包含经修饰的重链恒定区的抗体

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年11月28日提交的美国临时申请号62/772,411的优先权权益。将前述申请的内容通过引用以其整体特此并入。

背景技术

抗体治疗剂是疾病(如癌症和免疫障碍)治疗中发展最快的领域之一。然而，通过治疗性抗体有效靶向抗原仍然是医疗保健的重大挑战。因此，抗体工程已经成为制药领域的主要焦点。从这一焦点出发，已经出现了大量新的工程化抗体，如抗体片段、抗体药物缀合物(ADC)、具有经修饰的效应子区的抗体和双特异性抗体。

抗体通过许多不同的机制促进其治疗特性。抗体可以直接抑制或激活靶抗原，从而调节细胞信号传导。抗体可以抑制配体与受体的结合。抗体还可以例如通过增强受试者的免疫系统(例如，作为T细胞激活中的共刺激物)来诱导或抑制免疫应答以抵抗感染或癌症。

此外，抗体介导的细胞表面受体/抗原的内化被认为是治疗性抗体的主要作用机制。在这种情况下，抗体通过诱导靶标到细胞中的内化将靶标从细胞表面去除并使其无法发挥功能。实际上，抗体治疗剂的先驱者之一是用于治疗乳腺癌的曲妥珠单抗。曲妥珠单抗靶向ErbB2受体并诱导受体/抗体内化，从而抑制EGFR信号传导。然而，抗体并不总是展示出有效的内化品质，因此对具有改善的内化功能的抗体存在持续的需求。因此，非常需要用于改善已知治疗性抗体的内化的方法。

发明内容

本发明提供了重链恒定区(称为“经修饰的重链恒定区”)或其功能上等同的片段，所述重链恒定区或其功能上等同的片段相对于未经修饰形式的相同抗体或融合蛋白增强或修饰(例如，降低)包含所述经修饰的重链恒定区的抗体或融合蛋白的生物学特性(例如，效应子功能)。例如，包含所述经修饰的恒定区的抗体展现出增加的内化和/或激动或拮抗活性。具有某些经修饰的重链恒定区(例如，在P238、L234、L235、G237和K322处包含一个或多个取代，如P238K、L234A、L235E、G237A和K322A)的抗体或融合蛋白具有与低亲和力FcgR、高亲和力FcgR或C1q的降低或不可检测的结合，从而导致降低或不可检测的效应子功能，如ADCC、ADCP和/或CDC。对于在P238、L234、L235、G237和K322处包含一个或多个取代的经修饰的重链恒定区，铰链和CH1结构域不必是IgG2铰链和IgG2 CH1，对于本文所述的其它经修饰的重链恒定区(增强内化和激动剂活性的那些)也是如此。在其中经修饰的重链恒定区包含IgG2的至少一部分的实施方案中，所述重链恒定区还可以包含降低IgG2的异质性的突变，例如取代，如C219S、C220S和/或C131S。可以包括或者可以不包括另外的突变。在P238、L234、L235、G237和K322处包含一个或多个取代(如P238K、L234A、L235E、G237A和K322A)的经修饰的重链恒定区或其片段(例如，缺少CH1结构域)可以是抗体的一部分，或者可以与异源肽或蛋白质融合以形成融合蛋白(例如，“Fc融合蛋白”)。

本文所述的抗体是原始未经修饰抗体的优化形式。在某些实施方案中，重链包含经修饰的恒定区，所述经修饰的恒定区相对于野生型重链恒定区包含一个或多个突变或修饰。在某些实施方案中，经修饰的重链恒定区包含一个IgG2铰链和三个恒定结构域(即，CH1、CH2和CH3结构域)，其中所述恒定区结构域中的一个或多个是非IgG2人同种型(例如，IgG1、IgG3或IgG4)或其功能上等同的片段。所述经修饰的恒定区可以包含相应的野生型氨基酸序列或其变体，例如相对于野生型氨基酸序列在所述铰链或所述CH1、CH2、CH3结构域内的一个或多个(例如，在1-10个之间或更多个)氨基酸取代或缺失。因此，所述铰链和/或每个恒定结构域的氨基酸序列与相应的野生型氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％或更多(即，96％、97％、98％、99％或100％)相同。

在一个实施方案中，所述经修饰的重链恒定区包含野生型人IgG2铰链或与野生型人IgG2铰链的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。所述铰链可以进一步含有另外的修饰，例如以减少二硫键的形成。在一个实施方案中，所述铰链相对于野生型人IgG2铰链包含氨基酸取代C219S。在某些实施方案中，所述铰链包含SEQ ID NO:8、21-23、126-132和134-147中任一个所示的氨基酸序列或如下序列之一，这些序列包含在CVE与CPP之间插入的1-3个氨基酸。

在某些实施方案中，所述经修饰的重链恒定区包含野生型人IgG1铰链或与野生型人IgG1铰链的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。对于具有降低的效应子功能的经修饰的重链恒定区，IgG1铰链可以在L234、L235和G237中的一个或多个处包含氨基酸取代(在G237的情况下，它也可以是缺失)，如L234A、L235E和G237A或其保守取代，如本文进一步描述的。

在某些实施方案中，所述经修饰的重链恒定区包含IgG2 CH1结构域，例如野生型人IgG2 CH1结构域或与野生型人IgG2 CH1结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)至少95％相同的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述经修饰的重链恒定区包含IgG1 CH1结构域，例如野生型人IgG1 CH1结构域或与野生型人IgG1 CH1结构域的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述经修饰的重链恒定区包含IgG1 CH2结构域，例如野生型人IgG1 CH2结构域或与野生型人IgG1 CH2结构域的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。所述CH2结构域可以含有另外的修饰(例如，以降低或消除效应子功能)。在某些实施方案中，所述CH2结构域相对于野生型全长人IgG1 CH2包含氨基酸取代A330S和P331S。在某些实施方案中，所述CH2结构域包含SEQ ID NO:24。对于具有降低的效应子功能的经修饰的重链恒定区，IgG1 CH2结构域可以在P238和K322中的一个或多个处包含氨基酸取代，如P238K和K322A或其保守取代，如本文进一步描述的。

在某些实施方案中，所述经修饰的重链恒定区包含IgG1 CH3结构域，例如野生型人IgG1 CH3结构域或与野生型人IgG1 CH3结构域的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。所述CH3结构域可以进一步含有赋予特定同种异型的另外的修饰。在一个实施方案中，相对于不同同种异型(例如，“fa”同种异型，其分别在如下那些位置处具有D和L)的野生型全长人IgG1，所述CH3结构域含有位置356处的氨基酸残基E和位置358处的氨基酸M(“f”同种异型)。在某些实施方案中，所述CH3结构域包含SEQ ID NO:5。

在具体的实施方案中，所述抗体包含经修饰的重链恒定区，其中(a)所述CH1结构域是具有或不具有另外的修饰的野生型人IgG2 CH1结构域或野生型IgG1 CH1结构域，(b)所述铰链是具有或不具有C219S取代的野生型IgG2铰链，(c)所述CH2结构域是具有或不具有另外的修饰的野生型人IgG1 CH2结构域或野生型IgG2 CH2结构域，并且(d)所述CH3结构域是具有或不具有位置356处的氨基酸E和位置358处的氨基酸M的野生型人IgG1 CH3结构域或野生型人IgG2 CH3结构域(例如，同种异型f或fa的)。在特定的实施方案中，所述经修饰的重链恒定区包含本文所述的氨基酸序列，例如SEQ ID NO:26-37和78-93中任何一个所示的氨基酸序列。

对于具有降低的效应子功能的经修饰的重链恒定区，所述恒定区可以包含(a)铰链，所述铰链是在L234、L235和G237中的一个或多个处包含氨基酸取代(在G237的情况下，它也可以是缺失)(如L234A、L235E和G237A或其保守取代)的人IgG1铰链；(b)CH2结构域，所述CH2结构域是在P238和K322中的一个或多个处包含氨基酸取代(如P238K和K322A或其保守取代)的人IgG1 CH2结构域；和(c)CH3结构域，所述CH3结构域是具有或不具有位置356处的氨基酸E和位置358处的氨基酸M的野生型人IgG1 CH3结构域(例如，同种异型f或fa的)，或野生型人IgG2 CH3结构域。所述经修饰的重链恒定区可以进一步包含(d)CH1结构域，所述CH1结构域是具有或不具有另外的修饰的野生型人IgG2 CH1结构域或野生型IgG1 CH1结构域。在具有降低的效应子功能的经修饰的重链恒定区的上下文中，所述重链恒定区不必包含铰链，例如当其用于融合蛋白(例如，Fc融合蛋白)中时。

与不具有经修饰的重链恒定区的相同抗体相比，本发明的抗体(即，具有经修饰的恒定区的抗体)可以是完全人抗体或人源化抗体，并且进一步展现出一种或多种增强或改变的特征。这些特征可以包括增加或改变的细胞内化、激动活性、大的交联复合物的形成、ADCC、受体介导的信号传导、拮抗剂活性、免疫调节活性和抗肿瘤活性；引入新的特性，例如激动剂活性；或与Fc受体的降低的结合和/或降低的效应子功能(例如，降低的ADCC、ADCP和/或CDC)。

还提供了含有本发明的经修饰的恒定区的双特异性分子和免疫缀合物，以及含有所述抗体、双特异性分子或免疫缀合物和可接受的药物载体的组合物。此类组合物还可以包含一种或多种另外的治疗剂，例如刺激免疫系统的药剂，如检查点抑制剂、共刺激分子、抗CD39抗体或抗A2AR抗体。

还提供了用于制备包含经修饰的重链恒定区的抗体的方法。与包含非IgG2同种型的铰链的相同抗体相比，本文提供的某些方法包括增加细胞对抗体的内化的方法以及用于增加抗体的激动剂活性的方法。此类方法包括以下步骤：提供具有不是IgG2铰链的铰链的抗体，以及将所述铰链用IgG2铰链(如作为野生型人IgG2铰链的铰链、具有与野生型人IgG2铰链的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的铰链或经修饰以减少二硫键形成的铰链，例如包含氨基酸取代C219S的铰链)替代。在一个实施方案中，所述抗体的内化增强或增加了至少10％、30％、50％、75％、2倍、3倍、5倍或更多，从而导致T

对于具有降低的FcgR结合或效应子功能的经修饰的重链恒定区，它们优选具有以下特征中的一个或多个：(i)与低亲和力FcgR的结合降低了5、10、20、50、100倍或更多倍，从而导致例如小于10％、5％、2％、1％、0.1％或更低的与低亲和力FcgR的结合，如例如使用实施例中所述的方法确定的；(ii)与高亲和力FcgR的结合降低了5、10、20、50、100、500或1000倍或更多倍，从而导致例如小于10％、5％、2％、1％、0.1％或更低的与低亲和力FcgR的结合，如例如使用实施例中所述的方法确定的；(iii)ADCC、ADCP和/或CDC降低了5、10、20、50、100倍或更多倍，从而导致例如小于10％、5％、2％、1％、0.1％或更低的ADCC、ADCP和/或CDC活性，如例如使用实施例中所述的方法确定的。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括用不同同种型的CH1、CH2或CH3结构域替代所述CH1、CH2或CH3结构域中的至少一个的步骤。此类替代包括例如：(a)将所述CH1结构域用IgG1 CH1结构域或IgG2 CH1结构域替代；(b)将所述CH2结构域用IgG1 CH2结构域或IgG2 CH2结构域替代；和/或(b)将所述CH3结构域用IgG1 CH3结构域或IgG2 CH3结构域替代，其中所述替代结构域具有野生型序列或与野生型序列具有至少95％同一性。在某些实施方案中，所述CH1结构域包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，对所述CH2结构域进行修饰以降低或消除效应子功能，例如所述CH2结构域包含氨基酸取代A330S和P331S(SEQ ID NO:24)。在某些实施方案中，所述CH3结构域包含位置356处的氨基酸残基E和位置358处的氨基酸M(SEQ ID NO:5，同种异型“f”)，并且在某些实施方案中，所述CH3结构域包含同种异型“fa”。

本文提供的方法包括通过施用包含经修饰的重链恒定区的抗体、融合蛋白、双特异性分子或免疫缀合物来治疗受试者的方法。也可以共施用一种或多种另外的治疗剂，例如刺激免疫系统的治疗剂，如检查点抑制剂、共刺激分子。

本文提供了包含经修饰的重链恒定区的抗体，所述经修饰的重链恒定区以从N末端到C末端的顺序包含CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域，并且其中(a)所述CH1结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与其有最多5个氨基酸的差异或与SEQ ID NO:7至少95％相同的氨基酸序列，并且其中C131、R133、E137、S138或R217中的至少一个未被取代或缺失；(b)铰链，所述铰链包含SEQ ID NO:8、21-23、126-132或134-147中的任何一个或如下序列，所述序列包含在CVE与CPP之间插入的1-3个氨基酸或者所述序列与SEQ ID NO:8、21-23、126-132或134-147中的任何一个有最多5个氨基酸的差异，其中所述铰链在C219和C220两处均不包含取代或缺失；(c)所述抗体相对于包含IgG1铰链和CH1结构域的相同抗体具有至少一种增强的特性或新引入的特性；并且(d)所述经修饰的重链恒定区不是野生型IgG2恒定区或包含C219S和/或C220S的IgG2恒定区。所述铰链可以包含氨基酸序列ERKXCVECPPCPAP(SEQ ID NO:129)或ERKCXVECPPCPAP(SEQ ID NO:130)，其中X是除半胱氨酸以外的任何氨基酸。例如，所述铰链可以包含氨基酸序列ERKSCVECPPCPAP(SEQ ID NO:131)或ERKCSVECPPCPAP(SEQ ID NO:132)。在某些实施方案中，氨基酸残基P233、V234、A235和G237中的至少一个或全部被缺失或被另一个氨基酸残基(例如，IgG1铰链中的相应氨基酸)取代。在某些实施方案中，氨基酸残基R133、E137、S138和R217中的任何一个或C131、R133、E137、S138和R217中的任何一个都没有被取代或缺失。在某些实施方案中，N192和/或F193被另一个氨基酸取代。所述抗体可以包含与野生型IgG1的CH2结构域至少95％相同的CH2结构域。所述抗体可以包含与野生型IgG1的CH3结构域至少95％相同的CH3结构域。在某些实施方案中，所述CH2和/或CH3结构域不是野生型IgG1 CH2和/或CH3结构域，并且所述抗体的效应子功能比野生型IgG1的效应子功能更有力。在某些实施方案中，所述CH2和/或CH3结构域不是野生型IgG1 CH2和/或CH3结构域，并且所述抗体的效应子功能不如野生型IgG1的效应子功能有力。在某些实施方案中，所述抗体包含与野生型IgG1或IgG4的CH2结构域和/或CH1结构域至少95％相同的CH2结构域和/或CH1结构域。在某些实施方案中，所述抗体具有选自以下的至少一种增强的特性：激动剂活性、抗体介导的受体内化、ADCC、受体介导的信号传导、拮抗剂活性、免疫调节活性或抗肿瘤活性；或新引入的特性，其为激动剂活性。

在某些实施方案中，抗体包含经修饰的重链恒定区，其中(a)所述CH1结构域是野生型人IgG2 CH1结构域；(b)所述铰链包含SEQ ID NO:8、21-23、126-132或134-147中的任何一个或如下序列，所述序列包含在CVE与CPP之间插入的1-3个氨基酸；(c)所述CH2结构域是野生型人IgG1 CH2结构域或赋予所述抗体增强或降低的效应子功能的经修饰的CH2结构域；并且(d)所述CH3结构域是野生型人IgG1 CH3结构域或赋予所述抗体增强或降低的效应子功能的经修饰的CH3结构域。经修饰的重链恒定结构域可以包含SEQ ID NO:26-37、54-56、78-125、152-232、234-245和247-262中任何一个所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:26-37、54-56、78-125、152-232、234-245和247-262中的一个或多个至少95％相同的氨基酸序列。对于包含具有与这些序列中的任一个至少95％相同的氨基酸序列的Fc的重链，优选不改变这些序列中用于调节生物活性的特定氨基酸突变。

在某些实施方案中，抗体包含经修饰的重链恒定区，其中所述重链恒定区包含CH1结构域和铰链，所述CH1结构域和铰链包含序列ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV

在某些实施方案中，抗体包含经修饰的重链恒定区，其中所述重链恒定区包含CH1结构域，所述CH1结构域包含序列ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV

抗体可以包含经修饰的重链恒定区，其中所述重链恒定区包含铰链，所述铰链包含序列

还提供了包含经修饰的重链恒定区的抗体，其中所述重链恒定区包含IgG1或IgG2铰链，并且其中所述铰链缺少1-7个氨基酸，并且其中所述抗体相对于包含IgG1铰链和CH1结构域的相同抗体具有至少一种增强的特性或新引入的特性。所述抗体可以具有选自以下的至少一种增强的特性：激动剂活性、抗体介导的受体内化、ADCC、受体介导的信号传导、拮抗剂活性、免疫调节活性或抗肿瘤活性；或新引入的特性，其为激动剂活性。所述铰链可以是缺少1-4个氨基酸(例如，氨基酸C219、C220、V222和E224)的IgG2铰链。所述铰链是缺少氨基酸S219、C220、D221、K222、T223、H224和T225的IgG1铰链。所述抗体可以包含野生型或经修饰的IgG2 CH1结构域；野生型或经修饰的IgG1 CH1结构域；以及IgG1、IgG2或IgG4 CH2结构域和IgG1、IgG2或IgG4 CH3结构域。

具有经修饰的重链恒定区的抗体可以是人抗体或人源化抗体或者其抗原结合部分。在某些实施方案中，所述抗体与涉及免疫调节的抗原特异性地结合。所述抗体可以是共刺激受体的激动剂或抑制性受体的拮抗剂。例如，所述抗体可以与如下共刺激受体结合，所述共刺激受体例如选自B7-1、B7-2、CD28、4-1BB、GITR、OX40、ICOS、CD70、CD27、CD40、DR3或CD28H的组，或者所述抗体可以与如下抑制性受体结合，所述抑制性受体例如选自CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-3、半乳糖凝集素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳糖凝集素-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1和TIM-4的组。所述抗原可以是需要内化的抗原，例如CD73。所述抗原可以是CD39。

在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定区的抗体与共刺激受体(例如，GITR、OX40、4-1BB、CD28、ICOS、CD40、CD27或任何其他TNFR超家族成员)特异性地结合，并且包含选自以下的组的经修饰的重链恒定区：SEQ ID NO:26-37、54-56、78-125、152-232、234-245和247-262。在某些实施方案中，所述抗体相对于具有相同可变区和轻链但包含IgG1重链恒定区的抗体展现出增强或改变的激动剂活性。

在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定区的抗体与细胞表面分子(例如，CD73)特异性地结合并触发抗体介导的所述细胞表面分子的内化，并且包含选自以下的组的经修饰的重链恒定区：SEQ ID NO:26-37、54-56、78-125和152-232。在某些实施方案中，所述抗体相对于具有相同可变区和轻链但包含IgG1重链恒定区的抗体具有增强或改变的内化特性。抗CD73抗体也可以与具有选自SEQ ID NO:234-245和247-262的任何氨基酸序列的Fc连接。

在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定区的抗体与抑制性受体(例如，CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、半乳糖凝集素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳糖凝集素-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1和TIM-4)特异性地结合，并且包含选自以下的组的经修饰的重链恒定区：SEQ ID NO:26-37、54-56、78-125、152-232、234-245和247-262。在某些实施方案中，所述抗体相对于具有IgG1重链恒定区的相同抗体展现出更有力或改变的拮抗剂活性或引入新的活性。在某些实施方案中，所述Fc包含一个或多个突变以调节(例如，降低)效应子功能。

在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定区的抗体与细胞表面分子特异性地结合并触发细胞内信号传导，其中所述抗体包含选自以下的组的经修饰的重链恒定区：SEQID NO:26-37、54-56、78-125、152-232。在某些实施方案中，细胞内信号传导介导激动剂活性、拮抗剂活性、所述细胞表面分子的内化或ADCC。在某些实施方案中，所述抗体相对于具有相同可变区和轻链但包含IgG1重链恒定区的抗体触发更有力的细胞内信号传导。

在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定区的抗体与细胞表面分子特异性地结合并触发高分子量抗体-细胞表面分子复合物的形成，其中所述抗体包含选自以下的组的经修饰的重链恒定区：SEQ ID NO:26-37、54-56、78-125、152-232。在某些实施方案中，所述抗体相对于具有相同可变区和轻链但包含IgG1重链恒定区的抗体触发更高分子量复合物的形成。

在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定区的抗体与细胞表面分子特异性地结合并触发所述细胞表面分子的聚集或寡聚化，其中所述抗体包含选自以下的组的经修饰的重链恒定区：SEQ ID NO:26-37、54-56、78-125、152-232。在某些实施方案中，所述抗体相对于具有相同可变区和轻链但包含IgG1重链恒定区的抗体触发所述细胞表面分子更多的聚集或寡聚化。

在具有降低的效应子功能(和/或FcgR结合)的经修饰的重链恒定区的实施方案中，包含它的抗体或融合蛋白可以与任何目的蛋白(如细胞表面蛋白)结合，所述目的蛋白可以刺激免疫系统，或者可替代地抑制免疫系统，或者具有完全不同的活性。在具有降低的效应子功能(和/或FcgR结合)的经修饰的重链恒定区的实施方案中，包含它的抗体或融合蛋白可以用于其中不需要与一种或多种FcgR的结合和/或效应子功能(如ADCC、ADCP或CDC)的任何目的，例如在所述分子的所有生物活性都通过抗体的抗原结合位点或通过融合蛋白的异源蛋白介导的情况下。

本文还提供了包含与具有第二结合特异性的分子连接的抗体或其抗原结合片段的双特异性分子，所述抗体或其抗原结合片段包含经修饰的重链恒定区。本文还提供了包含与第二药剂连接的抗体的免疫缀合物，所述抗体包含经修饰的重链恒定区。还提供了包含本文所述的抗体、双特异性分子或免疫缀合物和载体的组合物。组合物可以包含一种或多种另外的治疗剂，例如治疗剂刺激免疫系统并且是例如检查点抑制剂或共刺激受体的拮抗剂。

