一种氨基酸生产方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种氨基酸生产方法。

背景技术

玉米浆是玉米湿法浸泡生产过程中产生的浸泡水经浓缩获得的副产品，其成分复杂，含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素(如生物素等)、核苷酸和微量元素等营养物质。玉米浆由于廉价易得是一种优良的氮源已广泛应用于氨基酸、抗生素、生化药物等众多发酵产品的生产过程中。按照微生物利用程度将玉米浆中成分可分为可发酵组分和非发酵组分，可发酵组分包括氨基酸、维生素和生长因子等，可发酵组分能够促进微生物生长和代谢产物的合成。非发酵组分包括大分子蛋白、植酸和毒素等，非发酵组分的存在会抑制微生物生长和发酵产物的合成，如大分子蛋白会增加发酵液粘度，从而影响传质。玉米浆中的毒素主要包括黄曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉素、烟曲霉素等。黄曲霉毒素具有强致癌性，玉米赤霉烯酮具有较强的雌激素效应、致癌性和遗传毒性。这些有害物质的存在限制了玉米浆的使用。

为了能够更好的利用玉米浆，通常需要对玉米浆进行预处理，常用的处理方法包括物理吸附法、化学法和生物法。物理吸附法能够吸附毒素，但不能减少毒素的量，而且还会吸附玉米浆中的维生素等营养物质；化学法反应条件要求高，对产品的其他成分会有一定程度的破坏，其应用也受到限制。生物法由于反应条件温和，专一性强，作用效率高且成本低廉是一种具有潜力的处理方法。

CN109852568A提供了一种改良玉米浆的制备方法，包括如下步骤：(1)将玉米浆与水等体积混合，得玉米浆预处理液；(2)取步骤(1)中玉米浆预处理液，加入HNO

牛福华、张安红等报道了《不同预处理方式的玉米浆应用于L-苏氨酸发酵的研究》，其中提到，玉米浆中大部分氨基酸以大分子蛋白形式存在，微生物对其利用较为困难，为了向发酵生产提供足够有效的营养物质，往往需要添加较大比例的玉米浆，由于大分子蛋白以及其他胶体类杂质是发酵过程泡沫产生的主要原因之一，随着玉米浆用量加大，发酵罐利用效率随之降低。另外玉米浆中不溶性颗粒及部分不易高温杀灭的微生物芽孢随之增多，发酵染菌风险增大。在部分玉米浆用量较高的发酵领域中，不仅发酵过程会受到影响，而且玉米浆中大量未被利用的杂质随发酵液进入提取环节，同样对提取过程产生各种不利影响，如除杂难度加大、主产品收率降低等等，这些杂质最后进入废液，造成废液处理困难。作者以玉米浆为原料，分别比较酸化、酸水解和酶水解的方式预处理玉米浆的优劣性，同时将所得玉米浆以不同组合配比应用于L-苏氨酸发酵实验，以期获得更易为微生物利用，成本低廉的玉米浆预处理方式。

CN109536541A公开了一种玉米浆预处理方法及采用经预处理的玉米浆生产柠檬酸的方法，通过利用复合蛋白酶对玉米浆进行预处理，将其中的蛋白质分子降解为多肽及游离氨基酸，并将经预处理的玉米浆用于发酵生产柠檬酸，能够明显改善玉米浆的微生物利用，并显著降低发酵过程的泡沫量，从而提高了柠檬酸产率。

CN112195205A公布了一种提高谷氨酸发酵产酸的方法，将谷氨酸棒杆菌种子液以8％接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中，所述发酵罐培养基的组分为：葡萄糖80g/L、玉米浆50g/L、磷酸二氢钾3g/L、磷酸氢二钾3g/L、七水硫酸镁1g/L、七水硫酸亚铁100g/L、生物素50μg/L。其中玉米浆按照如下步骤制得：将玉米粒经筛选去杂后，添加浸泡罐中，然后加入0.2％(v/v)亚硫酸浸提70h，温度控制在45℃；收集玉米浸提液，浓缩至原体积的三分之一，然后依次接入保加利亚乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液，控制在36℃培养12h，离心收集上层液体，然后经过陶瓷膜过滤，再通过三效蒸发浓缩器进行浓缩至波美度达到23，即得玉米浆。

