的特征。除此以外，也可以使用交联剂，使溶菌酶与壳聚糖共价键合而得到上述复合物。

这里，“溶菌酶”是水解粘多糖类的酶，可优选使用来自鸡的溶菌酶、来自人的溶菌酶。

“壳聚糖”为以下的化学式(I)表示的聚-β1→4-氨基葡萄糖((C

该壳聚糖为水溶性。壳聚糖的分子量的上限例如为30000Da以下，更优选为25000Da以下，也可以是20000Da以下、18000Da以下、15000Da以下。另外，壳聚糖的分子量的下限没有特别限定，例如为1000Da以上，优选为5000Da以上，也可以是10000Da以上、12000Da以上。该壳聚糖的分子量的范围可以是上述任一上限值和下限值之间的范围，例如为1000Da～30000Da，优选为5000Da～20000Da，更优选为10000Da～15000Da。如果着眼于抗菌性，则分子量大的壳聚糖更为有利，如果着眼于制造的容易度，则分子量小的壳聚糖的溶解性和稳定性更良好，低分子量的壳聚糖更为有利。

作为上述交联剂，例如可举出胺反应性交联剂(例如烷氧基胺)、羰基反应性交联剂(例如肼化合物)、和巯基反应性交联剂等。

溶菌酶/壳聚糖的质量比例如为99/1～1/99，优选为90/10～10/90，更优选为80/20～20/80，进一步优选为60/40～40/60，特别优选为50/50。

作为具体的使溶菌酶与壳聚糖键合而成的复合物的制造方法，例如可举出如下的方法。首先，将上述质量比的溶菌酶与壳聚糖在水中混合溶解，以得到的水溶液中的溶菌酶和壳聚糖的合计质量为5～30质量％的方式进行制备。将得到的水溶液冻干，进行粉末化。使得到的粉末在例如50～80℃、优选为55～65℃的温度和例如50～80％、优选为60～70％的相对湿度的条件下，进行例如2～20天、更优选为7～14天的美拉德反应，从而可以制造本发明的使溶菌酶与壳聚糖键合而成的复合物。

可以使用各种公知的方法来确认本实施方式的溶菌酶-壳聚糖复合物是否生成，例如，可以通过将SDS(十二烷基硫酸钠，Sodium dodecyl sulfate)、SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺，Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide)聚丙烯酰胺电泳得到的板进行染色处理，来确认作为蛋白质-壳聚糖复合物的高分子物质的生成。

“中性粒细胞”是存在于血液中的多形核白细胞的一种，中性粒细胞从血管朝向炎症部位地在组织内迁移，在炎症部位吞噬异物。另外，中性粒细胞具有如下能力：被活化而生成活性氧(过氧化氢、羟基自由基等)并将该活性氧释放到细胞外，或将蛋白水解酶等颗粒成分释放到细胞外。另一方面，如果由于在炎症部位蓄积并被活化的中性粒细胞而过量地产生了活性氧，则会对炎症部位以外的细胞组织引起损伤作用(不良影响)(非专利文献1～3)。该中性粒细胞引起的损伤作用以炎症的形式表现出来的情况即为“由中性粒细胞引起的炎症”。因此，“由中性粒细胞引起的炎症”与由真菌、细菌等菌引起并产生的炎症不同。本发明的药物组合物可以有效地治疗和/或预防该“由中性粒细胞引起的炎症”。作为本发明的“由中性粒细胞引起的炎症”的具体的例子，例如可举出过敏性皮炎、特应性皮炎、脂溢性皮炎、剥脱性皮炎、淤滞性皮炎和接触皮炎等皮炎、牛皮癣、湿疹、以及脓皮症等。

这里，“治疗”除了包括将本发明的对象即炎症完全治愈的情况之外，还包括抑制炎症而降低严重程度的情况。“预防”除了包括没有本发明的对象即炎症的病史的情况之外，还包括在治愈本发明的对象即炎症后防止该炎症复发的情况。