本文还提供了制备包含经修饰的重链恒定区的抗体的方法，其中所述抗体以从N末端到C末端的顺序包含CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含不是IgG2铰链和/或IgG2 CH1结构域的铰链和/或CH1结构域的抗体；以及(b)将所述铰链和/或所述CH1结构域分别用IgG2铰链和/或IgG2 CH1结构域替代。本文进一步提供了增加细胞对抗体的内化的方法，所述方法包括：(a)提供包含不是IgG2铰链和/或IgG2 CH1结构域的铰链和/或CH1结构域的抗体；以及(b)将所述铰链和/或所述CH1结构域分别用IgG2铰链和/或IgG2 CH1结构域替代。所述抗体的内化与包含非IgG2同种型的铰链的相同抗体(例如，包含IgG1恒定区的抗体)的内化相比可以增加。还提供了增加抗体的激动剂活性的方法，所述方法包括：(a)提供包含不是IgG2铰链和/或IgG2 CH1结构域的铰链和/或CH1结构域的抗体；以及(b)将所述铰链和/或所述CH1结构域分别用IgG2铰链和/或IgG2 CH1结构域替代。所述激动剂活性与包含非IgG2同种型的铰链的相同抗体(例如，包含IgG1恒定区的抗体)的激动剂活性相比可以增加。IgG2铰链可以是野生型人IgG2铰链，或者包含与野生型人IgG2铰链的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，并且可以包含例如表4中列出的序列。一种方法可以包括以下步骤：将所述CH1、CH2或CH3结构域中的至少一个分别用不同同种型的CH1、CH2或CH3结构域替代。一种方法可以包括以下步骤：(a)将所述CH1结构域用IgG2 CH1结构域替代；(b)将所述CH2结构域用IgG1 CH2结构域替代；和/或(b)将所述CH3结构域用IgG1 CH3结构域替代。一种方法可以包括以下步骤：(a)将所述CH1结构域用野生型人IgG2 CH1结构域或与其至少95％相同的结构域替代；(b)将所述CH2结构域用野生型人IgG1 CH2结构域或与其至少95％相同的结构域替代；和/或(b)将所述CH3结构域用野生型人IgG1 CH3结构域或与其至少95％相同的结构域替代。一种方法可以包括以下步骤：将所述重链恒定区用包含SEQ ID NO:26-37、54-56、78-125、152-232、234-245和247-262中任何一个的经修饰的重链恒定区或与SEQ ID NO:26-37、54-56、78-125、152-232、234-245和247-262至少95％相同的区域替代(或在Fc中引入这些序列的氨基酸突变)。可以对所述铰链进行修饰以减少或改变二硫键的形成。所述铰链可以包含氨基酸取代C219S。所述铰链可以包含SEQ ID NO:8、21-23、126-132或134-147中任何一个所示的氨基酸序列或如下序列，所述序列包含在CVE与CPP之间插入的1-3个氨基酸。所述CH1结构域可以包含氨基酸序

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV(SEQ ID NO:7)。可以对所述CH2结构域进行修饰以降低或消除效应子功能。所述CH2结构域可以包含氨基酸取代A330S和P331S。所述CH2结构域可以包含氨基酸序列

PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQ ID NO:4)。所述CH2结构域可以包含氨基酸取代A330S和P331S。所述CH3结构域可以包含氨基酸序列

GQPREPQVYTLPPSR

本文还提供了来自例如IgG1或IgG2或其IgG1/IgG2嵌合形式的经修饰的重链恒定区，其具有与一种或多种FcγR(例如，CD16、CD32、CD64)的降低或不可检测的结合，从而导致降低的ADCC、ADCP和/或CDC。此类经修饰的重链恒定区相对于野生型重链恒定区可以具有1-5、1-3、1-2个或单个突变(例如，取代)。此类经修饰的重链恒定区可以包含以下突变或其组合：P238K、P238K/L235E、P238K/L235E/K322A，任选地与L234A和/或G237A组合，并且任选地不具有任何另外的突变，例如降低效应子功能的任何另外的突变。代替包含P238K、L235E、K322A、L234A和G237A中的一个或多个，重链恒定区可以包含特征分别与氨基酸残基K(对于P238K)、E(对于L235E)和A(对于K322A、L234A和G237A)类似的氨基酸残基(“保守氨基酸取代”，本文进一步描述)。具有降低或不可检测的效应子功能和/或FcgR结合的此类经修饰的重链区可以包含在抗体或其衍生物或片段中，或者包含在其中所述经修饰的重链恒定区与异源蛋白或多肽融合的融合蛋白中。具有降低的FcgR结合和/或效应子功能的某些经修饰的重链恒定区不包含CH1结构域和/或铰链。例如，具有降低的FcgR结合和/或效应子功能的经修饰的重链恒定区可以包含CH2结构域，所述CH2结构域包含在P238处的氨基酸取代(例如，P238K)和任选地在K322处的氨基酸取代(例如，K322A)，但不必包含CH1结构域和/或铰链结构域。对于融合蛋白，与所述异源结构域连接的恒定结构域包含CH1或铰链区可能不是必需的。

还提供了通过本文所述(例如，上文所述)的方法产生的抗体或其抗原结合部分或融合蛋白，例如人抗体或人源化抗体。本文还涵盖了用本文所述的任何抗体治疗受试者(例如，患有癌症或免疫疾病的受试者)的方法。所述方法可以包括施用一种或多种另外的治疗剂，例如刺激或抑制免疫系统的治疗剂。例如，治疗剂可以靶向检查点抑制剂或共刺激分子。方法可以包括施用本文所述的组合物、双特异性分子或免疫缀合物。

附图说明

图1A示出了以下抗体在H2228细胞(非小细胞肺癌细胞系)中的抗体介导的CD73内化的动力学：H2228细胞中的11F11、4C3、6D11、具有4C3Vk1轻链的CD73.3-IgG1.1f(“3-Vh-hHC-IgG1.1f/4C3Vk1”)、具有11F11 Vk2轻链的CD73.4-IgG2CS(“4-Vh-hHC-IgG2-C219S/11F11-Vk2”)、CD73.10-IgG2CS(“CD73.10-Vh-hHC-IgG2-C219S”)、CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f(“CD73.10-Vh-hHC-IgG2-C219S-IgG1.1f”)和CD73.10-IgG1.1f(“CD73.10-Vh-hHC-IgG1.1f”)抗体。11F11(其属于IgG2同种型)、CD73.4-IgG2CS、CD73.10-IgG2CS和CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f抗体比属于IgG1同种型的其他测试抗体的内化更快且程度更高。

图1B示出了与图1A所示那些相同的抗体在HCC15细胞(非小细胞肺癌细胞系)中的抗体介导的CD73内化的动力学，其显示出与在H2228细胞中获得的那些类似的结果。

图1C示出了与图1A和图1B中所示那些相同的抗体以及CD73.11-IgG2CS(“11-Vh-hVC-IgG2-C219S”)在Calu6细胞中的抗体介导的CD73内化的动力学，其显示出与在H2228和HCC15细胞中获得的那些类似的结果。

图1D示出了与图1C中所示那些相同的抗体在NCI-2030细胞(非小细胞肺癌细胞系)中的抗体介导的CD73内化的动力学，其显示出与在H2228、HCC15和Calu6细胞中获得的那些类似的结果。

图1E示出了如通过流式细胞术测量的所指示抗体在Calu6细胞中的抗体介导的CD73内化的动力学。

图1F示出了如通过流式细胞术测量的所指示抗体在NCI-H292细胞(粘液表皮样肺癌细胞系)中的抗体介导的CD73内化的动力学，但其中在将细胞与抗体进行第一次孵育后没有洗出抗体。

图1G示出了在用所指示抗体处理的Calu6细胞中内化的CD73的百分比，其显示出随着时间的推移所指示抗体在Calu6细胞中的抗体介导的CD73内化。

图1H示出了随着时间的推移在用所指示抗体处理的NCI-H292细胞中内化的CD73的百分比，其显示出随着时间的推移所指示抗体在NCI-H292细胞中的抗体介导的CD73内化。

图1I示出了随着时间的推移在用所指示抗体处理的SNU-C1细胞(结肠癌细胞系)中内化的CD73的百分比，其显示出随着时间的推移所指示抗体在SNU-C1细胞中的抗体介导的CD73内化。

图1J示出了随着时间的推移在用所指示抗体处理的NCI-H1437细胞(非小细胞肺癌细胞系)中内化的CD73的百分比，其显示出随着时间的推移所指示抗体在NCI-H1437细胞中的抗体介导的CD73内化。

图2示出了所指示抗人GITR抗体与抗CD3(涂板的)和CD28激活的人CD4 T细胞的结合动力学，以及从图中得出的其相应的EC50值。

图3A、图3B和图3C示出了来自用具有不同重链恒定区的可溶性抗人GITR抗体刺激的供体CD4 T细胞的IFN-γ和IL-2分泌。图3A示出了来自用表达OKT3的CHO细胞以及各种浓度的具有IgG2-IgG1恒定区的抗人GITR抗体刺激的供体CD4 T细胞的IFN-γ分泌。图3B示出了来自用表达OKT3的CHO细胞以及各种浓度的IgG1重链恒定结构域或IgG2-IgG1杂合体重链恒定结构域刺激的供体CD4 T细胞的IL-2分泌。图3C示出了来自用表达OKT3的CHO细胞以及各种浓度的图3A和图3B中的抗体的无效应子形式(IgG1.1)刺激的供体CD4 T细胞的IL-2分泌。

图4示出了来自在渐增量的所指示抗人GITR抗体杂交瘤抗GITR(IgG2)和重组衍生物(作为IgG1f、IgG1.1(无效应子)或作为与IgG2铰链的嵌合体)的存在下在抗CD3单克隆抗体涂覆的板上培养的3A9-hGITR细胞的IL-2分泌。

图5A、图5B、图5C和图5D示出了IgG2铰链对抗体/抗原复合物的大小的影响。图5A、图5B和图5C示出了hCD73-his与含有不同恒定区的抗体CD73.4的复合物的SEC色谱图数据、DLS数据和MALS数据。图5D示出了来源于图5C中MALS确定的质量的hCD73-his/mAb复合物的示意模型。

图6A至图6D示出了CD73/mAb复合物的SEC-MALS数据。

图7A至图7B示出了CD73/mAb复合物的DLS数据。

图8A示出了随着时间的推移在用所指示抗体处理的Calu6细胞中内化的CD73的百分比，其显示出随着时间的推移所指示抗体在Calu6细胞中的抗体介导的CD73内化。

图8B示出了随着时间的推移在用所指示抗体处理的NCI-H292细胞中内化的CD73的百分比，其显示出随着时间的推移所指示抗体在Calu6细胞中的抗体介导的CD73内化。

图8C示出了用5μg/ml的所指示抗体处理0、5、15或30分钟的Calu6细胞的表面上CD73的水平。

图9示出了在具有所指示恒定区的抗GITR抗体的存在下与CHO-OKT3细胞共培养的CD4+T细胞分泌的IL-2水平。

图10示出了在添加每种所示抗体后1、4或21小时抗体介导的CD73内化的百分比。每种抗体的条形按照21小时(左)、4小时(中)和1小时(右)的顺序显示。

图11A示出了hCD73-his与含有不同恒定区序列的16种不同CD73.4抗体的1:1摩尔复合物的SEC色谱图数据的叠加。

图11B示出了来自图10A的色谱图的11-19.5min的色谱图数据的扩展，其中指示了4种不同的洗脱种类。

图11C示出了针对16种不同抗体/CD73-his复合物绘制的图11B的峰2的UV色谱图信号面积的百分比。数据按照峰面积渐增的顺序从左到右排列。

图12示出了抗体与抗his Fab捕获的FcγR-his蛋白的结合。假定1:1的mAb:FcγR结合化学计量比，将结合反应绘制为理论Rmax的百分比。每种抗体的条形按照片子底部的颜色图例所提供的顺序显示。

图13示出了抗体与抗his Fab捕获的FcgR-his蛋白的结合。假定1:1的mAb:FcγR结合化学计量比，将结合反应绘制为理论Rmax的百分比。每种抗体的条形按照片子底部的颜色图例所提供的顺序显示。

图14A示出了抗体与抗His Fab捕获的FcγR-his蛋白的结合。假定1:1的mAb:FcγR结合化学计量比，将结合反应绘制为理论Rmax的百分比。每种抗体的条形按照片子底部的颜色图例所提供的顺序显示。

图14B示出了抗体与抗his Fab捕获的FcγR-his蛋白的结合。假定1:1的mAb:FcγR结合化学计量比，将结合反应绘制为理论Rmax的百分比。每种抗体的条形按照片子底部的颜色图例所提供的顺序显示。

图15示出了抗GITR抗体的内化时间进程分析。

图16A示出了在时间零点处的GITR和早期内体标记物EEA2共定位分析。

图16B示出了在时间30和120分钟处的GITR和早期内体标记物EEA2共定位分析。

图16C示出了图16A和图16B中所示的内体共定位的定量结果，将其绘制为共定位的像素强度相对于总染色的比率。

图17A示出了用所指示的抗GITR抗体处理的CD8+T细胞中的NFkB信号传导激活。

图17B示出了用所指示的抗GITR抗体处理的CD4+T细胞中的NFkB信号传导激活。

图18示出了用所指示的抗GITR抗体处理的CD4+T细胞中的P38激活。

图19示出了具有构象A、B或A/B的IgG2抗体中二硫键的构型。

图20A示出了在不同浓度的具有所指示恒定区的抗GITR抗体的存在下与CHO-OKT3细胞共培养的CD4+T细胞分泌的IL-2水平。

图20B示出了在5μg/ml的具有所指示恒定区的抗GITR抗体的存在下与CHO-OKT3细胞共培养的CD4+T细胞分泌的IL-2水平(与图20A中的实验相同的实验)。

图20C示出了在1.25μg/ml的具有所指示恒定区的抗GITR抗体的存在下与CHO-OKT3细胞共培养的CD4+T细胞分泌的IL-2水平(与图20A中的实验相同的实验)。

图20D示出了在0.313μg/ml的具有所指示恒定区的抗GITR抗体的存在下与CHO-OKT3细胞共培养的CD4+T细胞分泌的IL-2水平(与图20A中的实验相同的实验)。

图21示出了hIgG1f的一部分的氨基酸序列，其中加下划线的序列在下面重现并显示了在hIgG1、hIgG1.1f、hIgG1.3f和hIgG1-P238K氨基酸序列中相对于野生型IgG1的突变的位置。

图22A、图22B、图22C、图22D、图22E、图22F、图22G、图22H、图22I、图22J、图22K和图22L示出了基于传感图数据在不同Fc区的情况下抗体Y1238与所指示Fc受体的解离速率的比较。

图23A、图23B、图23C、图23D、图23E和图23F示出了如通过icIEF表征的dAb-Fc分子的电荷图谱。

具体实施方式

在某些实施方案中，本发明之一至少部分基于以下发现：当抗体相对于包含非IgG2铰链的相同抗体(或相对于包含IgG1恒定区的相同抗体)而言包含IgG2铰链时，抗体的以下特性得以增强或改变：(i)内化；(ii)激动剂功能；(iii)受体介导的细胞内信号传导；(iv)ADCC；和(v)抗体/抗原复合物的重量。另外，当抗体除了IgG2铰链以外还包含IgG2 CH1结构域时，所述抗体的这些增强或改变的特征进一步增强或改变。还已经观察到，与具有IgG1 CH1结构域的相同抗体相比，具有IgG2 CH1结构域而没有IgG2铰链的抗体具有增强或改变的活性。不希望受限于特定的作用机制，已经发现IgG2铰链的增强作用与抗体/抗原复合物的大小增加相关。当抗体具有IgG2铰链时，抗体/抗原复合物的大小增加可能是由于IgG2铰链相对于其他同种型的刚性更高。此外，已经显示可以对IgG2铰链和CH1结构域的特定区域或氨基酸残基进行修饰，而优选对其他区域或氨基酸残基不进行修饰，以保留增强或改变的活性。

如本文进一步描述的，赋予抗体增强或修饰的活性的这些经修饰的重链恒定区(或其抗原结合区)可以具有效应子功能。因此，已显示可以产生具有由IgG2铰链和/或CH1结构域赋予的有利特性并且还具有效应子功能的抗体。

本发明还至少部分基于以下发现：IgG1或IgG2抗体中铰链的某些部分的缺失导致抗体相对于具有IgG1恒定区的抗体具有增强或改变的特性。

除了赋予增强的特性的经修饰的重链区以外，如前两段所述，本文还描述了如下经修饰的重链区，其具有降低低亲和力和/或高亲和力FcGR结合和/或ADCC、ADCP和/或CDC效应子功能的突变，所述恒定区包含例如P238突变，例如P238K。在一些实施方案中，将这样的一个或多个突变与降低FcRg结合、ADCC、ADCP和/或CDC的一个或多个突变和/或增强(i)内化；(ii)激动剂功能；(iii)受体介导的细胞内信号传导；和/或(v)抗体/抗原复合物的重量的突变组合。

因此，本文提供了(i)具有经修饰的重链恒定区的抗体和其使用方法，所述经修饰的重链恒定区赋予抗体的抗原结合区增强或改变的特性；和(ii)用于增强或改变包含例如非IgG2铰链和/或CH1结构域的抗体的某些生物学特性(如内化、激动作用和拮抗作用)的方法，其中所述方法包括用IgG2铰链和/或IgG2 CH1结构域或其部分替代抗体的非IgG2铰链和/或CH1结构域。

本文提供了“经修饰的重链恒定区”，其相对于具有不同恒定区的相同抗体，增强抗体(例如，具有非IgG2铰链和/或非IgG2 CH1结构域的抗体)的某些生物学特性。示例性的经修饰的重链恒定区包含IgG2铰链、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域，其中这些恒定结构域中的至少一个不是IgG2同种型的并且可以例如是IgG1、IgG3或IgG4的。在某些实施方案中，经修饰的重链恒定区包含IgG2铰链以及IgG1 CH2和CH3结构域。在某些实施方案中，经修饰的重链恒定区包含IgG2 CH1结构域和IgG2铰链。在某些实施方案中，经修饰的重链恒定区包含IgG2 CH1结构域、IgG2铰链、IgG1 CH2结构域和IgG1 CH3结构域。经修饰的重链恒定区可以具有与野生型IgG1的效应子功能类似的效应子功能，或者可以工程化为具有相对于野生型IgG的效应子功能降低或增强的效应子功能。经修饰的重链恒定区可以包含野生型CH1、铰链、CH2和/或CH3结构域或其变体，例如相对于相应的野生型结构域具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加和/或具有与相应的野生型序列至少90％相同或更多相同的氨基酸序列的CH1、铰链、CH2和/或CH3结构域。

还提供了包含IgG1.3重链恒定区的抗体和融合蛋白。包含IgG1.3重链恒定区的抗体可以是拮抗剂抗体或激动剂抗体，如针对检查点抑制剂的拮抗剂抗体或针对检查点刺激剂的激动剂抗体。

定义

为了可以更容易地理解本说明书，首先定义某些术语。在整个具体实施方式中阐述了另外的定义。

如本文所用，术语“抗体”可以包括完整抗体和其任何抗原结合片段(例如，包含铰链的抗原结合片段，包含铰链和CH1结构域的抗原结合片段，包含铰链和CH2结构域的抗原结合片段，或包含铰链、CH2结构域和一部分的CH3结构域的抗原结合片段)或单链。在一个实施方案中，“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的蛋白质(例如，糖蛋白)或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为V

免疫球蛋白可以来自任何公知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG同种型在某些物种中分为以下亚类：人中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及小鼠中的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。在某些实施方案中，本文所述的抗体属于人IgG1或IgG2亚型。免疫球蛋白(例如，人IgG1)以若干种同种异型存在，它们彼此最多有几个氨基酸的差异。举例来说，“抗体”可以包括天然存在的抗体和非天然存在的抗体；单克隆抗体和多克隆抗体；嵌合抗体和人源化抗体；人抗体和非人抗体；全合成抗体；以及单链抗体。

在某些实施方案中，抗体的重链包含C末端赖氨酸；C末端甘氨酸(丢失了C末端赖氨酸)，或缺少GK或缺少K。当提及包含本文所述的经修饰的重链恒定区的抗体时，所述抗体可以包含具有C末端GK或K或者可替代地缺少GK或K的所提供序列。

氨基酸编号是按照Kabat(Kabat等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,MD)中的EU索引，以及按照美国专利申请公开号2008/0248028的图3c至图3f。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”是指抗体的保留与抗原特异性地结合的能力的一个或多个片段。抗体的抗原结合部分可以是“含铰链的抗原结合部分”。已经显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。涵盖在本文所述的抗体的“抗原结合部分”术语内的结合片段的例子包括(i)Fab片段，即由V

可变结构域的“CDR”是根据以下定义或本领域熟知的CDR测定方法来鉴定的在高变区内的氨基酸残基：Kabat、Chothia、Kabat和Chothia两者的组合、AbM、接触和/或构象定义。可以将抗体CDR鉴定为最初由Kabat等人定义的高变区。参见例如，Kabat等人,1992,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,NIH,Washington D.C。也可以将CDR的位置鉴定为通过Chothia等等最初描述的结构性环结构。参见例如，Chothia等人,1989,Nature 342:877-883。用于CDR鉴定的其他方法包括“AbM定义”，它是Kabat与Chothia之间的折中方案并且是使用Oxford Molecular的AbM抗体建模软件(现在为

如本文所用，“同种型”是指由重链恒定结构域基因编码的抗体种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE抗体)。每个野生型人IgG恒定区(包括所有结构域，即CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域)的全长氨基酸序列可以例如作为P01857(IgG1)、P01859(IgG2)、P01860(IgG3)和P01861(IgG4)或其不同的同种异型(分别为SEQ IDNO:1、6、11和16)编入网上可获得的UniProt数据库中。如本文所用，重链恒定区的结构域(例如，铰链)是“IgG1同种型”、“IgG2同种型”、“IgG3同种型”或“IgG4同种型”的，条件是所述结构域包含各同种型的相应结构域或其变体(所述变体与各同种型的相应结构域的同源性高于与其他同种型的相应结构域的同源性)的氨基酸序列。

“同种异型”是指特定同种型组内天然存在的变体，所述变体在一些氨基酸上有所不同(参见例如，Jefferies等人(2009)mAbs 1:1)。本文所述的抗体可以属于任何同种异型。

“野生型”蛋白质或其部分是如在自然界中发现的蛋白质形式。野生型蛋白质(例如，重链恒定区)的氨基酸序列是如在自然界中存在的蛋白质的氨基酸序列。由于同种异型差异，野生型蛋白质可能存在多于一个氨基酸序列。例如，存在天然存在的人IGg1重链恒定区的几种同种异型(参见例如，Jeffries等人(2009)mAbs 1:1)。

“Fc区”(片段可结晶区)或“Fc结构域”或“Fc”是指抗体的重链的C末端区，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体的结合或与经典补体系统的第一成分(C1q)的结合。因此，同种型IgG的抗体的Fc区包含抗体中除第一恒定区免疫球蛋白结构域(CH1)以外的重链恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，在抗体的两条重链中的每条重链中，Fc区包含C

“效应子功能”是指抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用或由此产生的生化事件。示例性的“效应子功能”包括Clq结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、FcγR介导的效应子功能(如ADCC和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP))和细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调。此类效应子功能通常需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合。

“Fc受体”或“FcR”是与免疫球蛋白的Fc区结合的受体。与IgG抗体结合的FcR包含FcγR家族的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγR家族由三种激活性受体(小鼠中的FcγRI、FcγRIII和FcγRIV；人中的FcγRIA、FcγRIIA和FcγRIIIA)和一种抑制性受体(FcγRIIB)组成。表1中总结了人FcγR的各种特性。大多数先天性效应细胞类型共表达一种或多种激活性FcγR和抑制性FcγRIIB，而自然杀伤(NK)细胞选择性地表达一种激活性Fc受体(小鼠中的FcγRIII和人中的FcγRIIIA)，但在小鼠和人中不表达抑制性FcγRIIB。人IgG1与大多数人Fc受体结合，并且就其所结合的激活性Fc受体的类型而言，被认为等同于鼠IgG2a。

表1.人FcγR的特性

“铰链”、“铰链结构域”或“铰链区”或“抗体铰链区”是指重链恒定区的结构域，其将CH1结构域与CH2结构域连接并且包括所述铰链的上部、中部和下部(Roux等人J.Immunol.1998 161:4083)。铰链提供了在抗体的结合区与效应子区之间不同水平的柔性，并且还提供了在两个重链恒定区之间的分子间二硫键键合的位点。如本文所用，对于所有IgG同种型，铰链在Glu216处开始并且在Gly237处结束(Roux等人,1998 J Immunol 161:4083)。表2中示出了野生型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4铰链的序列。

表2.