谷氨酸又名α-氨基戊二酸，分子内含一个氨基和两个羧基，是一种酸性氨基酸。无色晶体，有鲜味，微溶于水，而溶于盐酸溶液，等电点3.22。谷氨酸是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一，参与蛋白质、多肽及脂肪酸的合成，与谷氨酰胺一起调节体内氨水平；也可作为兴奋性神经递质参与信息传递。L-谷氨酸的用途广泛，它本身作为药品，能治疗肝昏迷症，也可用来生产味精、食品添加剂、香料和用于生物化学的研究。

谷氨酸主要采用谷氨酸棒杆菌发酵法生产，常用的碳源包括薯类、玉米、木薯淀粉等淀粉的水解糖或糖蜜，氮源包括有机氮源如玉米浆、水解液、酵母膏、蛋白胨等和无机氮源铵盐、硝酸盐、尿素、氨水和液氨等，其他辅助原料为无机盐类，维生素等。其中玉米浆由于营养丰富，成本低廉，不仅能提供谷氨酸棒杆菌生长所需的糖类、氨基酸和无机盐等营养物质，还能提供大量的维生素(生物素)供菌体生长和谷氨酸合成所需，因此玉米浆被广泛应用于谷氨酸发酵生产中。

CN104694591A公开了一种用于生物素亚适量发酵生产谷氨酸的发酵培养基，其组成成份为：玉米淀粉水解糖425～495g/L，玉米浆3.5～5g/L，糖蜜2.6～3.6g/L，MgSO

CN111961694A公开了一种谷氨酸发酵方法、味精生产的方法，玉米浆浓缩后在适宜的温度、pH、时间下酶解；酶解后加入活性炭吸附脱色；脱色液用于为谷氨酸发酵提供氮源及无机磷，替代原培养基中的氮源及磷酸盐。玉米浆浓缩后波美度为20-25。水解酶包含植酸复合酶、蛋白酶。玉米浆经过酶解后提高了可利用游离磷及氨基酸含量，完全替代了谷氨酸发酵配料中无机磷及部分蛋白水解液的使用，提高了资源利用率，降低了生产成本，单位谷氨酸节约磷酸氢二钾9.09kg/吨、消泡剂节约1.5kg/吨。树脂脱色替代原工艺中颗粒活性炭脱色，中和液透光可提高到93％-98％，较原工艺可减少75％洗涤污水。

玉米浆作为一种廉价的有机氮源目前已广泛应用于氨基酸发酵行业中，但由于玉米浆成分复杂，在实际应用过程中也存在许多问题。玉米浆组成受不同来源的玉米以及浸泡工艺的影响，不同储存条件的玉米中毒素及其他有害物质的含量也会发生变化，导致使用玉米浆发酵指标波动较大。目前研究主要关注于玉米浆中营养物质的利用，通过化学法酸水解或者生物酶法预处理将玉米浆中不能利用的大分子蛋白降解为微生物能够利用的小分子氨基酸，或将植酸等有机磷转化为无机磷，但很少关注玉米浆中对微生物发酵有害物质的去除。

虽然CN106858042A提到了对玉米浆中有害成分的去除，但其主要关注了将玉米浆应用于畜禽饲料时的有害成分。具体的，其公开了一种经预处理的玉米浆及其在畜禽饲料中的直喷使用方法，在有效降低玉米浆水分的同时，通过对玉米浆中的有毒、抗营养因子的有效去除，使之能够直接用于饲喂畜禽。首先向玉米浆中加入碱液调节pH至5.2-5.3，然后加入植酸酶降解玉米浆中的植酸，之后向酶解后的玉米浆中接入培养好的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和黑曲霉(Aspergillus niger)进行发酵培养；培养结束后，即得到玉米浆。解淀粉芽孢杆菌和黑曲霉能够有效去除黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮及其代谢物α-玉米赤霉烯醇以及赭曲霉毒素A，同时经上述预处理步骤处理后，溶液中的可溶性亚硫酸盐含量降低。

