一种利用光源光谱调控布朗葡萄藻脂质组成的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物质能源领域，具体涉及到一种利用光源光谱调控布朗葡萄藻脂质组成的方法及其应用。

背景技术

虽然几乎所有的光合作用生物都含有叶绿素a，但不同的微藻含有不同的辅助色素，它们参与吸收不同波长的光，以帮助增加光能吸收和利用效率。微藻和蓝藻中的色素分为叶绿素、类胡萝卜素和藻胆蛋白三类。其中叶绿素是最重要的色素，在光合作用中起到捕光和/或电荷分离的作用，在对光能的吸收、传递和转化中起核心作用。所有光合色素都有一个大的双键共轭体系，在这些键中的离域电子激发之后，特定波长的光被吸收。绿藻主要通过叶绿素吸收光，叶绿素吸收450～475nm和630～675nm范围内的光能。类胡萝卜素在400～550nm范围内具有最大的光能吸收，藻胆蛋白吸收最大值在540～655nm之间。

不同的微藻在不同波长的光照条件下，可在一定程度上调整自身的光合系统，适应相应的光照条件，形成相对稳定的光合系统和光合能力。

与微藻脂质积累密切相关的途径可以概括为以下主要的五条途径：(1)光合作用过程中的CO2固定途径将无机碳转化为有机碳，此途径为脂质合成提供藻类生物量基础和最初始的碳通量。(2)从头合成脂肪酸的脂肪酸合成酶(FAS)途径，合成的饱和脂肪酸也可以进一步去饱和和延长以合成多不饱和脂肪酸。(3)三酰甘油(TAG)合成途径。(4)从头合成脂肪酸需要持续供应的乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，这些代谢物的生产途径也强烈影响脂质合成结果。(5)脂质积累的竞争途径，包括淀粉合成、金藻昆布多糖合成、蛋白质合成、甾醇合成等途径，以及脂肪酸的β氧化、脂滴降解等过程对于细胞脂质的积累都有影响。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种利用光源光谱调控布朗葡萄藻脂质组成的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种利用光源光谱调控布朗葡萄藻脂质组成的方法，包括，

通过布朗葡萄藻光能利用特征，使用单色光发光单元进行组合，形成组合光谱，用于调整布朗葡萄藻合成的脂肪酸组成和比例。

作为本发明所述利用光源光谱调控布朗葡萄藻脂质组成的方法的一种优选方案，其中：所述使用单色光发光单元进行组合，包括，

将峰值波长为660nm的单色红光发光单元、峰值波长为455nm的单色蓝光发光单元及其不同红蓝单色光组合，形成微藻培养的照光光源。

作为本发明所述利用光源光谱调控布朗葡萄藻脂质组成的方法的一种优选方案，其中：所述不同红蓝单色光组合，包括，

光源被设计成相对较低的光子密度，每个光源由7个发光单元组成，每个发光单元的工作功率为1瓦，因此每个光源的总功率为7瓦；

光源安装了不同的红色和蓝色发光单元组合，设计为n红+m蓝，定义为nRmB；

其中n表示红色发光单元的数量，m表示照明器中蓝色发光单元的数量，而n和m的和始终等于7。

作为本发明所述利用光源光谱调控布朗葡萄藻脂质组成的方法的一种优选方案，其中：所述nRmB，包括，0R7B、1R6B、2R5B、3R4B、4R3B、5R2B、6R1B和7R0B。

作为本发明所述利用光源光谱调控布朗葡萄藻脂质组成的方法的一种优选方案，其中：所述nRmB，包括，5R2B和4R3B。

作为本发明所述利用光源光谱调控布朗葡萄藻脂质组成的方法的一种优选方案，其中：所述光源的光子密度为78.21±3.15μmol·m

作为本发明所述利用光源光谱调控布朗葡萄藻脂质组成的方法的一种优选方案，其中：所述利用光源光谱调控布朗葡萄藻脂质组成，其方法包括，

将布朗葡萄藻在含150mLBG11培养基的250mL培养瓶中培养，温度25℃、80μmol·m

接种于新鲜培养基的藻细胞在25℃下以光照周期L/D为16h/8h转移至不同光照处理中进行培养，一天摇瓶两次，每个处理3个重复，培养28天。

作为本发明所述利用光源光谱调控布朗葡萄藻脂质组成的方法的一种优选方案，其中：所述利用光源光谱调控布朗葡萄藻脂质组成，其方法还包括，

微藻培养结束后，将藻液离心，取沉淀，用蒸馏水洗涤，-80℃冰箱中冻成固体，在冷冻干燥机中冷冻干燥24h，得干燥粉；

精确称取干燥藻粉，加蒸馏水，充分混匀后，加入甲醇∶氯仿混合液，剧烈振荡过夜，其中，甲醇∶氯仿体积比2∶1；

用超声波细胞破碎仪冰浴破碎，以150rpm振荡10min，离心，去除水层以及破碎的细胞层，在氯仿层中加入等体积的蒸馏水，摇匀，离心，收集氯仿层，转移至圆底烧瓶中，挥发，直到重量恒定，得总脂肪。