铰链区氨基酸

*CH1结构域的C末端氨基酸序列。

术语“铰链”包括野生型铰链(如表3中列出的那些)以及其变体(例如，非天然存在的铰链或经修饰的铰链)。例如，术语“IgG2铰链”包括如表3中所示的野生型IgG2铰链以及具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5个和/或至多5、4、3、2或1个突变(例如，替代、缺失或添加)的变体。示例性的IgG2铰链变体包括其中1、2、3或全部4个半胱氨酸(C219、C220、C226和C229)被改变为另一个氨基酸的IgG2铰链。在特定的实施方案中，IgG2铰链包含C219X或C220X取代，其中X是除半胱氨酸以外的任何氨基酸。IgG2铰链可以包含取代，所述取代单独地或与重链或轻链的其他区域中的一个或多个取代一起导致包含所述铰链的抗体采用A或B形式(参见例如，Allen等人(2009)Biochemistry 48:3755)。在某些实施方案中，铰链是包含来自至少两个同种型的序列的杂合体铰链。例如，铰链可以包含来自一个同种型的上部、中部或下部铰链，并且所述铰链的其余部分来自一个或多个其他同种型。例如，铰链可以是IgG2/IgG1铰链，并且可以包含例如IgG2的上部和中部铰链以及IgG1的下部铰链。铰链可以具有效应子功能或失去效应子功能。例如，野生型IgG1的下部铰链提供效应子功能。

“非IgG2”铰链是指不是IgG2同种型的铰链。

术语“CH1结构域”是指将可变结构域与重链恒定结构域中的铰链连接的重链恒定区。如本文所用，CH1结构域在A118处开始并且在V215处结束。术语“CH1结构域”包括野生型CH1结构域(如对于IgG1，具有SEQ ID NO:2，并且对于IgG2，具有SEQ ID NO:7；表3)以及其变体(例如，非天然存在的CH1结构域或经修饰的CH1结构域)。例如，术语“CH1结构域”包括野生型CH1结构域及其具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5和/或至多5、4、3、2或1个突变(例如，取代、缺失或添加)的变体。示例性的CH1结构域包括具有突变的CH1结构域，所述突变改变抗体的生物活性，如ADCC、CDC或半衰期。本文提供了对CH1结构域的修饰，所述修饰影响抗体的生物活性。

术语“CH2结构域”是指将重链恒定结构域中的铰链与CH3结构域连接的重链恒定区。如本文所用，CH2结构域在P238处开始并且在K340处结束。术语“CH2结构域”包括野生型CH2结构域(如对于IgG1，具有SEQ ID NO:4；表3)以及其变体(例如，非天然存在的CH2结构域或经修饰的CH2结构域)。例如，术语“CH2结构域”包括野生型CH2结构域及其具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5和/或至多5、4、3、2或1个突变(例如，取代、缺失或添加)的变体。示例性的CH2结构域包括具有突变的CH2结构域，所述突变改变抗体的生物活性，如ADCC、CDC或半衰期。在某些实施方案中，CH2结构域包含降低效应子功能的取代A330S/P331S。本文提供了对CH2结构域的其他修饰，所述其他修饰影响抗体的生物活性。

术语“CH3结构域”是指在重链恒定结构域中的CH2结构域的C末端的重链恒定区。如本文所用，CH3结构域在G341处开始并且在K447处结束。术语“CH3结构域”包括野生型CH3结构域(如对于IgG1，具有SEQ ID NO:5；表3)以及其变体(例如，非天然存在的CH3结构域或经修饰的CH3结构域)。例如，术语“CH3结构域”包括野生型CH3结构域及其具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5和/或至多5、4、3、2或1个突变(例如，取代、缺失或添加)的变体。示例性的CH3结构域包括具有突变的CH3结构域，所述突变改变抗体的生物活性，如ADCC、CDC或半衰期。本文提供了对CH3结构域的修饰，所述修饰影响抗体的生物活性。

表3

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指对特定表位展示出单一结合特异性和亲和力的抗体，或抗体组合物，在所述抗体组合物中所有抗体对特定表位展示出单一结合特异性和亲和力。通常，此类单克隆抗体将衍生自编码所述抗体的单个细胞或核酸，并且将在没有故意引入任何序列改变的情况下繁殖。因此，术语“人单克隆抗体”是指具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和任选的恒定区的单克隆抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体是由杂交瘤产生的，所述杂交瘤是例如通过融合获自转基因或转染色体非人动物(例如，具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因小鼠)的B细胞与永生化细胞而获得的。

如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如(a)从对于人免疫球蛋白基因而言是转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或者由其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从转化用于表达所述抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)分离的抗体，(c)从重组的组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体包含可变区和恒定区，所述可变区和恒定区利用特定人种系免疫球蛋白序列(由种系基因编码)，但包括发生在例如抗体成熟过程中的后续重排和突变。如本领域已知的(参见例如，Lonberg(2005)Nature Biotech.23(9):1117-1125)，可变区含有由如下各种基因编码的抗原结合结构域，所述各种基因重排以形成对外来抗原具有特异性的抗体。除了重排以外，还可以通过多个单氨基酸变化(称为体细胞突变或超突变)进一步修饰可变区，以增加抗体对外来抗原的亲和力。进一步响应于抗原，恒定区将改变(即，同种型转换)。因此，编码对抗原有应答的轻链和重链免疫球蛋白多肽的重排或体细胞突变的核酸序列可以与原始种系序列不相同，但基本上相同或类似(即，具有至少80％同一性)。

“人”抗体(HuMAb)是指具有其中框架区和CDR区两者均衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体含有恒定区，则所述恒定区也衍生自人种系免疫球蛋白序列。本文所述的抗体可以包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中衍生自另一种哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已经被移植到人框架序列上的抗体。术语“人”抗体和“完全人”抗体同义使用。

“人源化”抗体是指其中非人抗体的CDR结构域外的一些、大部分或所有氨基酸被衍生自人免疫球蛋白的相应氨基酸替代的抗体。在人源化形式的抗体的一个实施方案中，CDR结构域外的一些、大部分或所有氨基酸已被来自人免疫球蛋白的氨基酸替代，而一个或多个CDR区内的一些、大部分或所有氨基酸未改变。氨基酸的少量添加、缺失、插入、取代或修饰是被允许的，只要它们不消除抗体结合特定抗原的能力即可。“人源化”抗体保留与原始抗体类似的抗原特异性。

“嵌合抗体”是指其中可变区衍生自一个物种并且恒定区衍生自另一物种的抗体，如其中可变区衍生自小鼠抗体并且恒定区衍生自人抗体的抗体。

“双特异性”或“双功能抗体”是具有两个不同的重链/轻链对从而产生了对不同抗原具有特异性的两个抗原结合位点的人工杂合体抗体。双特异性抗体可以通过多种方法产生，所述方法包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见例如，Songsivilai和Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)；Kostelny等人,J.Immunol.148,1547-1553(1992)。

短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”与术语“与抗原特异性地结合的抗体”在本文中可互换使用。

如本文所用，“分离的抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与抗原“x”特异性地结合的分离的抗体基本上不含特异性地结合除抗原“x”以外的抗原的抗体)。然而，与抗原“x”的表位特异性地结合的分离的抗体可能与来自不同物种的其他抗原“x”蛋白具有交叉反应性。

如本文所用，“激动剂抗体”是指作为共刺激受体的激动剂的抗体，例如能够通过刺激蛋白质(如B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、GITR、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、CD70、或CD27、DR3或CD28H蛋白)的活性从而刺激免疫细胞(例如，T细胞)来增强受试者的免疫系统(或免疫应答)的抗体。在某些实施方案中，激动剂抗体是增强抑制性受体(例如，CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、或LAG-3、TIM-3、半乳糖凝集素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳糖凝集素-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、2B4、CD48、GARP、CD73、PD1H、LAIR1、TIM-1或TIM-4)的活性从而抑制免疫应答的抗体。

如本文所用，“拮抗剂抗体”是指作为免疫细胞(例如，T细胞)上的抑制信号的拮抗剂的抗体，例如能够抑制或阻断如下蛋白质的抗体，所述蛋白质(例如，免疫检查点抑制剂)例如为CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、或LAG-3、TIM-3、半乳糖凝集素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳糖凝集素-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、2B4、CD48、GARP、CD73、PD1H、LAIR1、TIM-1或TIM-4抑制T细胞激活，从而刺激免疫应答。在某些实施方案中，拮抗剂抗体是抑制刺激性受体(例如，B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、GITR、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、CD70、或CD27、DR3或CD28H)的活性从而抑制免疫应答的抗体。

激动剂抗体和拮抗剂抗体两者均会导致放大抗原特异性T细胞应答，或导致抑制抗原特异性T细胞应答(免疫检查点调节剂)。

术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原(例如，GITR)上免疫球蛋白或抗体所特异性地结合的位点。蛋白质抗原内的表位可以由连续氨基酸形成(通常为线性表位)，或由通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成(通常为构象表位)。由连续氨基酸形成的表位通常(但不总是)在暴露于变性溶剂时保留，然而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包含处于独特空间构象的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。用于确定给定抗体结合哪些表位的方法(即，表位作图)是本领域熟知的，并且包括例如免疫印迹和免疫沉淀测定，其中测试重叠或连续肽与给定抗体的反应性。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术和本文所述的那些技术，例如X射线晶体学、二维核磁共振和HDX-MS(参见例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in MolecularBiology,第66卷,G.E.Morris编辑(1996))。

如本文所用的应用于对象的术语“天然存在的”是指对象可以在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中的可以从天然来源分离且尚未经实验室的人员有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。

“多肽”是指包含至少两个连续连接的氨基酸残基的链，所述链的长度没有上限。蛋白质中的一个或多个氨基酸残基可以含有修饰，如但不限于糖基化、磷酸化或二硫键。“蛋白质”可以包含一种或多种多肽。

如本文所用，术语“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，并且可以是cDNA。

还提供了本文所述的序列的“保守序列修饰”，包括例如保守的核苷酸和氨基酸取代以及核苷酸和氨基酸添加和缺失。例如，可以通过本领域已知的标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入SEQ ID NO:1-275中。保守序列修饰包括保守氨基酸取代，其中将氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基替代。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

在一个实施方案中，对重链恒定区或其结构域的氨基酸序列修饰不会修饰或消除重链恒定区的某些特性。这些特性包括例如铰链的刚性或硬度以及抗体的激动剂或拮抗剂活性。在某些实施方案中，对重链恒定区或其结构域的氨基酸序列修饰确实修饰或消除重链恒定区的某些特性。

鉴定消除和不消除抗体和/或恒定区特性的氨基酸保守取代的方法是本领域熟知的，例如如本文实施例部分中所述的。

对于核酸，术语“实质同源性”指示当最佳比对和比较时，两个核酸或其指定的序列在至少约80％的核苷酸、通常至少约90％至95％的核苷酸、更优选至少约98％至99.5％的核苷酸中是相同的，其中具有适当的核苷酸插入或缺失。可替代地，当区段在选择性杂交条件下与链的互补体杂交时，存在实质同源性。

对于多肽，术语“实质同源性”指示当最佳比对和比较时，两个多肽或其指定的序列在至少约80％的氨基酸、通常至少约90％至95％、更优选至少约98％至99.5％的氨基酸中相同，其中具有适当的氨基酸插入或缺失。

两个序列之间的同一性百分比是当序列进行最佳比对时序列共有的相同位置数的函数(即，同源性％＝相同位置数/总位置数x100)，其中确定的最佳比对考虑了空位的数量以及每个空位的长度，需要引入这些空位以实现两个序列的最佳比对。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成，如以下非限制性例子中所述的。

可以使用GCG软件包(可以在http://www.gcg.com上获得)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6来确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。也可以使用已并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller(CABIOS,4:11-17(1989))的算法，使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4来确定两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比。另外，可以使用已并入GCG软件包(可以在http://www.gcg.com上获得)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))的算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。

本文所述的核酸和蛋白质序列还可以用作“查询序列”，以在公共数据库中进行搜索从而例如鉴定相关序列。可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行此类搜索。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST程序来进行，得分＝100，字长＝12，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可用XBLAST程序来进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本文所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul等人,(1997)Nucleic AcidsRes.25(17):3389-3402中所述的使用空位BLAST(Gapped BLAST)。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。

如本文所用，术语“抗原”是指任何天然或合成的免疫原性物质，如蛋白质、肽或半抗原。抗原可以是全长或成熟的蛋白质或其片段。

“免疫应答”是指脊椎动物内针对外来因子(agent)的生物反应，所述反应保护生物免受这些因子和由其引起的疾病的侵害。免疫应答是由免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞)和通过这些细胞中的任一种或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用介导的，所述作用导致选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或消除脊椎动物身体中侵入的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌性或其他异常细胞，或者在自身免疫性或病理性炎症的情况下导致选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或消除正常的人细胞或组织。免疫反应包括例如T细胞(例如，效应T细胞或Th细胞，如CD4+或CD8+T细胞)的激活或抑制，或Treg细胞的抑制。

“免疫调节剂”(“immunomodulator”或“immunoregulator”)是指可以参与调节(modulating、regulating)或改变免疫应答的药剂，例如信号传导途径的组分。“调节”(“modulating”、“regulating”)或“改变”免疫应答是指免疫系统的细胞或这种细胞(例如，效应T细胞)的活性的任何改变。这种调节包括对免疫系统的刺激或抑制，这可以通过各种细胞类型数量的增加或减少、这些细胞的活性的增加或降低或免疫系统内可能发生的任何其他变化来显示。已经鉴定了抑制性和刺激性两种免疫调节剂，其中一些在肿瘤微环境中可能具有增强的功能。在优选的实施方案中，免疫调节剂位于T细胞的表面上。“免疫调节靶标”(“immunomodulatory target”或“immunoregulatory target”)是这样的免疫调节剂，其被靶向用于与物质、药剂、部分、化合物或分子结合，并且所述免疫调节靶标的活性因物质、药剂、部分、化合物或分子的结合而改变。免疫调节靶标包括例如细胞表面上的受体(“免疫调节受体”)和受体配体(“免疫调节配体”)。

“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式改变免疫应答的方法治疗患有疾病或者有感染疾病或遭受疾病复发风险的受试者。

“免疫刺激疗法”或“免疫刺激性疗法”是指导致增加(诱导或增强)受试者的免疫应答从而例如治疗癌症的疗法。

“增强内源免疫应答”意指增加受试者的现有免疫应答的有效性或效力。有效性和效力的这种增加可以例如通过以下方式来实现：克服抑制内源宿主免疫应答的机制或者刺激增强内源宿主免疫应答的机制。

“T效应”(“T

如本文所用，术语“连接”是指两个或更多个分子的缔合。连接可以是共价的或非共价的。连接也可以是遗传的(即，重组融合)。可以使用多种本领域公认的技术(如化学缀合和重组蛋白生产)来实现此类连接。

如本文所用，“施用”是指使用本领域技术人员已知的任何不同方法和递送系统将包含治疗剂的组合物物理引入受试者。本文所述的抗体的优选施用途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用以外的施用方式(通常通过注射施用)，并且包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眼眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注以及体内电穿孔。可替代地，本文所述的抗体可以经由非肠胃外途径(如局部、表皮或粘膜施用途径)施用，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。施用还可以例如进行一次、多次和/或经一个或多个延长的时间段。

如本文所用，术语“T细胞介导的应答”是指由T细胞介导的应答，所述T细胞包括效应T细胞(例如，CD8

如本文所用，术语“细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答”是指由细胞毒性T细胞诱导的免疫应答。CTL应答主要由CD8

如本文所用，术语“抑制”或“阻断”(例如，指配体对其受体或对随后的细胞内应答的抑制/阻断)可互换使用，并且包括部分和完全抑制/阻断两者。在一些实施方案中，抗体将结合抑制至少约50％，例如至少约60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％，例如如本文进一步描述所确定的。

如本文所用，“癌症”是指一组广泛的疾病，其特征在于体内异常细胞的不受控制的生长。不受调节的细胞分裂可导致恶性肿瘤或细胞的形成，所述恶性肿瘤或细胞侵入邻近组织并且可以通过淋巴系统或血流转移到身体的远端部分。

如本文所用，术语“治疗”(“treat”、“treating”和“treatment”)是指对受试者进行的任何类型的干预或过程，目的是逆转、减轻、缓解、抑制或减缓或防止症状、并发症、病症或与疾病有关的生化指标的进展、发展、严重程度或复发。预防是指向未患疾病的受试者施用以预防疾病的发生或(如果发生疾病)使疾病的影响减至最小。

“血液恶性肿瘤”包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴恶性肿瘤以及脾和淋巴结的癌症。示例性淋巴瘤包括B细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤两者。B细胞淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤和大多数非霍奇金淋巴瘤两者。B细胞淋巴瘤的非限制性例子包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、小细胞淋巴细胞淋巴瘤(与慢性淋巴细胞性白血病重叠)、套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、纵隔大B细胞淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症(

将术语“有效剂量”(“effective dose”或“effective dosage”)定义为足以达到或至少部分达到所需效果的量。“治疗有效量”或“治疗有效剂量”的药物或治疗剂是当单独地或与另一种治疗剂组合使用时，促进通过疾病症状的严重程度的降低、无疾病症状时期的频率和持续时间的增加或由于疾病困扰引起的损伤或残疾的预防所证实的疾病消退的任何量的药物。“预防有效量”或“预防有效剂量”的药物是当单独地或与另一种治疗剂组合施用给有患上疾病或发生疾病复发风险的受试者时，抑制疾病的发展或复发的量的药物。可以使用熟练从业者已知的各种方法评价治疗剂或预防剂促进疾病消退或抑制疾病发展或复发的能力，如在临床试验期间的人类受试者中、在预测人类中功效的动物模型系统中、或通过测定药剂在体外测定中的活性来评价。

举例来说，抗癌剂是在受试者中减缓癌症进展或促进癌症消退的药物。在优选的实施方案中，治疗有效量的药物促进癌症消退至消除癌症的程度。“促进癌症消退”意指单独地或与抗肿瘤剂组合施用有效量的药物导致肿瘤生长或尺寸的减小、肿瘤坏死、至少一种疾病症状的严重程度降低、无疾病症状时期的频率和持续时间的增加、由于疾病困扰引起的损伤或伤残的预防、或者患者的疾病症状以其他方式的改善。药理学有效性是指药物促进患者的癌症消退的能力。生理安全性是指由药物的施用引起的在细胞、器官和/或生物水平上可接受的低水平毒性或其他不利生理效应(不利效应)。

举例来说，对于肿瘤的治疗，相对于未治疗的受试者，治疗有效量或剂量的药物优选将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约20％、更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％、仍更优选至少约80％。在最优选的实施方案中，治疗有效量或剂量的药物完全抑制细胞生长或肿瘤生长，即优选将细胞生长或肿瘤生长抑制100％。可以使用下文描述的测定来评价化合物抑制肿瘤生长的能力。可替代地，可以通过检查化合物抑制细胞生长的能力来评价组合物的这种特性，可以通过熟练从业者已知的测定在体外测量这种抑制。在本文所述的其他优选的实施方案中，可以观察到肿瘤消退并且可以持续至少约20天、更优选至少约40天、或甚至更优选至少约60天的时间段。

术语“患者”和“受试者”是指接受预防性或治疗性治疗的任何人或非人动物。例如，本文所述的方法和组合物可以用于治疗患有癌症的受试者。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、绵羊、狗、母牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。

在以下小节中将进一步详细描述本文所述的各个方面。

I.增强或改变生物学特性的经修饰的重链恒定区

本文描述了“经修饰的重链恒定区”，当存在于抗体中时相对于不具有经修饰的重链恒定区的相同抗体(如含非IgG2铰链的抗体，例如IgG1抗体)，增强或改变抗体的某些生物学特性或特征。抗体的增强或改变的生物学特性包括：