本发明的药物组合物中，除了上述复合物之外，还可以任意包含1种以上的其它有效成分。作为其它有效成分，除了包含其自身作为有效成分发挥作用的成分之外，还包含其自身不作为有效成分发挥作用，但通过与本发明的有效成分即上述复合物并用来发挥效果的成分(助剂)。作为其它有效成分，例如可举出萜烯醇、脂肪酸和/或该脂肪酸的盐。通过添加这些萜烯醇、脂肪酸和/或该脂肪酸的盐，从而可以与本发明的复合物相配合而得到累加效果和协同效果。作为萜烯醇，例如可举出萜品烯-4-醇、桧木醇、牻牛儿醇和薄荷醇等。作为脂肪酸，例如可举出碳原子数8～12的脂肪酸，优选为癸酸(capric acid)或月桂酸。作为脂肪酸的盐，例如可举出钠盐、钾盐、镁盐和钙盐等。除此以外，作为该其它有效成分，还可以添加已知对由中性粒细胞引起的炎症有效果的、从柠檬草、留兰香、天竺葵、紫苏等得到的精油、和氨基葡萄糖。

本发明的药物组合物中，除了上述复合物之外，还可以任意包含1种以上的其它成分。作为其它成分，可以添加例如赋形剂、粘结剂、乳化剂、溶剂、粘合剂、崩解剂、增稠剂、润滑剂、着色剂、流化剂、保湿剂等添加剂。

作为保湿剂，例如可举出甘油、丁二醇、胶原蛋白、透明质酸和神经酰胺。

作为粘合剂，例如可举出纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素和羧甲基纤维素钠。

作为乳化剂，例如可举出卵磷脂、聚乙二醇(PG)、PG-氢化蓖麻油、甘油脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯和鲸蜡油等。

作为溶剂，例如可举出水、乙醇、1-丁醇、2-丁醇、1-丙醇、2-丙醇、1-戊醇等。

在本发明的药物组合物中，例如适宜地含有0.01mg/ml～50mg/ml的本发明的溶菌酶-壳聚糖复合物，优选含有0.01mg/ml～2mg/ml，更优选含有0.05mg/ml～1mg/ml，进一步优选含有0.1mg/ml～0.5mg/ml，特别优选含有0.2mg/ml～0.4mg/ml。另外，本发明的药物组合物中，例如适宜地含有0.001质量％～5.0质量％的其它有效成分，优选含有0.002质量％～0.2质量％，更优选含有0.005质量％～0.1质量％，进一步优选含有0.01质量％～0.05质量％，特别优选含有0.02质量％～0.04质量％。进而，其它成分需要根据各成分而适当调节适当的含量，例如适宜地含有0.1质量％～90质量％，优选含有1质量％～70质量％，更优选含有10质量％～50质量％。应予说明，本发明的药物组合物可以基本上为水等溶剂，例如在本发明的药物组合物中，适宜地含有95质量％以上的溶剂，优选含有98质量％以上，更优选含有99质量％以上，进一步优选含有99.5质量％以上。另外，在本发明的药物组合物中，例如适宜地含有0.001质量％～5质量％的月桂酸和癸酸(capric acid)这样的碳原子数8～12的脂肪酸或该脂肪酸的盐，优选含有0.005质量％～1质量％，更优选含有0.01质量％～0.5质量％，特别优选含有0.04质量％～0.2质量％。

[给药量、给药方式、给药方法]

本发明的药物组合物根据其剂型、给药对象、给药途径、对象疾病、症状等而不同，例如，在为对人体皮肤进行喷雾的喷雾剂的方式的情况下，一天给药量例如为0.1～20mg/kg体重，优选为0.2～10mg/kg体重，进一步优选为0.5～10mg/kg体重，该量期望以1天1次～数次(例如2次、3次、4次或8次)进行给药。该给药量除了可以适用于喷雾剂以外，还可以适用于以下说明的乳膏等其它的制剂中。