本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种利用光源光谱调控布朗葡萄藻脂质组成的方法制得的脂质产品。

本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种利用光源光谱调控布朗葡萄藻脂质组成的方法制得的脂质产品在制备生物柴油中的应用，包括，将脂质产品充分溶解于正己烷中，加入1/5体积的氢氧化钾甲醇溶液，充分混合20～30min后，加无水硫酸钠脱水，混匀后静置分层，所得上层为生物柴油和正己烷，分馏回用正己烷，余下产物即为生物柴油；其中，氢氧化钾甲醇溶液浓度以g/L计为10％。

本发明有益效果：

本发明涉及一种利用光源光谱调控布朗葡萄藻脂质组成的方法，将单色光进行适当组合，形成组合光谱，用于调控微藻脂质组成的方法，在根据布朗葡萄藻Botryococcusbrauni进行适当优化后实施，首次发现单色蓝光对其脂质生产有促进作用，可提高其合成的脂肪酸中C16:0、C18:0和C18:3(n-3)的比例；由此，可以通过调整布朗葡萄藻培养的照光光谱，改变其合成的脂肪酸组成和比例，提升其生物柴油质量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明实施例1中光源与培养室示意图。

图2为本发明实施例1中各光源的相对光谱图。

图3为本发明实施例1中各光源的CIE1976色度图。

图4为本发明实施例2中布朗葡萄藻Botryococcus brauni在不同光谱条件下的脂肪酸组成和比例对比图。

图5为本发明实施例3中组合单色光对布朗葡萄藻合成脂质生产生物柴油的十六烷值(CN)的影响对比图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明中布朗葡萄藻Botryococcus brauni购买于中国科学院淡水藻种库，产品编号为FACHB/357。

实施例1

(1)布朗葡萄藻Botryococcus brauni培养基采用BG11培养基：

布朗葡萄藻在含150mL BG11培养基的250mL培养瓶中培养，温度25℃、80μmol·m

培养的细胞每隔7d重复接种于新鲜的培养基中；接种于新鲜培养基的藻细胞在25℃下以16h/8h(L/D)的光照周期转移至不同光照处理中进行培养，一天摇瓶两次；每个处理3个重复，培养28天。

(2)微藻培养结束后，将100mL的藻液离心(4000rpm，10min，4℃)，取沉淀，用蒸馏水洗涤1次，转移至已称重的小玻璃瓶中，-80℃冰箱中冻成固体，在冷冻干燥机中冷冻干燥24h，得干燥粉。

(3)精确称取干燥藻粉10～50mg，加蒸馏水0.8mL，充分混匀后，加入3mL甲醇∶氯仿混合液(2∶1)，剧烈振荡过夜。用超声波细胞破碎仪冰浴破碎10min(破碎5s间隔3s，700w)，以150rpm振荡10min，离心(4000rpm，10min，4℃)，去除水层以及破碎的细胞层，在氯仿层中加入等体积的蒸馏水，摇匀，离心(4000rpm，10min，4℃)，收集氯仿层，转移至圆底烧瓶中，在60℃下挥发，直到重量恒定，得总脂肪。

(4)步骤(1)中的不同光照处理为：

以单色红光发光单元(峰值波长660nm)、单色蓝光发光单元(峰值波长455nm)及其不同红蓝单色光组合的形成微藻培养的照光光源，以全光谱白光光源作为对照，研究光谱质量对微藻脂质合成的影响。

为了避免可能的光饱和，在本项研究中，光源被设计成相对较低的光子密度。每个光源由7个发光单元组成，每个发光单元的工作功率为1瓦，因此每个光源的总功率为7瓦(1瓦×7)。

光源安装了不同的红色和蓝色发光单元组合，采用纸板容器(L×W×H＝25cm×25cm×35cm)作为培养环境，用锡箔纸将纸箱内壁包裹，保障内部的密闭性，防止光源的泄露，使得有限的能量能够被充分利用，顶部留有一个待放光源的孔

光源设计为n红+m蓝(nRmB)，其中n表示红色发光单元的数量，m表示照明器中蓝色发光单元的数量，而n和m的和始终等于7，所研究的组合包括0R7B、1R6B、2R5B、3R4B、4R3B、5R2B、6R1B和7R0B。

光源用植物光照分析仪检测，得到藻类养殖用光源的相对光谱图和CIE1976色度图，分别如附图2和附图3所示。

(5)将微藻置于装有不同光源的培养室中培养至静止期，收获微藻，提取脂质，进行甲酯化，并分析各脂肪酸组成和占比。

根据各光源的光谱属性和对应的脂肪酸甲酯的组成和比例，分析光谱条件对布朗葡萄藻脂肪酸组成和比例的影响，根据C16-C18脂肪酸占总脂肪酸的比例、以及饱和脂肪酸的比例，选择有利于生物柴油生产的光源光谱条件。