(a)增加或改变的细胞内化；

(b)增加或改变的激动剂活性；

(c)增加或改变的拮抗剂活性或阻断活性；

(d)增强的ADCC；

(d)产生新的特性；

(e)增加或改变的信号转导；

(f)形成较大的抗体/抗原交联复合物；

(g)靶细胞表面分子的增加的聚集或寡聚化；

(h)免疫应答的增加的刺激或增强；和/或

(i)对免疫应答的增加的抑制。

在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定区的抗体相对于不包含经修饰的重链恒定区并且包含例如IgG1重链的相同抗体，更有效地介导抗体依赖性受体(或配体或表面分子)内化，例如，在所述抗体与其在细胞膜上的靶标结合后，所述抗体以更高的内化速率和/或程度使靶分子或表面分子(例如，受体或配体)内化和/或使自身内化至细胞中。抗体内化的速率和程度可以例如如实施例中所示来确定。如例如通过内化的T

在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定区的抗体相对于不包含经修饰的重链恒定区并且包含例如IgG1重链的相同抗体具有更有力的激动剂活性。在某些实施方案中，增强的激动剂活性增强了靶分子(例如，GITR)或者刺激或共刺激免疫应答的其他分子的刺激活性，例如T细胞活性。在某些实施方案中，增强的激动剂活性增强了抑制免疫应答的靶分子(例如，检查点抑制剂)的抑制活性，例如T细胞活性。调节T细胞活性的抗体的增强的激动剂活性可以例如如实施例中所示，例如通过测量来自与抗体接触的T细胞的IFN-γ或IL-2分泌水平来确定。与刺激性靶标结合的抗体的激动剂活性可以增强至少10％、30％、50％、75％、2倍、3倍、5倍或更多，如通过效应T细胞的增加的细胞因子释放或增加的增殖所定义的；如果在Treg上的接合降低Treg功能，则通过降低的T调节细胞活性来定义；或通过增加的Treg耗竭来定义。例如，用包含经修饰的重链恒定区的与刺激性靶标结合的抗体刺激的T细胞所分泌的IFN-γ或IL-2的量可以比用不包含经修饰的重链恒定区的相同抗体刺激的T细胞所分泌的IFN-γ或IL-2的量高至少10％、30％、50％、75％、2倍、3倍、5倍或更多。与抑制性靶标结合的抗体的激动剂活性可以增强至少10％、30％、50％、75％、2倍、3倍、5倍或更多，如通过减少的细胞因子释放或减少的效应T细胞增殖；增加的T调节细胞活性；或减少的Treg耗竭所确定的。例如，用包含经修饰的重链恒定区的与抑制性靶标结合的抗体刺激的T细胞所分泌的IFN-γ或IL-2的量可以比用不包含经修饰的重链恒定区的相同抗体刺激的T细胞所分泌的IFN-γ或IL-2的量低至少10％、30％、50％、75％、2倍、3倍、5倍或更多。

在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定区的抗体相对于不包含经修饰的重链恒定区并且包含例如IgG1重链的相同抗体具有更有力的拮抗剂活性或阻断活性。可以例如通过在包括T细胞激活条件的情况下测量细胞因子释放和/或增殖来确定抗体的增强的拮抗剂活性。拮抗剂活性可以增强至少10％、30％、50％、75％、2倍、3倍、5倍或更多。

在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定区的抗体相对于不包含经修饰的重链恒定区并且包含例如IgG1重链的相同抗体具有增强的ADCC活性。可以根据本领域已知的方法确定增强的ADCC。ADCC可以增强至少10％、30％、50％、2倍、5倍或更多。

在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定区的抗体相对于不包含经修饰的重链恒定区并且包含例如IgG1重链的相同抗体具有形成更大的抗体/抗原交联复合物的能力。可以如例如在实施例中所述的确定形成复合物的能力。与包含经修饰的重链恒定区的抗体形成的抗体/抗原复合物可以比与不包含经修饰的重链恒定区的相同抗体形成的复合物大至少50％、2倍、3倍、5倍或10倍。在某些实施方案中，至少2,000kDa、3,000kDa、5000kDa、10,000kDa、50,000kDa或100,000kDa的复合物是用具有经修饰的重链恒定区的抗体形成的。

在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定区的抗体相对于不包含经修饰的重链恒定区并且包含例如IgG1重链的相同抗体触发细胞表面上的靶分子更多的聚集或寡聚化。可以例如通过测量抗体/抗原复合物的大小来确定聚集或寡聚化的程度。

在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定区的抗体相对于不包含经修饰的重链恒定区并且包含例如IgG1重链的相同抗体转导更高水平或不同类型的信号传导或信号转导。可以通过确定信号转导途径中一种或多种蛋白质的激活水平来监测信号转导。在某些实施方案中，通过测量信号转导蛋白(例如，NFkB或p38)的活性(或磷酸化)来确定信号转导，如例如实施例中所述的。由包含经修饰的重链恒定区的抗体触发的信号转导可以比用不包含经修饰的重链恒定区的相同抗体触发的信号转导高或低至少10％、20％、50％、2倍、5倍或更多。例如，相对于用具有IgG1重链的相同抗体获得的信号转导，由与刺激分子(例如，GITR)结合并且包含经修饰的重链恒定区的抗体触发的信号转导可以增强至少10％。例如，NFkB的EC

在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定区的抗体相对于不包含经修饰的重链恒定区并且包含例如IgG1重链的相同抗体具有增加的刺激或增强免疫应答或免疫系统的能力。增加的刺激免疫应答或免疫系统的能力可能是由于增强的T细胞共刺激受体的激动剂活性和/或增强的抑制性受体的拮抗剂活性导致的。增加的刺激免疫应答或免疫系统的能力可以在测量免疫应答的测定，例如测量细胞因子或趋化因子释放、细胞溶解活性(在靶细胞上直接测定的或经由检测CD107a或颗粒酶间接测定的)和增殖的变化的测定中通过EC

在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定区的抗体相对于不包含经修饰的重链恒定区并且包含例如IgG1重链的相同抗体具有增加的抗增殖或抗肿瘤活性。可以例如通过在已用抗体治疗的动物中肿瘤的生长来确定抗体的增强的抗肿瘤活性。抗肿瘤活性可以增强至少10％、30％、50％、75％、2倍、3倍、5倍或更多。抗肿瘤活性可以测量为例如肿瘤负荷的减少，例如通过减少的肿瘤生长动力学和完全的肿瘤消退来显示的。

在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定区的抗体相对于不包含经修饰的重链恒定区并且包含例如IgG1重链的相同抗体具有增加的抑制(inhibit或suppress)免疫应答或免疫系统的能力。增加的抑制(inhibit或suppress)免疫应答或免疫系统的能力可能是由于增强的T细胞共刺激受体的拮抗剂活性和/或增强的抑制性受体的激动剂活性导致的。增加的刺激免疫应答或免疫系统的能力可以在测量免疫应答的测定，例如测量细胞因子或趋化因子释放、细胞溶解活性(在靶细胞上直接测定的或经由检测CD107a或颗粒酶间接测定的)和增殖的变化的测定中通过EC

在某些实施方案中，与其他重链恒定区例如IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4重链恒定区相比，经修饰的重链恒定区或其部分(例如，铰链)的刚性更大。例如，经修饰的重链恒定区是非天然存在的重链恒定区，与天然存在的重链恒定区或其铰链相比，所述非天然存在的重链恒定区的刚性更大或者具有刚性更大的部分(例如，铰链)。重链恒定区或其部分(如铰链)的刚性可以通过例如计算机建模、电子显微镜、光谱法(如核磁共振(NMR)、X射线晶体学(B因子))或用于测量或比较包含所述铰链的抗体的回转半径的沉降速度分析超速离心(AUC)来确定。可替代地，可以通过测量抗体/抗原复合物的大小来确定重链恒定区或其部分的刚性，例如如本文进一步描述的。

包含经修饰的重链恒定区并展现出如根据本领域已知和本文所述的方法所确定的增强的功能特性的抗体应理解为涉及特定活性相对于在具有不同重链恒定区的相同抗体中所观察到的特定活性的在统计上的显著差异。

在某些实施方案中，经修饰的重链恒定区包含IgG2同种型的铰链(“IgG2铰链”)以及CH1、CH2和CH3结构域。在某些实施方案中，经修饰的重链恒定区包含IgG2铰链以及CH1、CH2和CH3结构域，其中CH1、CH2和CH3结构域中的至少一个不是IgG2同种型的。在某些实施方案中，经修饰的重链恒定区包含IgG2铰链以及CH1、CH2和CH3结构域，其中所述重链恒定结构域不是野生型IgG2恒定区或者不是具有氨基酸219或220处突变的IgG2恒定区。IgG2铰链可以是野生型IgG2铰链，例如野生型人IgG2铰链(例如，具有SEQ ID NO:8)或其变体，条件是IgG2铰链保留赋予抗体相对于包含非IgG2铰链或包含IgG1重链的相同抗体而言增强的活性的能力。在某些实施方案中，IgG2铰链变体保留与野生型IgG2铰链的刚性或硬度类似的刚性或硬度。铰链的刚性可以通过例如计算机建模、电子显微镜、光谱法(如核磁共振(NMR)、X射线晶体学(B因子))或用于测量或比较包含所述铰链的抗体的回转半径的沉降速度分析超速离心(AUC)来确定。铰链具有相对于另一铰链的刚性类似或更高的刚性，条件是包含所述铰链的抗体具有从在先前句子中描述的测试之一获得的如下值，该值与具有不同铰链(例如，IgG1铰链)的相同抗体的值相差少于5％、10％、25％、50％、75％或100％。通过解释这些测试的结果，本领域技术人员将能够从测试中确定铰链是否具有至少类似于另一铰链的刚性。

示例性的人IgG2铰链变体是这样的IgG2铰链，其包含四个半胱氨酸残基(即，C219、C220、C226和C229)中的一个或多个被另一个氨基酸的取代。半胱氨酸可以由丝氨酸替代。示例性的IgG2铰链是包含C219X突变或C220X突变的人IgG2铰链，其中X是除半胱氨酸以外的任何氨基酸。在某些实施方案中，IgG2铰链不包含C219X和C220X取代两者。在某些实施方案中，IgG2铰链包含C219S或C220S，但不同时包含C219S和C22S。可以使用的其他IgG2铰链变体包括包含C220、C226和/或C229取代(例如，C220S、C226S或C229S突变(其可以与C219S突变组合))的人IgG2铰链。IgG2铰链也可以是其中所述铰链的一部分是另一同种型的一部分的IgG2铰链(即，其是嵌合或杂合体铰链)，条件是嵌合铰链的刚性至少类似于野生型IgG2铰链的刚性。例如，IgG2铰链可以是其中下部铰链(如表2中所定义)属于IgG1同种型并且是例如野生型IgG1下部铰链的IgG2铰链。

“杂合体”或“嵌合”铰链被称为属于特定的同种型，条件是铰链的连续氨基酸的多于一半来自该同种型。例如，具有IgG2的上部和中部铰链以及IgG1的下部铰链的铰链被认为是IgG2杂合体铰链。

在某些实施方案中，抗体包含经修饰的重链恒定区，所述经修饰的重链恒定区包含含有表4中列出的序列(例如，以下氨基酸序列之一：8、21、22、23、126-129和134-147)的IgG2铰链。在某些实施方案中，铰链包含SEQ ID NO:8、21、126、134或135，其中1、2、3或所有4个氨基酸P233、V234、A235和G237(对应于C末端4个氨基酸“PVAG”(SEQ ID NO:148)被缺失或被另一个氨基酸(例如，IgG1铰链的C末端的氨基酸(ELLG(SEQ ID NO:149)或ELLGG(SEQID NO:150))取代。在某些实施方案中，铰链包含SEQ ID NO:8、21、126、134或135，其中V234、A235和G237被缺失或被另一个氨基酸取代。在某些实施方案中，铰链包含SEQ ID NO:8、21、126、134或135，其中A235和G237被缺失或被另一个氨基酸取代。在某些实施方案中，铰链包含SEQ ID NO:8、21、126、134或135，其中G237被缺失或被另一个氨基酸取代。在某些实施方案中，铰链包含SEQ ID NO:8、21、126、134或135，其中V234和A235被缺失或被另一个氨基酸取代。用IgG1铰链的相应氨基酸(即，(ELLG(SEQ ID NO:144)或ELLGG(SEQ ID NO:145))取代IgG2中的PVAG(SEQ ID NO:143)以获得具有SEQ ID NO:22或138(参见例如，表4)的杂合体铰链或其变体，从而提供具有IgG2铰链的优点和IgG1铰链的效应子功能的铰链。

在某些实施方案中，经修饰的重链恒定区包含由表4中的序列(例如，SEQ ID NO:8、21、22、23、127-132和134-141)之一组成或基本上由其组成的铰链，并且在某些实施方案中，所述经修饰的重链恒定区不包含另外的铰链氨基酸残基。

表4：示例性IgG2铰链

X是除半胱氨酸以外的任何氨基酸。

在某些实施方案中，经修饰的重链恒定区包含表4中列出的IgG2铰链，其中在氨基酸残基CVE与CPP之间插入1-5、1-3、1-2或1个氨基酸。在某些实施方案中，插入THT或GGG。在某些实施方案中，可以在铰链与CH2结构域之间插入1、1-2或1-3个氨基酸。例如，可以在铰链与CH2结构域之间插入另外的甘氨酸。

在某些实施方案中，经修饰的重链恒定区是IgG1或IgG2恒定区，其中铰链包含1-10个氨基酸的缺失。如实施例中所示，与具有野生型IgG1恒定区的相同抗体相比，缺少氨基酸残基SCDKTHT(S219、C220、D221、K222、T223、H224和T225；SEQ ID NO:151)的IgG1抗体更有效地赋予了抗体介导的CD73内化。类似地，与具有野生型IgG1恒定区的相同抗体相比，在IgG2抗体的情况下，缺少氨基酸残基CCVE(C219、C220、V222和E224；SEQ ID NO:152)的IgG2抗体更有效地赋予了抗体介导的CD73内化。因此，本文提供了经修饰的重链恒定区，其中铰链包含1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基的缺失，对于IgG1抗体，所述氨基酸残基选自残基S219、C220、D221、K222、T223、H224和T225，并且对于IgG2抗体，所述氨基酸残基选自残基C219、C220、V222和E224。

在某些实施方案中，经修饰的重链恒定区包含CH1结构域，其是IgG1或IgG2同种型的野生型CH1结构域(分别为“IgG1 CH1结构域”或“IgG2 CH1结构域”)。也可以使用同种型IgG3和IgG4的CH1结构域(分别为“IgG3 CH1结构域”和“IgG2 CH1结构域”)。CH1结构域也可以是野生型CH1结构域的变体，例如野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH1结构域的变体。CH1结构域的示例性变体包含A114C、C131S和/或T173C。CH1结构域(例如，IgG2 CH1结构域)可以包含取代C131S，所述取代为IgG2抗体或具有IgG2 CH1的抗体和铰链赋予了B形式(或构象)。

在某些实施方案中，经修饰的重链恒定区包含IgG2同种型的CH1结构域。在某些实施方案中，CH1结构域是野生型IgG2 CH1结构域，其例如具有以下氨基酸序列：

在某些实施方案中，N192和/或F193(在上文所示的SEQ ID NO:7中显示为斜体加下划线的残基)被另一个氨基酸，例如被IgG1中的相应氨基酸取代，即N192S和/或F193L。

在某些实施方案中，IgG2 CH1结构域的一个或多个氨基酸残基被IgG4中的相应氨基酸残基取代。例如，N192可以是N192S；F193可以是F193L；C131可以是C131K；和/或T214可以是T214R。

抗体可以包含经修饰的重链恒定区，所述经修饰的重链恒定区包含IgG2 CH1结构域或其变体和IgG2铰链或其变体。铰链和CH1结构域可以是本文所述的任何IgG2铰链和IgG2 CH1结构域的组合。在某些实施方案中，IgG2 CH1和铰链包含以下氨基酸序列：

在某些实施方案中，抗体至少包含IgG2铰链，并且还任选地包含IgG2CH1结构域或铰链和/或CH1结构域的片段或衍生物，并且抗体已采用形式(构象)A(参见例如，Allen等人(2009)Biochemistry 48:3755)。在某些实施方案中，抗体至少包含IgG2铰链，并且还任选地包含IgG2 CH1结构域或铰链和/或CH1结构域的片段或衍生物，并且抗体已采用形式B(参见例如，Allen等人(2009)Biochemistry 48:3755)。

在某些实施方案中，经修饰的重链恒定区包含CH2结构域，其是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的野生型CH2结构域(分别为“IgG1 CH2结构域”、“IgG2 CH2结构域”、“IgG3 CH2结构域”或“IgG4 CH2结构域”)。CH2结构域也可以是野生型CH2结构域的变体，例如野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH2结构域的变体。CH2结构域的示例性变体包括调节抗体的Fc区的生物活性(如ADCC或CDC)或调节抗体的半衰期或其稳定性的变体。在一个实施方案中，CH2结构域是具有A330S和/或P331S突变的人IgG1 CH2结构域，其中相对于没有突变的相同CH2突变，CH2结构域具有降低的效应子功能。CH2结构域可以具有增强的效应子功能。CH2结构域可以包含以下突变中的一个或多个：SE(S267E)、SELF(S267E/L328F)、SDIE(S239D/I332E)、SEFF、GASDALIE(G236A/S239D/A330L/I332E)，和/或以下氨基酸处的一个或多个突变：E233、L235、G237、P238、H268、P271、L328、A330和K322。需要注意的是，这些突变中的一些实际上是铰链的一部分，而不是如本文所定义的CH2结构域的一部分。在本文其他地方进一步阐述其他突变。

在某些实施方案中，经修饰的重链恒定区包含CH3结构域，其是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的野生型CH3结构域(分别为“IgG1 CH3结构域”、“IgG2 CH3结构域”、“IgG3 CH3结构域”或“IgG4 CH3结构域”)。CH3结构域也可以是野生型CH3结构域的变体，例如野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3结构域的变体。CH3结构域的示例性变体包括调节抗体的Fc区的生物活性(如ADCC或CDC)或调节抗体的半衰期或其稳定性的变体。

通常，CH1、铰链、CH2或CH3结构域的变体可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多的突变，和/或至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个突变，或1-10或1-5个突变，或者包含与相应的野生型结构域(分别为CH1、铰链、CH2或CH3结构域)的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，条件是包含特定变体的重链恒定区保留必需的生物活性。

表5列出了包含人CH1、铰链、CH2和/或CH3结构域的示例性人重链恒定区，其中每个结构域都是为重链恒定区提供所需生物活性的野生型结构域或其变体。表5中未填充的单元格指示结构域存在或不存在，如果存在，则可以是任何同种型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的。例如，包含表5中的重链恒定区1的抗体是包含至少含有IgG2铰链的重链恒定区并且也可以包含CH1、CH2和/或CH3结构域(并且如果存在的话，所述CH1、CH2和/或CH3结构域是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的)的抗体。作为用于理解表5的另一个例子，包含重链恒定区8的抗体是包含含有IgG1 CH1结构域和IgG2铰链、IgG1 CH2结构域的重链恒定区的抗体，并且所述重链恒定区也可以包含或可以不包含CH3结构域，其存在时可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的。

表5

*经修饰的重链恒定区

在某些实施方案中，包含表5中所示的重链恒定区的抗体相对于不包含该特定重链恒定区的包含重链恒定区的相同抗体或者相对于包含IgG1恒定区的相同抗体具有增强的生物活性。

在某些实施方案中，用于改善包含非IgG2铰链和/或非IgG2 CH1结构域的抗体的生物活性的方法包括提供包含非IgG2铰链和/或非IgG2 CH1结构域的抗体，并将非IgG2铰链和非IgG2 CH1结构域分别用IgG2铰链和IgG2 CH1结构域替代。用于改善不包含经修饰的重链恒定区的抗体的生物活性的方法可以包括提供不包含经修饰的重链恒定区的抗体，并将其重链恒定区用经修饰的重链恒定区替代。

示例性的经修饰的重链恒定区提供于表6中，其列出了每个结构域的身份。

表6

在某些实施方案中，抗体包含经修饰的重链恒定区，所述经修饰的重链恒定区包含含有SEQ ID NO:8、21、22、23、126-132、134-136和137中任何一个的IgG2铰链或其变体，如包含如下氨基酸序列的IgG2铰链，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:8、21、22、23、126-132、134-136和137中的任何一个有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的差异；(ii)与SEQ ID NO:8、21、22、23、126-132、134-136和137中的任何一个有最多5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失的差异；(iii)与SEQ ID NO:8、21、22、23、126-132、134-136和137中的任何一个有1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸取代、添加或缺失的差异和/或(iv)包含与SEQID NO:8、21、22、23、126-132、134-136或137中的任何一个至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任何一项中，氨基酸取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；并且其中经修饰的重链恒定区相对于另一个重链恒定区(例如，包含非IgG2铰链的重链恒定区)或相对于包含非IgG2铰链的相同的经修饰的重链恒定区具有增强的生物活性。

在某些实施方案中，铰链包含作为SEQ ID NO:8、21、22、23、126-132、134-136和137中任何一个的变体的序列，其中R217(野生型IgG2铰链中的第二个氨基酸(SEQ ID NO:8))未被缺失或未被另一个氨基酸取代。在其中铰链是SEQ ID NO:8、21、22、23、126-132、134-136和137中任何一个的变体的某些实施方案中，铰链具有与野生型IgG2的硬度类似的硬度。

在某些实施方案中，抗体包含经修饰的重链恒定区，所述经修饰的重链恒定区包含含有SEQ ID NO:2的IgG1 CH1结构域或含有SEQ ID NO:7的IgG2 CH1结构域或者SEQ IDNO:2或7的变体，所述变体(i)与SEQ ID NO:2或7有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的差异；(ii)与SEQ ID NO:2或7有最多5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失的差异；(iii)与SEQ ID NO:2或7有1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸取代、添加或缺失的差异和/或(iv)包含与SEQ ID NO:2或7至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任何一项中，氨基酸取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；并且其中经修饰的重链恒定区相对于另一个重链恒定区(例如，包含非IgG2铰链的重链恒定区)或相对于包含非IgG2铰链的相同的经修饰的重链恒定区具有增强的生物活性。