本发明的药物组合物可以是口服给药，也可以是非口服给药，它们的制剂化不需要特别的技术，可以使用通用的技术来进行制剂化。作为给药剂型，可举出乳膏、软膏、糊剂、液体剂、喷雾剂、凝胶剂、注射剂、片剂、栓剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、滴眼剂、眼软膏等，特别优选乳膏、软膏、糊剂、液体剂、喷雾剂。

本发明的药物组合物可以与上述给药方式匹配地选择适当的给药方法。给药方法可以是公知的给药方法，例如在乳膏的情况下，可以在炎症处以上述给药量涂布本发明的药物组合物。

＜治疗方法＞

另外，本发明可以包含：向受试者给予含有使溶菌酶与壳聚糖键合而成的复合物的药物组合物而用于抑制或预防由中性粒细胞引起的炎症的方法。

这里，“受试者”除人以外，还包含猫、狗、猴、牛、马等哺乳动物。

溶菌酶、壳聚糖等各自的定义、其它有效成分、其它成分、给药量、给药方式、给药方法等如上所述。

＜用途＞

另外，本发明可以包含：在用于治疗或预防由中性粒细胞引起的炎症的药物组合物的制造中的、使溶菌酶与壳聚糖键合而成的复合物的用途。

在用于治疗或预防由中性粒细胞引起的炎症的药物组合物的制造中，使溶菌酶与壳聚糖键合而成的复合物可以与复合物以外的该药物组合物的成分一并混合，成为该药物组合物。作为该混合方法，可以使用公知的方法，例如在液体剂的情况下，可以在水等溶剂中加入使溶菌酶与壳聚糖键合而成的复合物和上述任意的其它成分，进行混合，根据需要加入乳化剂并混合，制成分散剂或乳液，制备液体剂。

实施例

[试样的制备]

·中性粒细胞悬浮液

从血液采取中性粒细胞。具体来说，使用Polymorphprep(Cosmo Bio)，从由健康的人或狗采取的全血中分离中性粒细胞。将分离的中性粒细胞的试样以2000rpm离心分离约40分钟，之后，去除上清，将残渣移至添加有10质量％胎牛血清(Tissue CultureBiologicals,USA)的RPMI(SIGMA)培养基中，以细胞数为4×10

·活化标准液

将作为中性粒细胞的活化试剂的来自大肠杆菌的脂多糖(SIGMA Lot 12K4083)用预先添加有10质量％胎牛血清(Tissue Culture Biologicals,USA)的RPMI(SIGMA)培养基稀释，得到了来自大肠杆菌的脂多糖的质量相对于得到的活化标准液的容积为4μg/ml的活化标准液。

·本发明的药物组合物试样

作为使溶菌酶与壳聚糖键合而成的复合物(溶菌酶-壳聚糖复合物)，使用市售的LYZOX(注册商标、和兴滤清器科技株式会社制)。市售的LYZOX(注册商标)是以1：1的质量比包含来自鸡的溶菌酶和14000Da的水溶性壳聚糖的粉末。具体来说，将上述溶菌酶与水溶性壳聚糖在水中混合溶解，之后，通过使其冻干而制成粉末状，进一步在对于使美拉德反应完全结束而言是充分的温度、湿度和天数的条件下，通过进行美拉德反应，得到本发明中使用的溶菌酶-壳聚糖复合物(LYZOX(注册商标))。

[抗炎症效果的评价]

对于由中性粒细胞引起的炎症的抗炎症效果可以根据粘附在炎症部位的中性粒细胞的量来把握。即，如果在应用本发明的药物组合物后粘附在炎症部位的中性粒细胞的量减少，则本发明的药物组合物具有中性粒细胞粘附抑制效果。如果粘附在炎症部位的中性粒细胞的量减少，则由中性粒细胞引起而过量地产生的活性氧的量会减少，从而可以抑制由该活性氧引起的炎症反应。众所周知，在中性粒细胞粘附率与对中性粒细胞引起的炎症的抗炎作用之间，存在大致为线性的相关关系(例如可参照Naoshi Yakuwa,et.al."ANovel Neutrophil Adherent Test Effectively Reflects the Activated State ofNeutrophils",Microbiol.Immunol.1989；Vol.33(10),pages843-852)。