发明内容

本发明在研究中意外发现，玉米浆中所含有的黄嘌呤和次黄嘌呤对微生物(尤其如谷氨酸棒杆菌)的发酵具有不利影响。基于此发现，本发明在大量探究后提供了一种氨基酸生产方法。

具体而言，本发明首先提供了一种玉米浆预处理方法，其包括：去除玉米浆中所含有的黄嘌呤和/或次黄嘌呤。

本发明发现，将去除黄嘌呤和/或次黄嘌呤后的玉米浆应用于微生物发酵时，发酵效果更好。

作为优选，所述的玉米浆预处理方法包括：通过黄嘌呤氧化酶对玉米浆进行预处理。

黄嘌呤氧化酶(XOD)是一种包含【2Fe-2S】簇、钼蝶呤和黄素辅基的复杂氧化还原酶类，可以利用分子氧作为电子受体或者亚甲基蓝、苯醌、高铁氰化物和硝酸盐等人工电子受体催化氧化嘌呤、蝶呤和醛类等多种杂环化合物底物sp

本发明发现，采用黄嘌呤氧化酶能够有效降解玉米浆中黄嘌呤、次黄嘌呤等对微生物细胞遗传毒性物质，也能氧化分解含氮杂环类有机污染物，同时对营养物质的破坏较少。此外，黄嘌呤氧化酶酶解过程中所产生的副产物过氧化氢，能够增强发酵培养基中氧的供应，促进微生物生长和谷氨酸合成。

作为优选，所述黄嘌呤氧化酶的添加量为50～250μg/kg玉米浆干基。

作为优选，所述预处理的pH值为7.0～8.0。

在具体实施方案中，一般需要通过加入碱液，使玉米浆的pH值达到上述范围，所采用的碱液可以为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或者氨水溶液，在此不做进一步限定。

作为优选，所述黄嘌呤氧化酶为最适温度在50-60℃的中温酶，所述预处理的温度为50～60℃。

本发明发现，黄嘌呤氧化酶为低温酶(25-45℃)时，在本发明中的反应效果较差。同时，反应温度也不宜过高，在温度较高时，黄嘌呤氧化酶失活较快，且高温对玉米浆中营养物质也有破坏。

在一些实施方案中，预处理时间为30～60min。

本领域人员可依照常识对上述方案进行组合，得到本发明中玉米浆预处理方法的较优实施例。

本发明进一步提供一种经预处理的玉米浆，其由所述的玉米浆预处理方法制得。

经本发明方法预处理后的玉米浆中不含有黄嘌呤、次黄嘌呤等对微生物细胞遗传毒性物质，也不含有含氮杂环类有机污染物，可以在微生物发酵、动物饲料等领域得到广泛应用。

本发明还提供一种微生物发酵培养基，其含有所述的经预处理的玉米浆。

作为优选，在微生物发酵培养基中，所述经预处理的玉米浆的含量为30-60g/L。

当所述微生物为谷氨酸棒杆菌(优选为温度敏感型菌株)时，更优选发酵培养基含有如下组分：葡萄糖40-60g/L，经预处理的玉米浆30-60g/L，玉米浆水解液25-35g/L，K