在某些实施方案中，抗体包含经修饰的重链恒定区，所述经修饰的重链恒定区包含含有SEQ ID NO:4或24或者SEQ ID NO:4或24的变体的IgG1 CH2结构域，所述变体(i)与SEQ ID NO:4或24有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的差异；(ii)与SEQ ID NO:4或24有最多5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失的差异；(iii)与SEQ ID NO:4或24有1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸取代、添加或缺失的差异和/或(iv)包含与SEQ ID NO:4或24至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任何一项中，氨基酸取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；并且其中经修饰的重链恒定区相对于另一个重链恒定区(例如，包含非IgG2铰链的重链恒定区)或相对于包含非IgG2铰链的相同的经修饰的重链恒定区具有增强的生物活性。

在某些实施方案中，抗体包含经修饰的重链恒定区，所述经修饰的重链恒定区包含含有SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:5的变体的IgG1 CH3结构域，所述变体(i)与SEQ ID NO:5有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的差异；(ii)与SEQ ID NO:5有最多5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失的差异；(iii)与SEQ ID NO:5有1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸取代、添加或缺失的差异和/或(iv)包含与SEQ ID NO:5至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任何一项中，氨基酸取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；并且其中经修饰的重链恒定区相对于另一个重链恒定区(例如，包含非IgG2铰链的重链恒定区)或相对于包含非IgG2铰链的相同的经修饰的重链恒定区具有增强的生物活性。

经修饰的重链恒定区也可以包含上述CH1、铰链、CH2和CH3结构域的组合。

在某些实施方案中，抗体包含本文所述的经修饰的重链恒定区或本文所述的经修饰的重链恒定区的变体，所述变体(i)与本文所述的经修饰的重链恒定区有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸取代、添加或缺失的差异；(ii)与本文所述的经修饰的重链恒定区有最多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失的差异；(iii)与本文所述的经修饰的重链恒定区有1-5、1-3、1-2、2-5、3-5、1-10或5-10个氨基酸取代、添加或缺失的差异和/或(iv)包含与本文所述的经修饰的重链恒定区至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任何一项中，氨基酸取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；并且其中经修饰的重链恒定区相对于另一个重链恒定区(例如，包含非IgG2铰链的重链恒定区)或相对于包含非IgG2铰链的相同的经修饰的重链恒定区具有增强的生物活性。

在某些实施方案中，抗体包含经修饰的重链恒定区，所述经修饰的重链恒定区包含SEQ ID NO:26-37、54-56、78-125和152-232中的任何一个或SEQ ID NO:26-37、54-56、78-125和152-232中任何一个的变体，所述变体(i)与SEQ ID NO:26-37、54-56、78-125和152-232中任何一个有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸取代、添加或缺失的差异；(ii)与SEQ ID NO:26-37、54-56、78-125和152-232中任何一个有最多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失的差异；(iii)与SEQ ID NO:26-37、54-56、78-125和152-232中任何一个有1-5、1-3、1-2、2-5、3-5、1-10或5-10个氨基酸取代、添加或缺失的差异和/或(iv)包含与SEQ ID NO:26-37、54-56、78-125和152-232中任何一个至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任何一项中，氨基酸取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；并且其中经修饰的重链恒定区相对于另一个重链恒定区(例如，包含非IgG2铰链的重链恒定区)或相对于包含非IgG2铰链的相同的经修饰的重链恒定区或相对于相同重链(但缺少修饰)具有增强的生物活性(和/或降低的效应子功能)。

经修饰的重链恒定区可以具有(i)相对于但没有所述修饰的相同重链恒定区(例如，相对于野生型重链恒定区)的类似、降低或增加的效应子功能(例如，与FcγR的结合)和/或(ii)相对于野生型重链恒定区的类似、减小或增加的半衰期(或与FcRn受体的结合)。

II.具有降低的效应子功能的经修饰的重链恒定区

本文还提供了包含重链的抗体和融合蛋白，所述重链包含降低FcgR结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸突变。

在某些实施方案中，抗体(或其抗原结合片段)或融合蛋白包含经修饰的重链恒定区，所述经修饰的重链恒定区包含SEQ ID NO:198或其含有P238K的部分或者SEQ ID NO:198或其部分中任何一个的变体，所述变体(i)与SEQ ID NO:198或其含有P238K的部分有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸取代、添加或缺失的差异；(ii)与SEQ ID NO:198或其含有P238K的部分有最多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失的差异；(iii)与SEQ ID NO:198或其含有P238K的部分有1-5、1-3、1-2、2-5、3-5、1-10或5-10个氨基酸取代、添加或缺失的差异和/或(iv)包含与SEQ ID NO:198或其含有P238K的部分至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中氨基酸取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；并且其中经修饰的重链恒定区具有降低的效应子功能，例如与低亲和力FcgR(例如，CD32a、CD32b和CD16a)的不可检测的结合和任选地与高亲和力FcgR(CD64)的不可检测的结合，如在本文所述的测定中所确定的。

在某些实施方案中，相对于野生型IgG1 Fc，包含P238K突变(例如，包含SEQ IDNO:198或其部分)的IgG(例如，IgG1或IgG2)重链恒定结构域不包含其他突变，例如本文所述的那些。在某些实施方案中，相对于野生型人IgG1 Fc，包含P238K突变(例如，包含SEQ IDNO:198或其部分)的IgG1 Fc包含1-5个氨基酸变化以及P238K，例如，包含P238K突变的所述IgG1 Fc包含SEQ ID NO:198或其部分以及相对于SEQ ID NO:198或其部分的1-5个氨基酸变化，条件是所述IgG1 Fc具有降低的效应子功能。

在某些实施方案中，包含P238K突变的IgG(例如，IgG1或IgG2)重链恒定结构域不包含降低效应子功能的任何其他突变。在某些实施方案中，包含P238K突变的IgG(例如，IgG1或IgG2)包含1-5个降低效应子功能的突变。

在某些实施方案中，包含P238K突变的IgG(例如，IgG1或IgG2)恒定结构域还包含L235E突变和/或K322A突变，并且在某些实施方案中可以不含有调节Fc效应子功能的任何另外的重链恒定结构域突变，例如，包含P238K突变的所述IgG恒定结构域不包含P330、P331处的突变或在下部铰链中(例如，氨基酸234和236-237处)的突变。IgG可以是IgG1或IgG2或其嵌合或杂合体Ig。

在某些实施方案中，抗体包含含有IgG2或IgG1恒定结构域或至少其铰链的重链恒定区，其中IgG2或IgG1恒定结构域或其部分包含选自P238A、P238K、L235A、L235E、K322A的突变和任选的C219和/或C220处的突变，例如C219S和/或C220S。

在某些实施方案中，抗体包含重链恒定区，所述重链恒定区包含含有L234A、L235E和G237A中的一个或多个的IgG1恒定结构域。如本文所用，“IgG1.3”是指包含L234A、L235E和G237A(参见例如，SEQ ID NO:248)的IgG1重链。包含这三个突变的IgG1恒定区也可以包含另外的突变，如本文所述的那些。本文在序列表中提供了包含L234A、L235E和G237A突变和另外的突变的示例性序列。IgG1.3 Fc提供了效应子功能(如ADCC和CDC)显著降低的抗体。在某些实施方案中，Fc包含IgG1.3的突变和另外的突变，例如P238K。

在某些实施方案中，抗体包含IgG1.3重链恒定区，所述恒定区除了L234A、L235E和G237A以外，不包含调节效应子功能的任何其他突变。在某些实施方案中，抗体包含IgG1.3重链恒定区，所述恒定区除了L234A、L235E和G237A以外，不包含任何其他突变。

在某些实施方案中，经修饰的重链恒定区是包含在氨基酸残基L234、L235、P238、G237和K322中的一个或多个处的取代的IgG1或IgG2或其IgG1/IgG2杂合体，使得(i)与低亲和力FcgR的结合降低或不可检测或不明显；(ii)与高亲和力FcgR的结合降低或不可检测或不明显；(iii)与C1Q的结合降低或不可检测或不明显；(iv)ADCC降低或不可检测或不明显；(v)ADCP降低或不可检测或不明显；和/或(vi)CDC降低或不可检测或不明显。如实施例中所述，IgG1重链恒定区中的P238K突变在不存在任何另外的降低效应子功能的突变的情况下降低与所有低亲和力FcgR的结合，并且降低与高亲和力FcgR(CD64)的结合，相对于野生型IgG1降低约100倍。另外，在重链恒定区交联时未检测到结合。将突变L235E添加到IgG1重链恒定区中的P238K再将CD64结合降低1000倍。对包含P238K和L235E的IgG1重链恒定区的其他突变L234A和G237A进一步降低了CD64结合。突变K322A对FcgR结合没有影响，但降低了C1q结合，因此降低了CDC。具有P238K突变的IgG2重链恒定区具有降低的与所有FcgR的结合。

因此，本文提供了经修饰的重链恒定区，所述经修饰的重链恒定区包含(i)在P238处的取代，例如P238K、P238R或P238H；(ii)在L234处的取代，例如L234A、L234V、L234L、L234I、L234P、L234F或L234M；(iii)在L235处的取代，例如L235E、L235D或L235A；(iv)在G237处的缺失或取代，例如G237A、G237V、G237L、G237I、G237P、G237F或G237M；和/或(v)在K322处的取代，例如K322A、K322V、K322L、K322I、K322P、K322F或K322M。经修饰的重链恒定区可以包含P238K、L234A、L235E、G237A和K322A中的一个或多个。例如，重链恒定区可以包含(i)P238K并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(ii)P238K和L235E并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(iii)P238K、L235E和K322A并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(iv)P238K和L234A并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(v)P238K和G237A并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(vi)P238K、L234A和G237A并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(vii)P238K、L235E和L234A并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(viii)P238K、L235E和G237A并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(ix)P238K、L235E、L234A和G237A并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(x)P238K、K322A和L234A并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(xi)P238K、K322A和G237A并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(xii)P238K、K322A、L234A和G237A并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(xiii)P238K、L2325E、K322A和L234A并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(xiv)P238K、L235E、K322A和G237A并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；和/或(xv)P238K、L235E、K322A、L234A和G237A并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变。

考虑到P238K、L235E、K322A、L234A和G237A中的每一个都可以被具有类似特征的氨基酸取代，重链恒定结构域可以包含：(i)在P238处的取代并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(ii)在P238和L235处的取代并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(iii)在P238、L235和K322处的取代并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(iv)在P238和L234处的取代并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(v)在P238和G237处的取代并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(vi)在P238、L234和G237处的取代并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(vii)在P238、L235和L234处的取代并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(viii)在P238、L235和G237处的取代并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(ix)在P238、L235、L234和G237处的取代并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(x)在P238、K322和L234处的取代并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(xi)在P238、K322和G237处的取代并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(xii)在P238、K322、L234和G237处的取代并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(xiii)在P238、L2325、K322和L234处的取代并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(xiv)在P238、L235、K322和G237处的取代并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；(xv)在P238、L235、K322、L234和G237处的取代并且任选地没有降低效应子功能的其他氨基酸突变；其中在P238处的取代可以是P238K、P238R或P238H；在L234处的取代可以是L234A、L234V、L234L、L234I、L234P、L234F或L234M；在L235处的取代可以是L235E、L235D或L235A；在G237处的取代可以是G237A、G237V、G237L、G237I、G237P、G237F或G237M；并且在K322处的取代可以是K322A、K322V、K322L、K322I、K322P、K322F或K322M。

包含P238K、L235E、K322A、L234A和G237A中的一个或多个的重链恒定区是IgG重链恒定结构域的重链恒定区，如来自IgG1、IgG2或其杂合体，如实施例中所提供的。

下面是提供了包含P238K、L235E、K322A、L234A和G237A中的一个或多个的优选的经修饰的重链恒定区的序列(在序列表中提供)的SEQ ID NO的表格，其中“1.3”指示L234A、L235E和G237A的存在。

在某些实施方案中，经修饰的重链恒定区包含选自含有上表中的P238K、L235E、K322A、L234A和G237A中的一个或多个的重链恒定区序列的序列，例如SEQ ID NO:198、234-239、241、243、244、245、247-254、256和258-262中的任何一个或其变体，所述变体(i)与SEQID NO:198、234-239、241、243、244、245、247-254、256和258-262中任何一个有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸取代、添加或缺失的差异；(ii)与SEQ ID NO:198、234-239、241、243、244、245、247-254、256和258-262中任何一个有最多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失的差异；(iii)与SEQ ID NO:198、234-239、241、243、244、245、247-254、256和258-262中任何一个有1-5、1-3、1-2、2-5、3-5、1-10或5-10个氨基酸取代、添加或缺失的差异和/或(iv)包含与SEQ ID NO:198、234-239、241、243、244、245、247-254、256和258-262中任何一个至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任何一项中，氨基酸取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；并且其中所述经修饰的重链恒定区相对于相同的重链恒定区(但缺少所述突变)具有降低的FcgR结合和/或效应子功能。

包含在本节中描述的经修饰的重链恒定区的抗体或融合蛋白优选是稳定的，例如具有至少60℃、62℃、65℃、67℃或更高的Tm1，如例如如实施例中所述测量的。在某些实施方案中，包含在本节中描述的经修饰的重链恒定区的抗体或融合蛋白相对于没有所述一个或多个突变的相应重链恒定区具有降低的与低亲和力FcgR、高亲和力FcgR、C1q的结合和/或降低的ADCC、ADCP或CDC。在某些实施方案中，即使在存在交联的情况下，包含在本节中描述的经修饰的重链恒定区的抗体或融合蛋白相对于没有所述一个或多个突变的相应重链恒定区也具有降低的与低亲和力FcgR、高亲和力FcgR、C1q的结合和/或降低的ADCC、ADCP或CDC。

经修饰的重链恒定区可以包含P238K和在L234处的取代，如L234A、L234V、L234L、L234I、L234P、L234F或L234M。经修饰的重链恒定区可以包含P238K和在L235处的取代，例如L235E、L235D或L235A。经修饰的重链恒定区可以包含P238K和在K322处的取代，例如K322A、K322V、K322L、K322I、K322P、K322F或K322M。经修饰的重链恒定区可以包含P238K和在G237处的取代，例如G237A、G237V、G237L、G237I、G237P、G237F或G237M。经修饰的重链恒定区可以包含P238K、L235E和在K322处的取代，例如K322A、K322V、K322L、K322I、K322P、K322F或K322M。

重链恒定区提供于序列表中。在某些实施方案中，抗体包含表中列出的重链恒定区之一，其中恒定区除了表中列出的序列中的突变以外，不包含任何突变。在某些实施方案中，抗体包含表中列出的重链恒定区之一，其中恒定区(i)与序列表中的序列有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的差异；(ii)与序列表中的序列有最多5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失的差异；(iii)与序列表中的序列有1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸取代、添加或缺失的差异和/或(iv)包含与序列表中的序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸，其中在(i)-(iv)中任何一项中，氨基酸取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；并且其中恒定区的生物活性未被这些突变显著改变。

重链恒定区可以包含突变的组合，所述突变为包含重链区的抗体赋予了通过每个单独突变所赋予的生物活性的组合。例如，可以将增强大细胞表面复合物形成的激动剂活性或增强抗体内化的一个或多个突变与调节效应子功能的一个或多个突变组合。包含赋予不同生物学功能的突变的组合的示例性恒定链序列在序列表中列出。

III.具有增强内化和激动剂活性的经修饰的重链恒定区的抗体及其靶抗原

经修饰的重链恒定区可以用于多种抗体和融合蛋白，如需要内化(例如，抗体药物缀合物(ADC)和抗CD73抗体)、激动剂活性(例如，有效调节免疫应答例如刺激T细胞激活的抗体，如激动剂抗GITR抗体)、拮抗剂活性(例如，抑制或阻断可抑制免疫应答例如T细胞激活的蛋白质的抗体，如拮抗剂PD-1抗体)、效应子功能(例如，ADCC和CDC)或降低的效应子功能、信号转导或抗肿瘤活性的抗体。例如，细胞表面抑制性受体的内化可以限制其与其一个或多个受体相互作用并降低一种或多种细胞功能的能力。

在一个实施方案中，包含经修饰的重链恒定结构域的抗体是需要通过例如当它们与细胞表面结合时诱导受体介导的内吞作用进行内化以实现其活性的抗体(例如，对细胞表面受体具有特异性的抗体)。此类抗体可以用作针对药物、毒素、酶或DNA的靶向递送的媒介物，以用于治疗应用。因此，期望增加这些抗体的内化特性。可以受益于有效内化的示例性抗体是抗体药物缀合物。用于测量抗体的内化特性的各种测定是本领域已知的并且在本文中进行了描述。这些测定利用例如多种染料进行抗体标记，所述染料可以用于基于洗涤或淬灭的测定中以监测内化。也可以在依赖荧光标记的免洗测定中监测抗体内化。

在一个实施方案中，包含经修饰的重链恒定结构域的抗体是需要其所结合的抗原(例如，细胞表面分子，如受体或配体)内化以实现活性的抗体。因此，针对需要被下调以用于生物学(例如，治疗)活性的细胞表面蛋白的抗体可以使用本文所述的经修饰的重链恒定区。

在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定结构域的抗体与细胞表面分子结合并激动或拮抗细胞表面分子的生物活性，所述细胞表面分子例如为免疫细胞(例如，T细胞、Teff细胞、Th1细胞、Th2细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg细胞、树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、朗格汉斯细胞、NK细胞、髓源性抑制细胞、B细胞或任何其他免疫细胞)上的细胞表面分子。细胞表面分子可以是刺激分子，例如共刺激分子(例如，GITR、OX40、CD137、CD40、ICOS和其他TNFR家族成员)，并且抗体可以进一步刺激活性(激动剂抗体)或抗体可以抑制活性(拮抗剂抗体)。细胞表面分子可以是抑制性分子(例如，CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3)，并且抗体可以进一步刺激活性(激动剂抗体)或抗体可以抑制活性(拮抗剂抗体)。

在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定结构域的抗体是刺激(或共刺激)分子的激动剂抗体(例如，抗GITR抗体)，所述激动剂抗体例如通过诱导从T细胞分泌IL-2和/或IFN-γ来增强受试者的免疫系统。已显示其他激动剂抗体可激活APC、促进抗肿瘤T细胞应答和/或培育在不存在T细胞免疫的情况下具有控制癌症的潜力的细胞毒性骨髓细胞。刺激分子的激动剂抗体不同于抑制性分子的拮抗剂抗体(如抗CTLA-4或抗PD-1)，所述拮抗剂抗体阻断负性免疫检查点。可以使用本领域已知的多种方法来测量激动剂活性，如T细胞增殖。

在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定结构域的抗体是检查点抑制剂的拮抗剂抗体(如抗CTLA-4或抗PD-1抗体)，所述拮抗剂抗体例如通过靶向激活的T细胞上表达的抑制性受体来阻断或抑制负性免疫检查点从而增强受试者的免疫应答。可以使用本领域已知的多种方法来测量拮抗剂活性，如T细胞增殖的抑制。

在一个实施方案中，抗体是例如T细胞上的(i)共刺激受体的激动剂或(ii)抑制信号的拮抗剂，两者均可导致放大免疫应答，例如抗原特异性T细胞应答(免疫检查点调节剂)。在某些实施方案中，抗体是例如T细胞上的(i)共刺激受体的拮抗剂或(ii)抑制信号的激动剂。共刺激和共抑制分子可以是免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员，并且具有经修饰的重链恒定区的抗体可以与它们中的任何一个结合。与共刺激或共抑制受体结合的膜结合配体的一个重要家族是B7家族，其包括B7-1、B7-2、B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)和B7-H6，并且具有经修饰的重链恒定区的抗体可以与它们中的任何一个结合。与共刺激或共抑制受体结合的膜结合配体的另一个家族是与同源TNF受体(TNFR)家族成员结合的TNF家族分子，其包括CD40和CD40L、OX-40、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TL1A、TRAMP/DR3、EDAR、EDA1、XEDAR、EDA2、TNFR1、淋巴毒素α/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTα、LTβ、LTβR、淋巴毒素α1β2、FAS、FASL(CD178)、DR3(TNFRSF25)、RELT、DR6、TROY、NGFR(参见例如，Tansey(2009)Drug Discovery Today 00:1)。因此，本文所述的抗体可以与这些表面分子中的任何一种结合，并且它们可以是例如(i)IgSF家族或B7家族或TNFR家族中抑制T细胞激活的蛋白质的激动剂或拮抗剂(或抑制剂或阻断剂)或者抑制T细胞激活的细胞因子(例如，IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF；“免疫抑制细胞因子”)的拮抗剂和/或(ii)IgSF家族、B7家族或TNF家族的刺激性受体的或者刺激T细胞激活的细胞因子的激动剂或拮抗剂，用于调节例如刺激免疫应答，例如从而治疗增殖性疾病(如癌症)。

因此，具有经修饰的重链恒定结构域的抗体可以用作以下药剂中的一种：

(1)刺激例如T细胞激活的蛋白质如B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、GITR、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、CD70、CD27、CD40、DR3或CD28H的激动剂；或

(2)如上所述抑制T细胞激活的蛋白质(如CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2和LAG-3)的拮抗剂(例如，免疫检查点抑制剂)以及以下蛋白质中任何一种的拮抗剂(抑制剂或阻断剂)：TIM-3、半乳糖凝集素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳糖凝集素-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、2B4、CD48、GARP、CD73、PD1H、LAIR1、TIM-1、TIM-4、CD39。

其他抗体包括NK细胞上抑制性受体(例如，KIR、TIGIT、NKG2A)的拮抗剂和NK细胞上激活性受体的激动剂。

通常，可受益于经修饰的重链恒定区的抗体包括，例如连接正性共刺激受体的激动剂抗体、通过抑制性受体减弱信号传导的阻断抗体、拮抗剂抗体、和全身性地增加抗肿瘤T细胞频率的抗体、克服肿瘤微环境内不同免疫抑制途径(例如，阻断抑制性受体参与(例如，PD-L1/PD-1相互作用)、耗竭或抑制Treg(例如，抗CD25单克隆抗体)、抑制代谢酶(如IDO)或逆转/预防T细胞无能或衰竭)的抗体以及触发肿瘤位点处的先天免疫激活和/或炎症的抗体。抑制性受体的增加的内化可以转化为较低水平的潜在抑制剂。