中性粒细胞粘附率如下求出：在不含溶菌酶-壳聚糖复合物和癸酸的对照组中，将对粘附于各孔的活化中性粒细胞进行定量而得的值设为100％，在各实施例和比较例的被检物质中也同样地对粘附于各孔的活化中性粒细胞进行定量，将所得的值与其进行比较，从而求出。

中性粒细胞粘附率(％)＝[各实施例和比较例的所粘附的活化中性粒细胞的定量值]/[对照组的所粘附的活化中性粒细胞的定量值]×100

具体的各实施例和比较例的实验方法和定量方法如下所示。

实施例1

本发明中，按下述的步骤评价该中性粒细胞粘附反应抑制能力。即，将作为溶菌酶-壳聚糖复合物的LYZOX(注册商标)用添加有10质量％胎牛血清(Tissue CultureBiologicals,USA)的RPMI(SIGMA)培养基稀释，制成被检物质。在96孔板的孔中，分别加入该被检物质50μl、上述活化标准液50μl、和上述人中性粒细胞悬浮液100μl。在5％CO

将如上述那样使用本发明的LYZOX(注册商标)(溶菌酶-壳聚糖复合物)进行试验的情况下的、LYZOX(注册商标)的浓度与中性粒细胞粘附率(％)的关系示于图2a。

比较例1

代替LYZOX(注册商标)而使用癸酸，除此以外与实施例1同样地重复试验，对粘附在96孔板的孔上的活化中性粒细胞进行定量。将如此使用癸酸进行试验的情况下的、癸酸的浓度与中性粒细胞粘附率(％)的关系示于图2b。

从图2a与图2b的对比可以理解，如果LYZOX(注册商标)(溶菌酶-壳聚糖复合物)的浓度上升，则中性粒细胞粘附率(％)会变低，可以认为LYZOX(注册商标)对由中性粒细胞引起的炎症具有抗炎症效果，另一方面，在使用癸酸的情况下，即使癸酸的浓度上升，中性粒细胞粘附率(％)也不会降低，可知不能期待癸酸对由中性粒细胞引起的炎症具有抗炎症效果。

实施例2

使用狗中性粒细胞悬浮液来作为中性粒细胞悬浮液，使用各种被检物质来作为被检物质，除此以外，重复与实施例1同样的试验，对粘附在96孔板的孔上的活化中性粒细胞进行定量。同时，对粘附在该96孔板的孔上的中性粒细胞(粘附细胞)用结晶紫进行染色，并用显微镜观察。使用的被检物质如下所述。

(a)：对照组(不含溶菌酶-壳聚糖复合物和癸酸)

(b)：溶菌酶-壳聚糖复合物0.2mg/ml(相对于被检物质整体的质量为0.02质量％)和癸酸0.4mg/ml(相对于被检物质整体的质量为0.04质量％)的混合物

(c)：溶菌酶-壳聚糖复合物0.2mg/ml(相对于被检物质整体的质量为0.02质量％)

(d)：癸酸0.4mg/ml(相对于被检物质整体的质量为0.04质量％)

对使用上述(a)～(d)的被检物质的情况下的、粘附在96孔板的孔上的中性粒细胞用结晶紫进行染色，将所得显微镜照片分别示于图3a～图3d。作为显微镜，可以使用奥林巴斯制的倒置系统显微镜MODEL IMT-2，观察倍率设为40倍。

另外，将使用上述(a)～(d)的被检物质的情况下的中性粒细胞粘附率(％)示于图4。

如图3a～图3d所示那样，可知：在图3a和图3d中，被结晶紫染色的中性粒细胞广泛地分布，但在图3b和图3c中，被结晶紫染色的中性粒细胞的分布受到抑制。另外，如图4所示那样，可知：(b)溶菌酶-壳聚糖复合物+癸酸和(c)溶菌酶-壳聚糖复合物相比于(a)对照组和(d)仅癸酸，中性粒细胞粘附率(％)得到显著抑制。