作为本发明的一种优选方案，发酵培养基含有如下组分：葡萄糖50g/L，预处理玉米浆30-60g/L，玉米浆水解液30g/L，K

本发明还提供一种谷氨酸生产方法，采用谷氨酸棒杆菌进行发酵，发酵培养基为所述的微生物发酵培养基。

作为优选，所述谷氨酸棒杆菌为温度敏感型菌株。

在一些实施方案中，以温度敏感型菌株种子液的方式接种谷氨酸棒杆菌，且其接种量为发酵培养基体积的5-8％。

进一步的，针对本发明预处理得到的玉米浆，为了使发酵效果进一步得到改善，本发明还对影响其发酵关键条件或参数进行了探究与优化，得到如下方案。

作为优选，发酵温度采用梯度控制，具体为：0-6h为32.5-33.5℃，6-8h为37-38℃，8-10h为38-39℃，10h-下罐为40℃。

作为优选，控制pH值为6.8-7.2，更优选为6.9-7.1。

在实际方案中，可通过流加氨水控制pH值在上述范围。

作为优选，控制DO(溶解氧)为20％以上。

在实际方案中，可调节风量、转速和罐压控制DO。

优选地，在发酵过程中，通气量为12-22L/min。

作为优选，控制残糖量为1～5g/L。

在实际方案中，可通过在发酵过程中流加葡萄糖溶液，并控制其流加速率，以控制残糖量。

在一些实施方案中，发酵时间为30-36h。

作为优选，将发酵培养基加入发酵装置后，在121-125℃的实消温度下进行灭菌，而后快速降温至33℃，再进行接种发酵。

在实际方案中，为了更有利于发酵效果，可以发酵罐体积为基准，按50-65％装液量加入发酵培养基。

在实际生产谷氨酸时，可以直接使用本发明中经预处理的玉米浆或配置好的发酵培养基，也可以按本发明的方法，从预处理步骤开始，依次获得经预处理的玉米浆和发酵培养基，再进行发酵生产，其均属于本发明的保护范围。

本领域人员可依照常识对上述方案进行组合，得到本发明谷氨酸生产方法的较优实施例。

基于上述技术方案，本发明的有益效果如下：

(1)经本发明方法预处理后的玉米浆应用于微生物发酵时，发酵效果更好。尤其在采用黄嘌呤氧化酶后，玉米浆中不仅不含有黄嘌呤、次黄嘌呤等对微生物细胞遗传毒性物质，也不含有含氮杂环类有机污染物。同时，黄嘌呤氧化酶酶解过程中所产生的副产物过氧化氢，能够增强发酵培养基中氧的供应，促进微生物生长和谷氨酸合成。此外，采用酶法预处理相比化学酸水解法和微生物培养法对设备要求低，反应条件温和，作用专一，酶解效率高，对营养物质的破坏较少。

(2)通过本发明的生产方法可以进一步提升糖酸转化率，有利于在谷氨酸生产中进行推广应用。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例的谷氨酸生产方法均从预处理步骤开始，依次获得经预处理的玉米浆和发酵培养基，再进行发酵生产。不过，本领域人员可以从中确定有关玉米浆预处理方法、经预处理的玉米浆、以及发酵培养基的实施例。

为了便于比对效果，以下实施例中所使用的玉米浆均为同一批次的玉米浆。以下实施例中除特别说明(实施例6)外，黄嘌呤氧化酶均为中温酶(50-60℃)。以下实施例中均采用谷氨酸棒杆菌温度敏感型菌株作为发酵菌，其为谷氨酸发酵常用菌种，可通过市售途径获得。以下实施例中的玉米浆水解液通过CN 103014085A中实施例3的制备方法制得，其为氨基酸发酵中的常用原料，通过其他途径获得的玉米浆水解液(如文献“玉米浆水解液应用于谷氨酸发酵的研究”中所提到的玉米浆水解液等)也可在本发明中获得不错的效果。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1

本实施例提供一种谷氨酸生产方法，包括如下步骤：

(1)玉米浆预处理：取500mL玉米浆加入2L三角瓶中，干物含量40％，采用氢氧化钠调节玉米浆pH值至7.0，按照50μg/kg玉米浆(干基)添加量加入黄嘌呤氧化酶，放入50℃恒温摇床振荡反应30min；

(2)发酵培养基准备：将预处理玉米浆用于谷氨酸发酵培养基的配制，预处理玉米浆加量30g/L，其余组分加量为葡萄糖50g/L，玉米浆水解液30g/L，K

(3)发酵控制：将培养好的温敏型种子液按照接种比8％接入装有6L发酵培养基的10L发酵罐中，控制培养温度0-6h 33℃，6-8h 37℃，8-10h 38℃，10h-下罐40℃，通过自动流加氨水控制pH值在6.8-7.2；调节风量、转速和罐压控制DO20％以上，待底糖消耗完全后开始流加质量浓度70％的葡萄糖溶液，控制发酵液残糖浓度3g/L，发酵培养32-38h后结束发酵，检测发酵液中谷氨酸含量，计算糖酸转化率。经过检测，放罐发酵液中L-谷氨酸190g/L，糖酸转化率68.6％，转化率较对比例1提升1.1％。