在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定区的抗体是与治疗剂缀合以形成免疫缀合物(如抗体药物缀合物(ADC))的抗体，所述免疫缀合物需要内化以实现其活性。在ADC中，所述抗体用作靶向剂以将ADC引导至表达其抗原(如癌细胞上的抗原)的靶细胞。在这种情况下，所述抗原可以是肿瘤相关抗原，即由癌细胞独特表达或过表达的抗原。一旦到达靶细胞，所述药物就会在靶细胞内部或其附近释放以充当治疗剂。有关ADC在癌症疗法中的作用机制和用途的综述，参见Schrama等人,Nature Rev.Drug Disc.2006,5,147。

对于癌症治疗，ADC的治疗剂或药物优选是引起靶向癌细胞死亡的细胞毒性药物。可用于ADC的细胞毒性药物包括以下类型的化合物及其类似物和衍生物：

(a)烯二炔类，如加里刹霉素(calicheamicin)(参见例如，Lee等人,J.Am.Chem.Soc.1987,109,3464和3466)和尤西拉霉素(uncialamycin)(参见例如，Davies等人,WO 2007/038868 A2(2007)和Chowdari等人,US 8,709,431 B2(2012))；

(b)微管溶素(tubulysin)(参见例如，Domling等人,US 7,778,814 B2(2010)；Cheng等人,US 8,394,922 B2(2013)；和Cong等人,US 2014/0227295 A1)；

(c)CC-1065和杜卡霉素(duocarmycin)(例如参见，Boger,US 6,5458,530 B1(2003)；Sufi等人,US 8,461,117 B2(2013)；和Zhang等人,US 2012/0301490 A1(2012))；

(d)埃博霉素(参见例如，Vite等人,US 2007/0275904 A1(2007)和US RE42930 E(2011))；

(e)奥瑞他汀(auristatin)(参见例如，Senter等人,US 6,844,869 B2(2005)和Doronina等人,US 7,498,298 B2(2009))；

(f)吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)二聚体(参见例如，Howard等人,US 2013/0059800A1(2013)；US 2013/0028919 A1(2013)；和WO 2013/041606 A1(2013))；和

(g)美登木素生物碱，如DM1和DM4(参见例如，Chari等人,US 5,208,020(1993)和Amphlett等人,US 7,374,762 B2(2008))。

在ADC中，抗体和治疗剂可以经由接头，例如可切割的接头(如肽基、二硫键或腙接头)进行缀合。例如，接头可以是肽基接头，如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser或Glu。可以如以下文献中所述制备ADC：美国专利号7,087,600、6,989,452和7,129,261，PCT公开案WO 02/096910、WO 07/038658、WO 07/051081、WO 07/059404、WO 08/083312和WO 08/103693，美国专利公开案20060024317、20060004081和20060247295，将其公开内容通过引用并入本文。

可以用经修饰的重链恒定区增强的ADC的示例性靶标包括B7H4(Korman等人,US2009/0074660 A1)；CD19(Rao-Naik等人,8,097,703 B2)；CD22(King等人,US 2010/0143368 A1)；CD30(Keler等人,US 7,387,776 B2(2008)；CD70(Terrett等人,US 8,124,738 B2)；CTLA-4(Korman等人,US 6,984,720 B1(2006))；PD-1(Korman等人,US 8,008,449B2(2011)；PSMA(Huang等人,US 2009/0297438 A1和Cardarelli等人,US 7,875,278 B2)；PTK7(Terrett等人,US 2010/0034826 A1)；磷脂酰肌醇聚糖-3(Terrett等人,US 2010/0209432(A1))；RG1(Harkins等人,US 7,335,748 B2(2008))；间皮素(Terrett等人,US 8,268,970 B2(2012))；和CD44(Xu等人,US 2010/0092484 A1)。

经修饰的重链恒定结构域也可以是用于肿瘤学以外的用途，例如免疫学疾病(如类风湿性关节炎、狼疮等)的抗体的一部分。

经修饰的重链恒定结构域也可以与非抗体分子(或其抗体变体)或其片段融合，并且可以与需要Fc存在的任何多肽融合。经修饰的重链恒定结构域可以与抗体的抗原结合片段融合，如本文(例如，在定义部分中)进一步定义的。

IV.具有效应子功能降低的经修饰的重链恒定区的抗体及其靶抗原

具有与至少一些FcgR的结合降低和/或效应子功能降低的重链恒定区的抗体或融合蛋白可以与任何种类的靶抗原结合，用于不需要效应子活性的应用。例如，它们可以用于作为拮抗剂和/或阻断细胞表面分子活性的抗体中。这些可以用于治疗癌症，以及治疗免疫和其他疾病。包含在氨基酸残基L234、L235、P238、G237和K322中的一个或多个处含有取代的重链恒定结构域或其部分的抗体的靶抗原包括所有本文其他地方(如在第III节中)所述的那些。

在某些实施方案中，将没有某些效应子功能的重链恒定结构域或其部分与多肽(例如，抗体的抗原结合片段的重链部分)融合，所述重链恒定结构域或其部分包含在氨基酸残基L234、L235、P238、G237和K322中的一个或多个处的取代(如P238K突变)和任选的在L234、L235、G237和K322处的突变。如本文进一步描述的，可以将包含P238K突变并包含例如SEQ ID NO:198所示的氨基酸序列的IgG(例如，IgG1)Fc与抗体的重链可变结构域融合，其中抗体与任何靶标，例如本文所述的靶蛋白(例如，CD40或CD40L)结合。具有P238K突变的IgG1 Fc(例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO:198的P238K IgG1 fa或在具有同种异型f的IgG1的情况下)可以用于任何抗体或其任何抗原结合片段，所述任何抗体或其任何抗原结合片段不需要效应子功能，特别是与FcγR CD32a、CD32b和CD16a的结合。除了P238K以外，重链恒定区还可以包含降低与FcγR CD64结合的另外1或2个突变(例如，取代)，或者P238K可以用于IgG2铰链(例如，包含C219S的IgG2铰链)的情况下，如本文进一步描述的。

V.修饰抗体的生物活性的方法

本文提供了用于增强某些抗体的生物活性，如以下生物活性中的一种或多种的方法：

(a)增加或改变的细胞内化；

(b)增加或改变的激动剂活性；

(c)增加或改变的拮抗剂活性或阻断活性；

(d)增强或降低的ADCC；

(d)产生新的特性；

(e)增加或改变的信号转导；

(f)形成较大的抗体/抗原交联复合物；

(g)靶细胞表面分子的增加的聚集或寡聚化；

(h)免疫应答的增加的刺激或增强；和/或

(i)对免疫应答的增加的抑制。

用于增强抗体的生物活性的方法可以包括将重链恒定区或其部分(例如铰链和/或CH1结构域)用经修饰的重链恒定区或其部分(例如IgG2铰链和/或IgG2 CH1结构域)替代。

在某些实施方案中，用于改善或修饰抗体的生物活性的方法包括：(i)提供不包含如本文所述的经修饰的重链恒定区的抗体；以及(ii)将抗体的重链恒定区用增强或修饰抗体的生物活性的经修饰的重链恒定区或其部分替代。在某些实施方案中，用于改善抗体的生物活性的方法包括：(i)提供包含非IgG2铰链(例如，IgG1铰链、IgG3铰链或IgG4铰链)的抗体；以及(ii)将抗体的非IgG2铰链用IgG2铰链替代。在某些实施方案中，用于改善抗体的生物活性的方法包括：(i)提供包含非增强型IgG2铰链的抗体；以及(ii)将抗体的非增强型IgG2铰链用IgG2铰链替代。“非增强型IgG2铰链”是这样的变体IgG2铰链，它与IgG2铰链的区别在于它不再具有增强抗体生物活性所需的特征，所述变体IgG2铰链是例如不再具有野生型IgG2铰链的硬度的变体铰链。

用于增强抗体的生物活性的示例性方法包括(i)提供包含非IgG2铰链或非增强型IgG2铰链的抗体；以及(ii)将所述铰链用包含SEQ ID NO:8、21、22、23、126-132、134-136或137的铰链或其变体(例如，本文所述的变体)替代。用于增强抗体的生物活性的方法还可以包括(i)提供包含作为非经修饰的重链恒定区的重链恒定区的抗体；以及(ii)将所述重链恒定区用经修饰的重链恒定区替代。替代重链恒定区可以包括替代CH1、铰链、CH2和/或CH3结构域。例如，可以通过将所述铰链用IgG2铰链或其变体替代和/或通过将CH1结构域用IgG1或IgG2 CH1结构域或其变体替代来修饰重链恒定区。在某些实施方案中，将所述铰链用IgG2铰链替代，并且将CH2结构域用IgG1 CH2结构域替代。在某些实施方案中，将所述铰链用IgG2铰链替代，并且将CH3结构域用IgG1 CH3结构域替代。在某些实施方案中，将所述铰链用IgG2铰链替代，将CH1用IgG2铰链替代，将CH2结构域用IgG1 CH2结构域替代，并且将CH3结构域用IgG1 CH3结构域替代。在某些实施方案中，将重链恒定区用上表5中列出的经修饰的重链区1-27或表6中列出或本文所述的重链恒定区替代。

本文还提供了用于增强IgG1或IgG2抗体的生物活性的方法，所述方法包括分别在IgG1或IgG2抗体的铰链中缺失1-10个氨基酸。例如，氨基酸S219、C22、D221、K222、T223、H224和T225中的一个或多个可以被缺失。在一个实施方案中，氨基酸S219、C22、D221、K222、T223、H224和T225全部都被缺失。

与上文针对增强内化或激动剂活性的经修饰的重链恒定区描述的方法类似的方法可以用于具有降低的效应子功能的那些经修饰的重链恒定区。例如，本文提供了例如通过使P238突变为例如P238K来制备和提供无效应子抗体或其抗原结合片段以消除或降低抗体的效应子功能的方法。

在某些实施方案中，替代抗体的重链恒定区例如以修饰其生物活性并不伴随其与靶抗原的结合活性的降低或显著降低。如实施例中所述，取代抗GITR和抗CD73抗体的重链恒定区没有显著改变它们分别对于人GITR和人CD73抗原的亲和力。

应理解的是，当提及用不同同种型的相同结构域或用包含突变(例如，P238突变)的结构域替代特定同种型的结构域时，不必真正替代所述结构域，而可能只需要改变两个同种型之间不同的氨基酸。

用于评价抗体针对不同种类的抗原的结合能力的标准测定是本领域已知的，并且在本文中进行了进一步的描述，所述标准测定包括例如ELISA、Western印迹和RIA。在实施例中详细描述了合适的测定。抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定(如通过

可以如本文所述进行修饰的示例性抗体包括例如用于治疗癌症的抗体，如：Yervoy

可以如本文所述进行修饰的其他抗体包括PD-1和PD-L1拮抗剂抗体。可以如本文所述进行修饰的示例性抗PD-1抗体是纳武单抗(BMS-936558)；包含WO 2006/121168中描述的抗体17D8、2D3、4H1、5C4、7D3、5F4和4A11中的一种的CDR或可变区的抗体；WO 2012/145493中描述的MK-3475(拉姆单抗(Lambrolizumab))；WO 2012/145493中描述的AMP-514；CT-011(匹迪单抗(Pidilizumab)；先前称为CT-AcTibody或BAT；参见例如Rosenblatt等人(2011)J.Immunotherapy 34:409)；WO 2009/014708、WO 03/099196、WO 2009/114335、WO2011/066389、WO 2011/161699、WO 2012/145493、WO2013/173223、美国专利号7,635,757和8,217,149以及美国专利公开号2009/0317368中描述的那些。

可以进行修饰的其他抗体包括抗PD-L1抗体，例如BMS-936559(在WO 2007/005874和美国专利号7,943,743中被称为12A4)；包含在PCT公开案WO 07/005874和美国专利号7,943,743中描述的3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4的CDR或可变区的抗体；MEDI4736(也称为抗B7-H1)；MPDL3280A(也称为RG7446)；在WO 2013/173223、WO2011/066389、WO 2012/145493、美国专利号7,635,757和8,217,149以及美国公开号2009/145493中披露的任何抗PD-L1抗体。

可以进行修饰的其他抗体包括抗CTLA-4抗体，例如Yervoy

可以进行修饰的其他抗体包括抗LAG-3抗体，例如BMS-986016；描述于US 2011/007023中的IMP731；以及IMP-321。

可以进行修饰的其他抗体包括描述于WO 2006/105021中的抗GITR激动剂抗体，例如抗GITR抗体6C8或其人源化形式；描述于WO 2011/028683中的抗体；和描述于JP2008278814中的抗体。

也可以修饰靶向其他抗原的抗体，包括本文其他地方所述的那些。例如，可以如本文所述修饰需要内化的抗Her2抗体，例如曲妥珠单抗(赫赛汀)。

VI.另外的重链恒定结构域修饰

除了本文所述的针对抗体的修饰以增强其生物活性或降低效应子功能以外，还可以例如对CH1、铰链、CH2或CH3结构域进行其他突变，例如以进一步降低抗体的效应子功能、与FcγR的结合和/或稳定性。例如，本文(例如，下文)所述的任何修饰都可以与在氨基酸残基L234、L235、P238、G237和K322中的一个或多个处的取代(例如，P238K突变)(如在IgG1或IgG1-IgG2杂合体Fc或其部分中)组合。

Fc和经修饰的Fc

本文所述的抗体可以包含含有一个或多个修饰的Fc，通常用于改变抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或

抗原依赖性细胞毒性。例如，可以在Fc区中进行修饰以产生如下Fc变体，相对于亲本Fc，所述Fc变体具有：(a)增加或降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，(b)增加或降低的补体介导的细胞毒性(CDC)，(c)增加或降低的对于C1q的亲和力和/或(d)增加或降低的对于Fc受体的亲和力。此类Fc区变体通常将在Fc区中包含至少一个氨基酸修饰。据信将氨基酸修饰进行组合是可取的。例如，变体Fc区可以在其中，例如在本文鉴定的特定Fc区位置包含两个、三个、四个、五个等取代。示例性的Fc序列变体公开在本文中，并且也提供于美国专利号5,624,821；6,277,375；6,737,056；6,194,551；7,317,091；8,101,720；PCT专利公开案WO 00/42072；WO 01/58957；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752；WO 04/074455；WO 04/099249；WO 04/063351；WO 05/070963；WO 05/040217、WO 05/092925和WO06/020114中。

降低效应子功能

通过修饰Fc区可以降低ADCC活性。在某些实施方案中，可以(例如，通过突变)去除影响与Fc受体结合的位点，所述位点优选为挽救受体结合位点以外的位点。在其他实施方案中，可以对Fc区进行修饰以去除ADCC位点。ADCC位点是本领域已知的；关于IgG1中的ADCC位点，参见例如Sarmay等人(1992)Molec.Immunol.29(5):633-9。在一个实施方案中，人IgG1的G236R和L328R变体有效地消除了FcγR结合。Horton等人(2011)J.Immunol.186:4223和Chu等人(2008)Mol.Immunol.45:3926。在其他实施方案中，具有降低的与FcγR的结合的Fc包含氨基酸取代L234A、L235E和G237A。Gross等人(2001)Immunity 15:289。

也可以通过修饰Fc区来降低CDC活性。IgG1位置D270、K322、P329和P331处的突变，特别是丙氨酸突变D270A、K322A、P329A和P331A显著地降低了相应抗体结合C1q和激活补体的能力。Idusogie等人(2000)J.Immunol.164:4178；WO 99/51642。已显示IgG1的位置331的修饰(例如P331S)可降低补体结合。Tao等人(1993)J.Exp.Med.178:661以及Canfield和Morrison(1991)J.Exp.Med.173:1483。在另一个例子中，氨基酸位置231至239内的一个或多个氨基酸残基被改变，从而降低了抗体固定补体的能力。WO 94/29351。

在一些实施方案，具有降低的补体固定的Fc具有氨基酸取代A330S和P331S。Gross等人(2001)Immunity 15:289。

为了用于完全避免效应子功能的用途，例如当单独的抗原结合足以产生所需的治疗益处，并且效应子功能仅导致不需要的副作用(或增加不需要的副作用的风险)时，可以使用IgG4抗体，或者可以设计缺少Fc区或其实质部分的抗体或片段，或者可以使Fc突变以完全消除糖基化(例如，N297A)。可替代地，已经产生了人IgG2(C

在其他实施方案中，通过用不同的氨基酸残基替代至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以降低抗体的所有一种或多种效应子功能。例如，可以将选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一种或多种氨基酸用不同的氨基酸残基替代，使得抗体对于效应子配体的亲和力降低但保留亲本抗体的抗原结合能力。改变其亲和力的效应子配体可以是例如Fc受体(残基234、235、236、237、297)或补体的C1成分(残基297、318、320、322)。美国专利号5,624,821和5,648,260，两者均属于Winter等人。

WO 88/007089提出在IgG Fc区中进行修饰，以减少与FcγRI的结合从而降低ADCC(234A；235E；236A；G237A)，或阻断与补体成分C1q的结合从而消除CDC(E318A或V/K320A和K322A/Q)。还参见Duncan和Winter(1988)Nature 332:563；Chappel等人(1991)Proc.Nat’lAcad.Sci.(USA)88:9036；和Sondermann等人(2000)Nature 406:267(讨论这些突变对FcγRIII结合的影响)。

降低效应子功能的Fc修饰还包括位置234、235、236、237、267、269、325和328处的取代、插入和缺失，如234G、235G、236R、237K、267R、269R、325L和328R。Fc变体可以包含236R/328R。用于降低FcyR和补体相互作用的其他修饰包括取代297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P和234V。这些和其他修饰在Strohl(2009)Current Opinion in Biotechnology 20:685-691中进行了综述。通过使位置233-236和327-331中的一个或多个位置处的IgG残基突变(如IgG1中的E233P、L234V、L235A，任选G236Δ、A327G、A330S和P331S；IgG4中的E233P、F234V、L235A，任选G236Δ；和IgG2中的A330S和P331S)可以降低效应子功能(ADCC和补体激活两者)，同时保持新生的FcR结合(保持半衰期)。参见Armourdrdr等人(1999)Eur.J.Immunol.29:2613；WO 99/58572。降低效应子功能的其他突变包括IgG1中的L234A和L235A(Alegre等人(1994)Transplantation 57:1537)；IgG2中的V234A和G237A(Cole等人(1997)J.Immunol.159:3613；还参见美国专利号5,834,597)；以及IgG4的S228P和L235E(Reddy等人(2000)J.Immunol.164:1925)。人IgG1中用于降低效应子功能的突变的另一种组合包括L234F、L235E和P331S。Oganesyan等人(2008)Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.64:700。一般参见Labrijn等人(2008)Curr.Op.Immunol.20:479。在Fc(IgG1)融合蛋白(阿巴西普)的情况下被发现可降低效应子功能的另外的突变是C226S、C229S和P238S(EU残基编号)。Davis等人(2007)J.Immunol.34:2204。

具有降低的ADCC和/或CDC的其他Fc变体披露于Glaesner等人(2010)DiabetesMetab.Res.Rev.26:287(IgG4中的用于降低ADCC和ADCP的F234A和L235A)；Hutchins等人(1995)Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)92:11980(IgG4中的F234A、G237A和E318A)；An等人(2009)MAbs 1:572和美国专利申请公开案2007/0148167(IgG2中的H268Q、V309L、A330S和P331S)；McEarchern等人(2007)Blood 109:1185(IgG1中的C226S、C229S、E233P、L234V、L235A)；Vafa等人(2014)Methods 65:114(IgG2中的V234V、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、P331S)中。

在某些实施方案中，选择基本上无效应子功能的Fc，即其具有降低的与FcγR的结合和降低的补体固定。无效应子的示例性Fc(例如，IgG1 Fc)包含以下五个突变：L234A、L235E、G237A、A330S和P331S。Gross等人(2001)Immunity 15:289。这五个取代也可以与N297A组合以消除糖基化。

增强效应子功能

可替代地，可以通过修饰Fc区来增加ADCC活性。关于ADCC活性，人IgG1≧IgG3＞＞IgG4≧IgG2，因此在需要ADCC的药物中可以选择使用IgG1恒定结构域而不是IgG2或IgG4。可替代地，可以通过修饰以下位置处的一个或多个氨基酸来修饰Fc区以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或增加对Fcγ受体的亲和力：234、235、236、238、239、240、241、243、244、245、247、248、249、252、254、255、256、258、262、263、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、299、301、303、305、307、309、312、313、315、320、322、324、325、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、433、434、435、436、437、438或439。参见WO 2012/142515；还参见WO 00/42072。示例性取代包括236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D和332E。示例性变体包括239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T和267E/268F/324T。例如，已显示包含G236A变体(其可以任选地与I332E组合)的人IgG1Fc可使FcγIIA /FcγIIB结合亲和力之比增加约15倍。Richards等人(2008)Mol.Cancer Therap.7:2517；Moore等人(2010)mAbs 2:181。用于增强FcyR和补体相互作用的其他修饰包括但不限于取代298A、333A、334A、326A、247I、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、305I和396L。这些和其他修饰在Strohl(2009)Current Opinion in Biotechnology20:685-691中进行了综述。具体地，ADCC和CDC两者均可以通过IgG1的位置E333处的变化(例如E333A)而增强。Shields等人(2001)J.Biol.Chem.276:6591。IgG1中P247I和A339D/Q突变用于增强效应子功能的用途披露于WO 2006/020114中，并且D280H、K290S±S298D/V披露于WO 2004/074455中。已显示K326A/W和E333A/S变体在人IgG1中可增加效应子功能，并且E333S在IgG2中可增加效应子功能。Idusogie等人(2001)J.Immunol.166:2571。

具体地，已经在人IgG1上绘制了FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已经描述了具有改善的结合的变体。Shields等人(2001)J.Biol.Chem.