实施例2

称取2mg实施例1中脂质样品，加入1mL正己烷，充分溶解，超声波处理10min，加入0.2mL氢氧化钾甲醇溶液(11g氢氧化钾溶于100mL甲醇中)，超声波处理10min，最后加入0.125g的无水硫酸钠，振荡混匀，静置分层，取上清液用于脂肪酸甲酯分气相-质谱联用(GC-MS)分析。

使用Thermo Science ITQ900 GC-MS系统，设置有痕量GC Ultra、ITQ900 MS和Al/AS 3000自动进样器(Thermo Science，USA)。色谱柱为TR-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)柱(Thermo Science，USA)。进样量为1μL，载气为氦气(99.999％)，恒定流速为0.8mL·min

根据标准和NIST质谱库(2008)，鉴定每种脂肪酸甲酯(FAME)，并记录样品中峰面积占比大于0.5％的的脂肪酸甲酯(FAME)。最后将结果转换为FAME和峰面积信息。

由于C16-C18脂肪酸可以改善生物柴油的燃烧性能，不饱和脂肪酸比例可以改善生物柴油的低温流动性能，本研究从布朗葡萄藻中鉴定出6种占比较高的脂肪酸甲酯(FAME)(表1)。

经不同光照光谱处理后，6种脂肪酸的含量发生了显著变化(P＝0.01，表1)。

表1.不同光源下培养的布朗葡萄藻的脂肪酸组成(％,means±SD,n＝3)

不同的字母表示通过LSD测试或DunnettT3测试确定的统计差异，不同大写字母组件差异P<0.01。

可以看出，主要脂肪酸含量(％)依次为C18:1(n-9)、C20:5(n-3)、C16:0、C18:2(n-9)、C18:0、C18:3(n-6)，所有处理中C16-C18脂肪酸占总脂肪酸的比例超过90％，饱和脂肪酸(C16:0、C18:0)的总和一般小于不饱和脂肪酸(C18:1(n-9)、C20:5(n-3)、C18:2(n-9)和C18:3(n-6))的总和，优势不饱和脂肪酸是C18:1(n-9)。可以看出，在鉴定的6种脂肪酸中，C20:5(n-3)、C16:0、C18:2(n-9)、C18:0以及C18:3(n-6)的占比均小于8％，而C18:1(n-9)占绝对优势，高于75％。

为了评估光照光谱如何影响脂质成分，图4基于从每个处理的三个平行样品获得的数据所制。白光对照中，除C18:1(n-9)(图4-4)以外的所有脂肪酸都处于较低比例。随着红光在定制红蓝组合光谱中所占比例的增加，脂肪酸含量呈现不同的变化模式，C20:5(n-3)(图4-6)减少，C18:3(n-6)(图4-2)、C18:2(n-9)(图4-3)增加，C18:1(n-9)(图4-4)存在一个最高值，C18:0(图4-5)和C16:0(图4-1)脂肪酸占比无明显趋势。单色红光在光谱中占比增加，可增加该藻种的C18:3(n-6)、C18:2(n-9)脂肪酸含量，单色蓝色在光谱中占比增加，可增加该藻种的C20:5(n-3)脂肪酸含量。从而，可以通过调整照光的光谱实现主动改变该藻种的脂肪酸组成和比例。就生物柴油生产而言，饱和的C16:0、C18:0脂肪酸和适量的不饱和C18:3(n-6)脂肪酸有利于生物柴油的品质提升。

实施例3

将实施例2中表1中制得的不同光源下培养的布朗葡萄藻的脂质，进行制备生物柴油，具体步骤为：

脂质样品充分溶解于正己烷中，加入1/5体积的10％(w/v)的氢氧化钾甲醇溶液，充分混合20～30min后，加无水硫酸钠脱水，混匀后静置分层，上层为生物柴油和正己烷，正己烷可通过分馏回用。

对生物柴油的十六烷值进行计算，结果见图5。

图5中根据各处理的样品所得的脂质组成数据，进行生物柴油的十六烷值(CN)计算，可以看出，除了0R7B、1R6B、7R0B处理组外，各单色组合光处理对脂质的CN值均有不同程度的提升，而且5R2B的CN值比白光培养条件显著提升了4.0％以上。可以看出不同比例的单色光对于合成的脂质用于生产生物柴油时，可提高其十六烷值，其中4R3B和5R2B的脂质最优。所以，在光源中调控单色光比例，可提高该藻种生产的生物柴油性能。

本发明涉及一种将单色光进行适当组合，形成组合光谱，用于调控微藻脂质组成的方法。在根据布朗葡萄藻Botryococcus brauni进行适当优化后实施，发现单色蓝光对其脂质组成有促进作用，可提高其合成的脂肪酸中C18:1和C20:5(n-3)的比例。由此，可以通过调整布朗葡萄藻培养的照光光谱，改变其合成的脂肪酸组成和比例，提升其生物柴油质量。本发明提供一种根据微藻光能利用特征，组合优化单色光形成的组合光谱，提高微藻脂质生产中的性能。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。