实施例2

本实施例提供一种谷氨酸生产方法，包括如下步骤：

(1)玉米浆预处理：取500mL玉米浆加入2L三角瓶中，干物含量40％，采用氢氧化钠调节玉米浆pH值至7.0，按照100μg/kg玉米浆(干基)添加量加入黄嘌呤氧化酶，放入55℃恒温摇床振荡反应30min；

(2)发酵培养基准备：将预处理玉米浆用于谷氨酸发酵培养基的配制，预处理玉米浆加量40g/L，其余组分加量为葡萄糖50g/L，玉米浆水解液30g/L，K

(3)发酵控制：将培养好的温敏型种子液按照接种比8％接入装有6L发酵培养基的10L发酵罐中，控制培养温度0-6h 33℃，6-8h 37℃，8-10h 38℃，10h-下罐40℃，通过自动流加氨水控制pH值在6.8-7.2；调节风量、转速和罐压控制DO20％以上，待底糖消耗完全后开始流加质量浓度70％的葡萄糖溶液，控制发酵液残糖浓度4g/L，发酵培养32-38h后结束发酵，检测发酵液中谷氨酸含量，计算糖酸转化率。经过检测，放罐发酵液中L-谷氨酸194g/L，糖酸转化率69.4％，转化率较对比例1提升1.9％。

实施例3

本实施例提供一种谷氨酸生产方法，包括如下步骤：

(1)玉米浆预处理：取500mL玉米浆加入2L三角瓶中，干物含量40％，采用氢氧化钠调节玉米浆pH值至7.5，按照150μg/kg玉米浆(干基)添加量加入黄嘌呤氧化酶，放入55℃恒温摇床振荡反应60min；

(2)发酵培养基准备：将预处理玉米浆用于谷氨酸发酵培养基的配制，预处理玉米浆加量50g/L，其余组分加量为葡萄糖50g/L，玉米浆水解液30g/L，K

(3)发酵控制：将培养好的温敏型种子液按照接种比8％接入装有6L发酵培养基的10L发酵罐中，控制培养温度0-6h 33℃，6-8h 37℃，8-10h 38℃，10h-下罐40℃，通过自动流加氨水控制pH值在6.8-7.2；调节风量、转速和罐压控制DO20％以上，待底糖消耗完全后开始流加质量浓度70％的葡萄糖溶液，控制发酵液残糖浓度2g/L，发酵培养32-38h后结束发酵，检测发酵液中谷氨酸含量，计算糖酸转化率。经过检测，放罐发酵液中L-谷氨酸196g/L，糖酸转化率69.9％，转化率较对比例1提升2.4％。

实施例4

本实施例提供一种谷氨酸生产方法，包括如下步骤：

(1)玉米浆预处理：取500mL玉米浆加入2L三角瓶中，干物含量40％，采用氢氧化钠调节玉米浆pH值至8.0，按照200μg/kg玉米浆(干基)添加量加入黄嘌呤氧化酶，放入55℃恒温摇床振荡反应50min；

(2)发酵培养基准备：将预处理玉米浆用于谷氨酸发酵培养基的配制，预处理玉米浆加量50g/L，其余组分加量为葡萄糖50g/L，玉米浆水解液30g/L，K

(3)发酵控制：将培养好的温敏型种子液按照接种比8％接入装有6L发酵培养基的10L发酵罐中，控制培养温度0-6h 33℃，6-8h 37℃，8-10h 38℃，10h-下罐40℃，通过自动流加氨水控制pH值在6.8-7.2；调节风量、转速和罐压控制DO20％以上，待底糖消耗完全后开始流加质量浓度70％的葡萄糖溶液，控制发酵液残糖浓度1g/L，发酵培养32-38h后结束发酵，检测发酵液中谷氨酸含量，计算糖酸转化率。经过检测，放罐发酵液中L-谷氨酸198g/L，糖酸转化率70.3％，转化率较对比例1提升2.8％。