不同的IgG同种型也展现出不同的CDC活性(IgG3>IgG1>>IgG2≈IgG4)。Dangl等人(1988)EMBO J.7:1989。对于需要增强CDC的用途，也可以引入增加与C1q的结合的突变。可以通过IgG2中K326和/或E333处的突变(如K326W，其降低ADCC活性，以及E333S)来增强募集补体的能力(CDC)，以增加与C1q(即补体级联的第一成分)的结合。Idusogie等人(2001)J.Immunol.166:2571。将S267E/H268F/S324T(单独地或以任何组合的形式)引入人IgG1中增强了C1q结合。Moore等人(2010)mAbs 2:181。Natsume等人(2008)Cancer Res.68:3863(其中的图1)的IgG1/IgG3杂合体同种型抗体“113F”的Fc区也赋予了增强的CDC。还参见Michaelsen等人(2009)Scand.J.Immunol.70:553和Redpath等人(1998)Immunology 93:595。

可以增加或降低效应子功能的另外的突变披露于Dall’Acqua等人(2006)J.Immunol.177:1129中。还参见Carter(2006)Nat.Rev.Immunol.6:343；Presta(2008)Curr.Op.Immunol.20:460。

也可以使用增强对抑制性受体FcyRIIb的亲和力的Fc变体，例如以增强细胞凋亡诱导的活性或佐剂活性。Li和Ravetch(2011)Science 333:1030；Li和Ravetch(2012)Proc.Nat’l Acad.Sci(USA)109:10966；美国专利申请公开案2014/0010812。此类变体可以提供具有与FcyRllb

糖基化

对抗体的糖基化进行修饰以增加或降低效应子功能。例如，可以通过使位置297处保守的天冬酰胺残基突变(例如N297A)从而消除补体和FcγRI结合来制备缺少所有效应子功能的去糖基化抗体。Bolt等人(1993)Eur.J.Immunol.23:403。还参见Tao和Morrison(1989)J.Immunol.143:2595(使用IgG1中的N297Q消除位置297处的糖基化)。

尽管去糖基化抗体通常缺少效应子功能，但可以引入突变来恢复该功能。去糖基化抗体，例如由于N297A/C/D/或H突变导致或在不使蛋白质糖基化的系统(例如大肠杆菌(E.coli))中产生的那些可以进一步突变(例如S298G和/或T299A/G/或H(WO 2009/079242)或E382V和M428I(Jung等人(2010)Proc.Nat’l Acad.Sci(USA)107:604))以恢复FcγR结合。

另外，可以通过改变糖基化来制备具有增强的ADCC的抗体。例如，已显示从重链Asn297连接的低聚糖去除岩藻糖在改善的与FcγRIIIa的结合的基础上可增强ADCC。Shields等人(2002)JBC 277:26733；Niwa等人(2005)J.Immunol.Methods 306:151；Cardarelli等人(2009)Clin.Cancer Res.15:3376(MDX-1401)；Cardarelli等人(2010)Cancer Immunol.Immunotherap.59:257(MDX-1342)。此类低岩藻糖抗体可以例如在缺少岩藻糖基转移酶(FUT8)的敲除中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Yamane-Ohnuki等人(2004)Biotechnol.Bioeng.87:614)中或在产生去岩藻糖基化抗体的其他细胞中产生。参见例如，Zhang等人(2011)mAbs 3:289和Li等人(2006)Nat.Biotechnol.24:210(两者均描述了糖工程化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的抗体产生)；Mossner等人(2010)Blood 115:4393；Shields等人(2002)J.Biol.Chem.277:26733；Shinkawa等人(2003)J.Biol.Chem.278:3466；EP 1176195B1。也可以如PCT公开案WO 03/035835中所述来增强ADCC，该文献披露了变体CHO细胞系Lec13的用途，所述细胞系具有降低的将岩藻糖附接至Asn(297)连接的碳水化合物的能力，从而也导致该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(还参见Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.

在抗体连接的低聚糖中增加二等分GlcNac结构也增强了ADCC。Umana等人的PCT公开案WO 99/54342描述了如下细胞系，其被工程化为表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N乙酰基葡糖胺转移酶III(GnTIII))，使得在工程化细胞系中表达的抗体展现出增加的二等分GlcNac结构，这导致抗体的ADCC活性增加(还参见Umana等人(1999)Nat.Biotech.

已开发了不含半乳糖、唾液酸、岩藻糖和木糖残基(所谓的GNGN糖型)的另外的糖基化变体，其展现出增强的ADCC和ADCP但降低的CDC；以及开发了不含唾液酸、岩藻糖和木糖(所谓的G1/G2糖型)的其他糖基化变体，其展现出增强的ADCC、ADCP和CDC。美国专利申请公开号2013/0149300。任选地在其中已敲除内源木糖基和岩藻糖基转移酶基因的经遗传修饰的本塞姆氏烟草(N.benthamiana)植物中产生具有这些糖基化模式的抗体。

糖工程化也可以用于通过改变在Fc区的Asn297处附接的碳水化合物链的α2,6唾液酸含量来修饰IgG构建体的抗炎特性，其中α2,6唾液酸化形式的比例增加导致增强的抗炎作用。参见Nimmerjahn等人(2008)Ann.Rev.Immunol.26:513。相反，在不需要抗炎特性的情况下，降低具有α2,6唾液酸化碳水化合物的抗体的比例可能是有用的。例如通过选择性纯化α2,6唾液酸化形式或通过酶促修饰来改变抗体的α2,6唾液酸化含量的方法提供于美国专利申请公开号2008/0206246中。在其他实施方案中，可以例如通过包含F241A修饰来修饰Fc区的氨基酸序列以模拟α2,6唾液酸化的作用。WO 2013/095966。

本文所述的抗体可以在轻链或重链可变区中含有一个或多个糖基化位点。此类糖基化位点可以导致增加的抗体免疫原性或由于改变的抗原结合而使抗体的pK改变(Marshall等人(1972)Annu Rev Biochem 41:673-702；Gala和Morrison(2004)J.Immunol172:5489-94；Wallick等人(1988)J Exp Med 168:1099-109；Spiro(2002)Glycobiology12:43R-56R；Parekh等人(1985)Nature 316:452-7；Mimura等人(2000)Mol Immunol 37:697-706)。已知糖基化发生在含有N-X-S/T序列的基序上。

生物半衰期

在某些实施方案中，对所述抗体进行修饰以增加其生物半衰期。可使用多种方法。例如，这可以通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力来进行。在一个实施方案中，使抗体在CH1或CL区域内改变以含有从IgG的Fc区的CH2结构域的两个环取得的挽救受体结合表位，如在Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。增加与FcRn的结合和/或改善药代动力学特性的其他示例性Fc变体包括位置259、308和434处的取代，其包括例如259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y和434M。增加Fc与FcRn结合的其他变体包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等人,2004,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216；Hinton等人2006Journal of Immunology176:346-356)，256A、272A、305A、307A、311A、312A、378Q、380A、382A、434A(Shields等人,Journal of Biological Chemistry,2001,276(9):6591-6604)，252F、252Y、252W、254T、256Q、256E、256D、433R、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H(Del'Acqua等人Journal of Immunology,2002,169:5171-5180；Dall'Acqua等人,2006,Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)。参见美国专利号8,367,805。

已提出IgG Fc中的某些保守残基(I253/H310/Q311/H433/N434)的修饰如N434A变体(Yeung等人(2009)J.Immunol.182:7663)作为增加FcRn亲和力从而增加抗体在循环中的半衰期的方法。WO 98/023289。已显示包含M428L和N434S的组合Fc变体可增加FcRn结合并可使血清半衰期增加高达五倍。Zalevsky等人(2010)Nat.Biotechnol.28:157。包含T307A、E380A和N434A修饰的组合Fc变体也可延长IgG1变体的半衰期。Petkova等人(2006)Int.Immunol.18:1759。另外，已显示包含M252Y/M428L、M428L/N434H、M428L/N434F、M428L/N434Y、M428L/N434A、M428L/N434M和M428L/N434S变体的组合Fc变体也可延长半衰期。WO2009/086320。

此外，包含M252Y、S254T和T256E的组合Fc变体使半衰期增加近4倍。Dall’Acqua等人(2006)J.Biol.Chem.281:23514。提供增加的FcRn亲和力但降低的pH依赖性的相关IgG1修饰(M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F)已用于产生IgG1构建体(“MST-HN Abdeg”)，所述IgG1构建体用作竞争剂以防止其他抗体与FcRn的结合，从而导致该其他抗体(内源IgG(例如在自身免疫环境中)或另一种外源性(治疗性)mAb)的清除率增加。Vaccaro等人(2005)Nat.Biotechnol.23:1283；WO 2006/130834。

用于增加FcRn结合的其他修饰描述于Yeung等人(2010)J.Immunol.182:7663-7671；6,277,375；6,821,505；WO 97/34631；WO 2002/060919中。

在某些实施方案中，杂合体IgG同种型可以用于增加FcRn结合，并且可能增加半衰期。例如，可以通过将CH2和/或CH3区域中的IgG1位置用两个同种型中不同的位置处的来自IgG3的氨基酸取代来构建IgG1/IgG3杂合体变体。因此，可以构建包含一个或多个取代(例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、422I、435R和436F)的杂合体变体IgG抗体。在本文所述的其他实施方案中，可以通过将CH2和/或CH3区域中的IgG2位置用两个同种型中不同的位置处的来自IgG1的氨基酸取代来构建IgG1/IgG2杂合体变体。因此，可以构建杂合体变体IgG抗体，其包含一个或多个取代，例如以下氨基酸取代中的一个或多个：233E、234L、235L、-236G(指在位置236处插入甘氨酸)和327A。参见美国专利号8,629,113。已产生了据称增加血清半衰期并改善表达的IgG1/IgG2/IgG4序列的杂合体。美国专利号7,867,491(其中的序列号18)。

也可以通过聚乙二醇化增加本发明的抗体的血清半衰期。可以将抗体聚乙二醇化以例如增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。为了将抗体聚乙二醇化，通常在一个或多个PEG基团附接至抗体或抗体片段的条件下，使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)试剂(如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。优选地，经由与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行聚乙二醇化。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生化其他蛋白质的任何形式的PEG，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是去糖基化的抗体。用于聚乙二醇化蛋白质的方法是本领域已知的并且可以应用于本文所述的抗体。参见例如Nishimura等人的EP 0154316和Ishikawa等人的EP 0401384。

可替代地，在一些情况下，可能希望减小而不是增加本发明抗体的半衰期。人IgG1的Fc中的修饰如I253A(Hornick等人(2000)J.Nucl.Med.41:355)和H435A/R I253A或H310A(Kim等人(2000)Eur.J.Immunol.29:2819)可以

稳定性

可以通过D221G和K222S修饰消除IgG1构建体的铰链中潜在的蛋白酶切割位点，从而提高抗体的稳定性。WO 2014/043344。

在某些实施方案中，本文所述的抗体不含有天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺作用可能发生在N-G或D-G序列上并且可能导致异天冬氨酸残基的产生，这可能将扭结引入多肽链中并可能降低其稳定性(异天冬氨酸作用)。

每种抗体都有独特的等电点(pI)，其通常在6与9.5之间的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7-9.5的pH范围内，并且IgG4抗体的pI通常落在6-8的pH范围内。推测pI值超出正常范围的抗体在体内条件下可能具有一定的展开和不稳定性。因此，优选具有含有落在正常范围内的pI值的抗体。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或通过使带电表面残基突变来实现。

每种抗体将具有特征性的解链温度，其中更高的解链温度指示在体内更大的总体稳定性(Krishnamurthy R和Manning M C(2002)Curr Pharm Biotechnol 3:361-71)。通常，优选的是T

在优选的实施方案中，选择不迅速降解的抗体。可以使用毛细管电泳(CE)和MALDI-MS(Alexander A J和Hughes D E(1995)Anal Chem 67:3626-32)测量抗体的降解。

当使用IgG4恒定结构域时，它通常优选包含取代S228P，其模拟IgG1中的铰链序列并因此稳定IgG4分子，从而例如减少在正在被治疗的患者体内治疗性抗体与内源IgG4之间的Fab臂交换。Labrijn等人(2009)Nat.Biotechnol.27:767；Reddy等人(2000)J.Immunol.164:1925。类似地，在含有IgG2铰链的抗体中，C219S和/或C220S突变稳定包含IgG2铰链的抗体。

聚集

在另一个优选的实施方案中，选择具有最小聚集作用的抗体，所述聚集作用可导致触发不希望的免疫应答和/或改变的或不利的药代动力学特性。通常，可接受抗体具有25％或更少、优选20％或更少、甚至更优选15％或更少、甚至更优选10％或更少、甚至更优选5％或更少的聚集。可以通过几种技术来测量聚集，所述技术包括尺寸排阻柱(SEC)、高效液相色谱法(HPLC)和光散射。

VII.非抗体蛋白和抗体衍生物

本文所述的本发明也可以应用于非全长抗体的分子，条件是它们包含铰链。例如，可以制备具有增强的生物活性或缺少效应子功能的IgG融合蛋白。因此，本文提供了融合蛋白，所述融合蛋白包含与包含IgG2铰链和任选的CH2和CH3结构域的IgG恒定区(例如，Fc区)或其部分连接(例如，共价连接)，或与具有降低的效应子功能(例如，包含P238处的突变，例如P238K)的IgG(例如，IgG1)或其部分连接的活性部分。所述Fc可以是本文所述的经修饰的重链恒定区的任何Fc，如表5、表6或序列表中列出的经修饰的重链恒定区的Fc部分。

本文所述的抗体也可以用于形成双特异性分子或用于CAR-T疗法的分子。可以将抗体或其抗原结合部分衍生或连接至另一种功能分子，例如另一种肽或蛋白质(例如，另一种抗体或受体的配体)以产生与至少两个不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。可以将本文所述的抗体衍生或连接至多于一种其他功能分子，以产生与多于两个不同结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子；此类多特异性分子也旨在由本文所用的术语“双特异性分子”涵盖。为了产生双特异性分子，本文所述的抗体可以与一种或多种其他结合分子(如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)功能性地连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其他方式)，使得产生双特异性分子。

VIII.组合物

进一步提供了组合物(例如，药物组合物)，所述组合物含有与药学上可接受的载体一起配制的一种本文所述的抗体或其抗原结合部分或者本文所述的抗体或其抗原结合部分的组合。此类组合物可以包含一种本文所述的抗体或免疫缀合物或双特异性分子或者(例如，两种或更多种不同的)本文所述的抗体或免疫缀合物或双特异性分子的组合。例如，本文所述的药物组合物可以包含与靶抗原上的不同表位结合或具有互补活性的抗体(或免疫缀合物或双特异性抗体)的组合。

在某些实施方案中，组合物包含浓度为至少1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml、1-300mg/ml或100-300mg/ml的本文所述的抗体。

本文所述的药物组合物也可以在组合疗法中施用，即与其他药剂组合。例如，所述组合疗法可以包括与至少一种其他抗癌剂和/或T细胞刺激(例如，激活)剂组合的本文所述的抗体。可以在组合疗法中使用的治疗剂的例子在下文关于本文所述的抗体的用途的部分中更详细地进行了描述。

在一些实施方案中，本文公开的治疗性组合物可以包含用于治疗癌症的其他化合物、药物和/或药剂。此类化合物、药物和/或药剂可以包括例如刺激对给定癌症的免疫应答的化疗药物、小分子药物或抗体。在一些情况下，治疗性组合物可以包含例如抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PDL-1抗体、抗OX40(也称为CD134、TNFRSF4、ACT35和/或TXGP1L)抗体或抗LAG-3抗体中的一种或多种。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，可以将活性化合物(即，抗体、免疫缀合物或双特异性分子)包被在材料中以保护化合物免受酸和可能使化合物失活的其他自然条件的作用。

本文所述的药物化合物可以包含一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性并且不赋予任何不希望的毒理作用的盐(参见例如，Berge,S.M.等人(1977)J.Pharm.Sci.

本文所述的药物组合物也可以包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

可用于本文所述的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。可以例如通过使用包衣材料(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度、以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。

这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述灭菌程序以及通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)两种方法来确保防止微生物的存在。还可能令人希望的是在组合物中包含等渗剂，如糖、氯化钠等。另外，可以通过包含延迟吸收的药剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延迟吸收。

药学上可接受的载体包括无菌水性溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑其在本文所述的药物组合物中的用途。补充性活性化合物也可以掺入到组合物中。

在制造和储存条件下，治疗性组合物通常必须是无菌且稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，通过使用包衣(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度、以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。通过在所述组合物中包含延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸盐和明胶)可以实现可注射组合物的延长吸收。

无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性化合物以所需量掺入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，之后微过滤灭菌。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有碱性分散介质和来自上文所列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干)，所述真空干燥和冷冻干燥由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外的所需成分的粉末。

可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据正在被治疗的受试者和特定的施用方式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，从百分比来说，该量范围在约0.01％至约99％的活性成分，优选约0.1％至约70％、最优选约1％至约30％的活性成分内，所述活性成分与药学上可接受的载体相组合。

可以调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以如根据治疗情况的紧急程度指示的按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物是尤其有利的，以便于施用和剂量的均匀。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算与所需的药物载体联合产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。本文所述的剂量单位形式的规格取决于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特征和所要实现的特定治疗效果，和(b)在合成用于治疗个体中的敏感性的这种活性化合物的领域中固有的限制。

对于抗体的施用，剂量在约0.0001至100mg/kg宿主体重且更通常在0.01至5mg/kg宿主体重的范围内。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或者在1-10mg/kg的范围内。示例性的治疗方案需要每周施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次、每四周施用一次、每月施用一次、每3个月施用一次或每三至6个月施用一次。本文所述的抗体的优选剂量方案包括经由静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，其中使用以下给药时间表中的一种给予所述抗体：(i)每四周，持续六个剂量，随后每三个月；(ii)每三周；(iii)一次3mg/kg体重，然后每三周1mg/kg体重。

在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体，在这种情况下，所施用的每种抗体的剂量都在所指示范围内。通常在多种场合施用抗体。单剂量之间的间隔可以是例如每周、每月、每三个月或每年。如通过测量患者体内针对靶抗原的抗体的血液水平所指示，间隔也可以是不规则的。在一些方法中，调整剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中，达到约25-300μg/ml。

抗体可以作为持续释放制剂施用，在这种情况下需要较不频繁的使用。剂量和频率根据患者体内抗体的半衰期而变化。通常，人抗体显示出最长的半衰期，其次是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，以相对不频繁的间隔长时间施用相对低的剂量。一些患者在余生持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔相对高的剂量，直到疾病的进展减少或终止，并且优选直到患者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可以向患者施用预防性方案。

可以改变本文所述的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得有效实现针对特定患者、组合物和施用方式的所需治疗反应而对患者无毒的活性成分的量。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本文所述的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，所采用的特定化合物的排泄速率，治疗持续时间，与所采用的特定化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史，以及医学领域中熟知的类似因素。

本文所述的抗体的“治疗有效剂量”优选导致疾病症状的严重程度的降低、无疾病症状时期的频率和持续时间的增加、或由于疾病困扰引起的损伤或残疾的预防。在癌症的情况下，治疗有效剂量优选预防与癌症有关的身体症状的进一步恶化。癌症的症状是本领域熟知的，并且包括例如异常的痣特征、痣外观(包括不对称性、边界、颜色和/或直径)的变化、新色素化的皮肤区域、异常痣、指甲下变黑的区域、乳房肿块、乳头变化、乳房囊肿、乳房疼痛、死亡、体重减轻、无力、过度疲劳、进食困难、食欲不振、慢性咳嗽、恶化的呼吸困难、咳血、尿中带血、大便带血、恶心、呕吐、肝转移瘤、肺转移瘤、骨转移瘤、腹部饱胀感、腹胀、腹腔积液、阴道出血、便秘、腹胀、结肠穿孔、急性腹膜炎(感染、发烧、疼痛)、疼痛、吐血、大量出汗、发烧、高血压、贫血、腹泻、黄疸、头晕、发冷、肌肉痉挛、结肠转移瘤、肺转移瘤、膀胱转移瘤、肝转移瘤、骨转移瘤、肾转移瘤和胰腺转移瘤、吞咽困难等。

治疗有效剂量可以预防或延迟癌症的发作，如当出现疾病的早期或初步体征时可能需要所述治疗有效剂量。用于诊断癌症的实验室测试包括化学、血液学、血清学和放射学。因此，监测前述任何一项的任何临床或生化测定可以用于确定特定治疗是否是用于治疗癌症的治疗有效剂量。本领域普通技术人员将能够基于此类因素(如受试者的体型、受试者症状的严重程度以及所选择的施用的特定组合物或途径)来确定此类量。

可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种经由一种或多种施用途径施用本文所述的组合物。如熟练技术人员将理解的，施用的途径和/或模式将根据期望的结果而变化。本文所述的抗体的优选给药途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用以外的施用方式(通常通过注射施用)，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

可替代地，本文所述的抗体可以经由非肠胃外途径(如局部、表皮或粘膜施用途径)施用，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。

可以将活性化合物与保护化合物免于快速释放的载体(如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊递送系统)一起制备。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法已获得专利或通常是本领域技术人员已知的。参见例如，Sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery Systems,J.R.Robinson编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。

可以将治疗性组合物用本领域已知的医疗装置施用。例如，在优选的实施方案中，可以将本文所述的治疗性组合物用无针皮下注射装置(如在美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中披露的装置)施用。用于与本文所述的抗体一起使用的熟知的植入物和模块的例子包括：美国专利号4,487,603，其披露了用于以受控制的速率分配药物的可植入的微输注泵；美国专利号4,486,194，其披露了用于通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其披露了用于以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其披露了用于连续药物递送的可变流量可植入输注设备；美国专利号4,439,196，其披露了具有多室区室的渗透性药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其披露了渗透性药物递送系统。将这些专利通过引用并入本文。许多其他此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。

在某些实施方案中，可以将本文所述的抗体配制以确保体内适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排斥许多高度亲水性化合物。为了确保本文所述的治疗性化合物穿过BBB(如果需要的话)，可以将它们配制在例如脂质体中。有关制造脂质体的方法，参见例如美国专利4,522,811、5,374,548和5,399,331。脂质体可以包含选择性地转移到特定细胞或器官中从而增强靶向药物递送的一个或多个部分(参见例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如，Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等人(1995)FEBS Lett.357:140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。

IX.用途和方法

本文所述的抗体、抗体组合物和方法具有许多体外和体内效用，所述效用涉及例如多种障碍(例如，癌症和免疫疾病)的治疗。例如，本文所述的抗体可以在体外或离体施用至培养中的细胞，或者例如在体内施用给人类受试者。因此，本文提供了治疗受试者的方法，所述方法包括向受试者施用包含经修饰的重链恒定区的抗体，从而进行治疗。本文还提供了改变受试者体内的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用抗体，使得改变受试者体内的免疫应答。优选地，所述应答被增强、刺激或上调。然而，在其他实施方案中，免疫应答被抑制。