实施例5

本实施例提供一种谷氨酸生产方法，包括如下步骤：

(1)玉米浆预处理：取500mL玉米浆加入2L三角瓶中，干物含量40％，采用氢氧化钠调节玉米浆pH值至8.0，按照200μg/kg玉米浆(干基)添加量加入黄嘌呤氧化酶，放入60℃恒温摇床振荡反应30min；

(2)发酵培养基准备：将预处理玉米浆用于谷氨酸发酵培养基的配制，预处理玉米浆加量60g/L，其余组分加量为葡萄糖50g/L，玉米浆水解液30g/L，K

(3)发酵控制：将培养好的温敏型种子液按照接种比8％接入装有6L发酵培养基的10L发酵罐中，控制培养温度0-6h 33℃，6-8h 37℃，8-10h 38℃，10h-下罐40℃，通过自动流加氨水控制pH值在6.8-7.2；调节风量、转速和罐压控制DO20％以上，待底糖消耗完全后开始流加质量浓度70％的葡萄糖溶液，控制发酵液残糖浓度5g/L，发酵培养32-38h后结束发酵，检测发酵液中谷氨酸含量，计算糖酸转化率。经过检测，放罐发酵液中L-谷氨酸192g/L，糖酸转化率69.0％，转化率较对比例1提升1.5％。

实施例6

本实施例提供一种谷氨酸生产方法，包括如下步骤：

(1)玉米浆预处理：取500mL玉米浆加入2L三角瓶中，干物含量40％，采用氢氧化钠调节玉米浆pH值至8.0，按照200μg/kg玉米浆(干基)添加量加入黄嘌呤氧化酶(低温酶)，放入25℃常温摇床振荡反应60min；

(2)发酵培养基准备：将预处理玉米浆用于谷氨酸发酵培养基的配制，预处理玉米浆加量60g/L，其余组分加量为葡萄糖50g/L，玉米浆水解液30g/L，K

(3)发酵控制：将培养好的温敏型种子液按照接种比8％接入装有6L发酵培养基的10L发酵罐中，控制培养温度0-6h 33℃，6-8h 37℃，8-10h 38℃，10h-下罐40℃，通过自动流加氨水控制pH值在6.8-7.2；调节风量、转速和罐压控制DO20％以上，待底糖消耗完全后开始流加质量浓度70％的葡萄糖溶液，控制发酵液残糖浓度5g/L，发酵培养32-38h后结束发酵，检测发酵液中谷氨酸含量，计算糖酸转化率。经过检测，放罐发酵液中L-谷氨酸186g/L，糖酸转化率67.8％，转化率较对比例1提升0.3％。

对比例1

本对比例提供一种谷氨酸生产方法，包括如下步骤：

(1)玉米浆预处理：取500mL玉米浆加入2L三角瓶中，干物含量40％，采用氢氧化钠调节玉米浆pH值至7.5，按照50μg/kg玉米浆(干基)添加量加入蒸馏水，放入55℃恒温摇床振荡反应40min；

(2)发酵培养基准备：将预处理玉米浆用于谷氨酸发酵培养基的配制，预处理玉米浆加量40g/L，其余组分加量为葡萄糖50g/L，玉米浆水解液30g/L，K

(3)发酵控制：将培养好的温敏型种子液按照接种比8％接入装有6L发酵培养基的10L发酵罐中，控制培养温度0-6h 33℃，6-8h 37℃，8-10h 38℃，10h-下罐40℃，通过自动流加氨水控制pH值在6.8-7.2；调节风量、转速和罐压控制DO20％以上，待底糖消耗完全后开始流加质量浓度70％的葡萄糖溶液，控制发酵液残糖浓度3g/L，发酵培养32-38h后结束发酵，检测发酵液中谷氨酸含量，计算糖酸转化率。经过检测，放罐发酵液中L-谷氨酸184g/L，糖酸转化率67.5％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。