优选的受试者包括在其中期望增强免疫应答的人类患者。使用具有增强的内化或激动剂活性的经修饰的重链恒定区的方法可以用于治疗患有可通过增强免疫应答(例如，T细胞介导的免疫应答)来治疗的障碍的人类患者。在具体的实施方案中，所述方法可以适用于在体内治疗癌症。在一个实施方案中，所述受试者是荷瘤受试者，并且刺激了针对肿瘤的免疫应答。肿瘤可以是实体瘤或液体瘤，例如血液恶性肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤是免疫原性肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤是非免疫原性的。在某些实施方案中，肿瘤是PD-L1阳性的。在某些实施方案中，肿瘤是PD-L1阴性的。受试者也可以是携带病毒的受试者，并且刺激了针对病毒的免疫应答。

进一步提供了用于抑制受试者体内的肿瘤生长的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的抗体，使得抑制受试者体内肿瘤的生长。进一步提供了治疗受试者体内的病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的抗体，使得治疗受试者体内的病毒感染。

本文还涵盖了用于从患有肿瘤(例如，癌性肿瘤)的受试者的肿瘤微环境耗竭Treg细胞的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的抗体，所述抗体包含刺激肿瘤微环境中T

在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定区的抗体与刺激分子结合并抑制刺激分子的活性，即所述抗体是刺激分子的拮抗剂；或者所述抗体与抑制性分子结合并刺激抑制性分子的活性，即所述抗体是抑制性分子的激动剂。此类抗体可以用于治疗其中免疫系统或免疫应答应当下调的疾病(例如，自身免疫病)或预防移植排斥。

癌症

本文提供了用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的抗体，使得受试者得到治疗，例如使得癌性肿瘤的生长被抑制或减少和/或使得肿瘤消退。例如，通过抗GITR抗体激活GITR可以增强患者体内针对癌细胞的免疫应答。所述抗体可以单独用于抑制癌性肿瘤的生长。可替代地，所述抗体可以与另一种药剂(例如，其他免疫原性药剂)、标准癌症治疗或其他抗体联合使用。

可以使用本文所述的抗体抑制其生长的癌症包括通常对免疫疗法有反应或没反应的癌症。用于治疗的癌症的非限制性例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非NSCLC、神经胶质瘤、胃肠道癌、肾癌(例如，透明细胞癌)、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(例如，肾细胞癌(RCC))、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤(多形性胶质母细胞瘤)、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌和头颈癌症(或癌)、胃癌、生殖细胞瘤、小儿肉瘤、鼻窦自然杀伤细胞、黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤，如皮肤或眼内恶性黑色素瘤)、骨癌、皮肤癌、子宫癌、肛门区域癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症(包括石棉诱导的那些癌症)、病毒相关的癌症(例如，人乳头瘤病毒(HPV)相关的肿瘤))以及源自两种主要血细胞谱系(即髓样细胞系(其产生粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞)或淋巴细胞系(其产生B、T、NK和浆细胞))中任一种的恶性血液病(例如，所有类型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，例如急性、慢性、淋巴细胞性和/或骨髓性白血病，如急性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和慢性骨髓性白血病(CML)、未分化AML(M0)、粒细胞白血病(M1)、粒细胞白血病(M2；伴随细胞成熟)、早幼粒细胞白血病(M3或M3变体[M3V])、骨髓单核细胞性白血病(M4或M4变体伴随嗜酸性粒细胞增多症[M4E])、单核细胞性白血病(M5)、红白血病(M6)、巨核母细胞性白血病(M7)、孤立的粒细胞肉瘤和绿色瘤)；淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、间变性(例如，Ki 1+)大细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、肠T细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、前体T淋巴母细胞性淋巴瘤、T淋巴母细胞；和淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤、移植后淋巴细胞增殖性疾病、真性组织细胞性淋巴瘤、原发中枢神经系统淋巴瘤、原发渗出性淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤(LBL)、淋巴谱系造血肿瘤、急性淋巴母细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥散组织细胞淋巴瘤(DHL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTLC)(也称为蕈样肉芽肿病或塞扎里综合征)、和伴有沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症的淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)；骨髓瘤，如IgG骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、冒烟型骨髓瘤(也称为惰性骨髓瘤)、孤立性浆细胞瘤和多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞淋巴瘤；骨髓谱系造血肿瘤、间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；精原细胞瘤、畸胎癌、中枢神经肿瘤和外周神经肿瘤，包括星形细胞瘤、神经鞘瘤；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡状癌和畸胎癌、淋巴谱系造血肿瘤，例如T细胞和B细胞肿瘤，包括但不限于T细胞障碍，如T细胞幼淋巴细胞性白血病(T-PLL)，包括小细胞和脑样细胞类型；优选T细胞型大颗粒淋巴细胞性白血病(LGL)；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；外周/胸腺后T细胞淋巴瘤(多形和免疫母细胞亚型)；血管中心性(鼻)T细胞淋巴瘤；头颈癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌；急性骨髓淋巴瘤以及上述癌症的任何组合。本文所述的方法也可以用于治疗转移性癌症、难治性癌症(例如，先前的免疫疗法(例如，用阻断CTLA-4或PD-1抗体)难治的癌症)和复发性癌症。

实施例

实施例1：具有IgG2铰链的抗CD73抗体相对于具有非IgG2铰链的相同抗体而言增强的内化

已经观察到，在细胞CD73抑制测定中具有IgG2恒定区的杂交瘤来源的抗CD73抗体11F11比作为IgG1或IgG1.1(无效应子的IgG1)的11F11抗体更有力，并且比具有IgG1恒定区的其他抗CD73抗体更有力。至少基于此观察结果，假设相对于具有非IgG2铰链(如IgG1铰链)的抗CD73抗体，具有IgG2铰链的抗CD73抗体的抑制活性增加是由于抗体的内化增加。为了检验此假设，在内化测定中测试了具有IgG1或IgG2恒定区或其部分的抗CD73抗体。

表7列出了所使用的抗体，所述表提供了每种抗体的(全部为人类的)恒定区的结构域中每一个结构域(包括特定突变(如果存在的话))的身份。

表7

通过在HEK293-6E细胞中表达重链和轻链来制备抗体，并在转染后5天收获培养基。

测量了构建体与FcγR的结合。IgG1.1和IgG2分子的hCD64和hCD32a-H131结合数据与不同Fc的预期值一致。IgG1.1f是最具惰性的Fc。IgG2和IgG2-C219S显示出IgG2的典型FcR结合。正如所预期的，IgG2-C219S-G1.1f的数据表明比野生型IgG1或IgG2显著更弱的结合，但与IgG1.1f相比增加的结合。

测量了抗体对人CD73的亲和力，以确定恒定区的变化是否影响它们。如下通过表面等离子体共振(SPR)确定亲和力。在25℃下通过表面等离子体共振(SPR)使用BiacoreT100仪器(GE Healthcare)研究CD73结合动力学和亲和力。此实验测试了hCD73的N末端结构域(由人CD73的残基26-336组成；称为N-hCD73)与被捕获在固定化蛋白A表面上的抗体的结合。对于这些实验，在0.01M HEPES(pH 7.4)、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％v/v tween20的运行缓冲液中，使用标准乙基(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学反应与乙醇胺封闭将蛋白A(Pierce)在CM5传感器芯片(GE Healthcare)的流动池1-4上固定至3000-4000RU的密度。通过以下方法进行动力学实验：首先使用30s接触时间以10ul/min在蛋白A上捕获抗体(5-10ug/ml)，使用180s缔合时间和360s解离时间以30ul/min的流速结合600、200、66.7、22.2、7.4和2.5nM N-hCD73-his。动力学实验的运行缓冲液是10mM磷酸钠、130mM氯化钠、0.05％tween 20，pH 7.1。在每个循环后，以30μl/min的流速使用10mM甘氨酸(pH 1.5)的两个30s脉冲使表面再生。对传感图数据进行双重参照，然后使用Biacore T100评价软件v2.0.4拟合到1:1朗格缪尔模型(Langmuir model)，以确定缔合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡解离常数(KD)。

结果显示于表8中。所述表汇总了来自不同实验的数据。对于显示了两组数字的抗体，每组对应于在单独实验中获得的数据。

表8

结果表明抗体(例如，CD73.10)中不同恒定区的存在没有改变抗体对人CD73的亲和力。

在两种不同的测定中测量了抗CD73抗体的内化。

A.

通过在抗体孵育2小时后评估细胞表达，使用抗CD73抗体来测试在Calu6细胞中抗CD73抗体依赖性CD73内化。将20μl完全培养基(含10％热灭活的胎牛血清的Gibco RPMIMedia 1640)中的细胞(2,000个细胞/孔)铺板在384BD Falcon板中，并在37℃、5％CO

结果提供于表9中。

表9

ND＝未检测到

NA＝不适用

结果显示，具有IgG2铰链的抗CD73抗体具有较低的EC50和较高的Ymax。

进行了动力学内化研究以评估内化速率。测试了几种细胞系：H2228细胞、HCC15细胞、Calu6细胞和NCI-H2030。将20μl完全培养基(含10％热灭活的胎牛血清的Gibco RPMIMedia 1640)中的细胞(2,000个细胞/孔)铺板在384BD Falcon板中，并在37℃、5％CO

表10

表11：4种人类细胞系中CD73抗体的T

结果表明11F11(IgG2抗体)在数分钟内内化，在30分钟内达到平台，而6E11(IgG1抗体)内化更慢，在约1h时达到平台(图1A至图1J)。类似地，具有IgG1恒定区的11F11比具有IgG2恒定区的11F11的内化更慢。在几种细胞系中观察到了这种趋势(表10和表11和图1A至图1J)。

B.

还通过流式细胞术测试了抗CD73抗体介导的CD73内化。将所指示细胞与10μg/mL的所指示抗体在冰上孵育30分钟，洗涤几次，并转移至37℃持续指示的时间。在指示的孵育时间后，同时收获细胞。再次将细胞用一抗(用于初次孵育的相同抗体)染色，然后用抗人二抗染色。然后通过流式细胞术测定了细胞的CD73表达。

显示于图1E和表11中的结果与上述内化测定中获得的那些结果一致，并且表明所有具有IgG2铰链和CH1的抗体都诱导了快速且完全的内化。在洗出后22小时之后，CD73水平仍然是低的，表明内化是持久的。

在NCI-H292细胞系中获得了图1F和表11中所示的类似结果，其中将抗体在孵育时间内保持培养(未洗出)。再次，这些数据指示内源CD73的快速且显著的内化以及下调的维持。

还使用人SNU-C1(结肠癌细胞系)和NCI-H1437(非小细胞肺癌细胞系)细胞进行了内化测定。显示于图1I和图1J中的结果也指示快速内化，其中在5小时内达到最高水平，而CD73.4.IgG2-C219S-IgG1.1f在SNU-C1细胞中达到约50％的最高内化水平并且在NCI-H1437细胞中达到约60％的最高内化水平。图1G和图1H示出了Calu6和NCI-H292细胞中CD73.4.IgG2-C219S-IgG1.1f内化的类似动力学。对于显示内化的CD73的％的图，此数字是如下获得的：

其中对于每种抗体，MFI

表12：几种细胞系中抗体介导的CD73内化的EC

因此，相对于具有IgG1铰链的抗CD73抗体，具有IgG2铰链的抗CD73抗体内化更快并且内化程度更高。

实施例2：具有IgG2铰链的GITR抗体相对于具有IgG1铰链的相同抗体而言增强的激动剂活性

此实施例证实，包含IgG2铰链的抗GITR抗体相对于具有IgG1铰链的相同抗体具有增强的诱导从T细胞分泌IL-2和IFN-γ的能力。

在上述CHO-OKT3和3A9测定中已经观察到，与其中将重链恒定区转换为IgG1或无效应子IgG1(IgG1.1)的重链恒定区的相同抗体相比，具有IgG2恒定区的杂交瘤来源的抗体在刺激细胞因子分泌方面更有力。因此，在这些测定中进一步测试了IgG2恒定区或铰链对抗GITR抗体的影响。

将抗人GITR抗体的重链可变区(SEQ ID NO:75)与表13所示的重链恒定区连接。抗GITR抗体的轻链包含SEQ ID NO:77。表13显示了恒定区的每个结构域的身份：

表13：此实施例中使用的抗体的重链恒定区

*全长重链恒定区的SEQ ID NO

首先，将这些GITR抗体的结合亲和力与具有IgG1铰链的GITR抗体的结合亲和力进行比较。如下通过Biacore确定抗GITR抗体与可溶性GITR的结合亲和力。将抗GITR抗体捕获在人κ包被的芯片(约5KRU；Southernbiotech目录号2060-01)上，并使重组人GITR(rHGITR/Fc：R&D systems，目录号689-GR)以500nM、250nM、125nM、62nM和31nM的浓度流过芯片。mAb/体积的捕获浓度为2-40μg/mL(5μL，在10μL/min下)。抗原缔合时间在15μL/min下为5分钟，抗原解离时间为6分钟，并用50mM HCl/50mM NaOH(各12μL，在100μL/min下)进行再生。

显示于图2中的结果表明具有IgG2铰链的所有三种GITR抗体对激活的T细胞都具有类似的亲和力，因为GITR抗体具有IgG1或IgG1.1恒定区。

接下来，测试了具有IgG1恒定区或IgG2铰链/IgG1 Fc结构域的GITR抗体诱导从用表达抗CD3scFv(OKT3)的CHO细胞刺激的人供体T细胞分泌IL-2和IFN-γ的能力。CHO细胞表达低水平的OKT3以促进次优刺激，从而能够观察到抗GITR抗体的激动作用。用表达OKT3的CHO细胞和抗GITR抗体刺激来自供体的CD4+T细胞，并测量了IL-2和IFN-γ分泌。如下进行实验。对于用CD4+T细胞进行的实验，CD4+T细胞是根据制造商的方案用RosetteSep人CD4+T细胞富集混合物(StemCell Technology#15062)从人PBMC获得的。将表达抗CD3scFv(OKT3)的CHO细胞(CHO-OKT3)用RPMI培养基洗涤两次，并以50K Rad的剂量进行辐照。收获细胞，并将其以2.5x10

如图3A和图3B所示，具有IgG2铰链/IgG1 Fc结构域的抗体(抗GITR.g2.g1)诱导的从T细胞分泌IL-2和IFN-γ的程度均高于具有IgG1恒定区的抗体(抗GITR.g1)。这些恒定结构域的无效应子形式获得了类似的结果(图3C)。

为了进一步确认包含IgG2铰链的抗GITR抗体增强T细胞的激活，以不同的实验形式测试了IL-2分泌。在此实验中，如下测试了GITR抗体诱导从3A9-hGITR细胞(异位表达人GITR的小鼠T细胞杂交瘤3A9细胞系)分泌IL-2的能力。将异位表达人GITR的小鼠T细胞杂交瘤3A9细胞系(3A9-hGITR)在存在渐增量的所指示抗体的情况下在抗CD3单克隆抗体包被的板上培养。将5x10

如图4所示，所有具有IgG2铰链的抗体(抗GITR.g2、抗GITR.g2.g1f和抗GITR.g2.g1.f)诱导的从3A9-hGITR细胞分泌IL-2的程度都高于其含有IgG1恒定区的对应物(抗GITR.g1f和抗GITR.g1.1f)。

这些结果共同表明，具有IgG2铰链和g1或g1.1恒定区的抗GITR抗体比具有IgG1铰链的相同抗体更有力。

实施例3：不同铰链/Fc组合对抗体/抗原复合物大小的影响

如以上实施例中所示，与具有IgG1铰链的相同抗体相比，具有IgG2铰链的抗CD73抗体是更好的CD73细胞活性抑制剂并更好地内化，并且具有IgG2铰链的抗GITR抗体是比具有IgG1铰链的相同抗体更有力的激动剂。基于此观察结果以及IgG2铰链比IgG1铰链更僵硬的事实，假设相对于具有IgG1铰链的抗体，在抗原与具有IgG2铰链的抗体之间形成更大的复合物。进行了以下实验以分析此假设。

通过SEC-MALS和DLS检查了溶液中CD73/抗体复合物的结构和低聚状态。对于这些研究，将含有IgG1或IgG2恒定区的抗体与重组蛋白以不同的摩尔比混合，所述重组蛋白包含人CD73中含有C末端聚组氨酸标签的全长细胞外结构域(人CD73的氨基酸残基26-546，称为hCD73-his)或对应于人CD73的N末端结构域的片段(氨基酸残基26-336，称为N-hCD73-his)。

通过与在线多角度光散射检测器耦合的尺寸排阻色谱法(SEC-MALS)检查了CD73/抗体复合物的低聚状态。在与Prominence Shimadzu UFLC连接的Shodex PROTEIN KW-803柱上，在以0.5mL/min运行的含有200mM K

动态光散射(DLS)研究是在25℃下在384孔板中的Wyatt DynaPro读板器上进行的。实验参数是每次测量的20个采集，每个采集5s，并一式四份地记录了测量结果，其中报告了平均值和标准差。使用Dynamics软件(Wyatt Technologies)中的“正则化”算法来拟合强度自相关函数。

SEC-MALS和DLS的总结提供于图6和图7中。单独抗体的分析显示了每种抗体的保留时间(约16-17min)、质量(140-150kDa)和流体动力学半径(5.0-5.4nm)，这些对于单体单克隆抗体而言是典型的。hCD73-his蛋白的数据与在溶液中采用预期的二聚体结构的蛋白质一致；具体地，根据SEC-MALS数据确定的质量(120kDa)与CD73-his二聚体的预期质量(117kDa)一致，而与hCD73-his单体的预期质量(58.5kDa)不一致。N-hCD73的数据与在溶液中作为单体的重组N结构域蛋白一致(SEC-MALS测量的质量＝38kDa，相比之下预期单体质量＝35.0kDa)，这是预期的，因为全长CD73细胞外结构域中与蛋白质的二聚化有关的区域包含在C末端结构域内，而对N结构域残基没有贡献。

发现给定抗体与N-hCD73-his的等摩尔混合物在SEC中洗脱为单一种类，其保留时间比单独抗体或N-hCD73-his的保留时间短，并且通过DLS得到的流体动力学半径(Rh)也更大，这与复合物的形成是一致的。MALS数据指示这些复合物的质量为约210kDa。这与一个N-hCD73-his分子结合给定抗体的两个Fab结构域中的每一个以形成1:2抗体:N-hCD73-his复合物是一致的。

抗CD73抗体与hCD73-his二聚体的混合物的SEC-MALS数据显示，所述混合物比单独的hCD73-his或抗体更早地洗脱，这表明形成了复合物。含有相同可变区但不同恒定结构域的mAb的数据的比较显示，hCD73-his与含有IgG2恒定结构域(IgG2-C219S、IgG2-C219S-IgG1.1f)的mAb的复合物的洗脱时间比hCD73-his与含有IgG1.1f恒定结构域的mAb的复合物的洗脱时间更早。另外，hCD73-his与含有IgG2恒定结构域的mAb的复合物的MALS确定的质量大于hCD73-his与含有IgG1恒定结构域的mAb的复合物的MALS确定的质量。DLS数据进一步显示，hCD73-his与含有IgG2恒定结构域的mAb的复合物的流体动力学半径大于hCD73-his与含有IgG1恒定结构域的mAb的复合物的流体动力学半径。例如，具有三个不同恒定区(IgG2-C219S、IgG2-C219S-IgG1.1f或IgG1.1f)的CD73.4的SEC-MALS和DLS数据显示于图5中。在这里可以看出，与hCD73-his和CD73.4-IgG1.1f的复合物相比，hCD73-his与含有IgG2恒定结构域的CD73.4的复合物具有更短的保留时间(图5A)、更大的流体动力学半径(图5B)和更大的MALS确定的质量(图5C)。基于MALS质量，hCD73-his与抗体之间的复合物的结构和化学计量比的示意模型显示于图5D中，其中含有CD73.4-IgG1.1f的复合物主要形成较小的2:2(峰1＝约550kDa)或4:4mAb/CD73二聚体复合物(峰2＝约1300kDa)，而CD73.4-IgG2-C219S或CD73.4-IgG2-C219S-IgG1.1f与hCD73-his形成大得多的复合物(>3000kDa)，其精确的结构和化学计量比无法确信地建模。

SEC-MALS和DLS数据共同证实，与含有IgG1铰链区(IgG1.1f)的mAb相比，hCD73-his与含有IgG2铰链区(IgG2-C219S或IgG2-C219S-IgG1.1f)的mAb之间形成更大的复合物。

实施例4：IgG2同种型的CH1进一步改善抗体介导的CD73内化

在Calu6和H292细胞中进行了另外的内化测定以进一步区分同种型对内化的作用。如实施例1A和实施例1B中所述进行了内化测定(不含抗体的洗出步骤的流式细胞术方案)，并且将表14中显示的不同杂合体同种型的抗体在孵育时间内以10μg/mL保持培养。对于流式细胞术实验，改编实施例1B的方法以在96孔板(与48孔板相对)中以每孔50,000个细胞进行高通量分析。

表14：用CD73.4的可变区测试的恒定区：

显示FcγR结合正如对于每种构建体所预期的，即FcγR结合由下部铰链/CH2区域驱动。

结果显示于图8A、图8B和图8C以及表15和表16中。表15中显示的数据是使用与实施例1B中所述相同的方案(未洗出抗体)生成的。表16中显示的数据是使用与实施例1A中所述相同的方案生成的。

表15：Calu6和NCI-292细胞中抗体介导的CD73内化的Ymax和T

表16：Calu6细胞中具有不同恒定区的CD73.4的内化特征

图8A至图8C以及表15和表16表明，具有IgG2同种型的铰链和CH1结构域的抗体最有效地驱动CD73的内化，而具有IgG1铰链和CH1结构域的抗体对应于图中较低的曲线，即内化程度较低。另外，与人IgG1铰链相比，仅含来自IgG2的铰链的抗体具有增加的内化。因此，相对于在IgG1同种型情况下的抗体，具有IgG2同种型的铰链和CH1结构域的抗体具有优越的内化特征。

因此，取决于所测试的细胞系，抗CD73抗体mAb-CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f(具有含C219S取代的IgG2铰链和IgG2 CH1结构域)诱导了快速内化。内化的T

实施例5：IgG2 CH1增强GITR Ab诱导的由CD4+T细胞分泌IL-2

此实施例显示，相对于具有IgG1同种型的CH1结构域的抗体，IgG2同种型的CH1结构域增强抗GITR抗体诱导的T细胞活性。

将实施例4中使用的相同的经修饰的重链恒定区与(实施例2的)抗GITR抗体的可变区连接。将供体CD4+T细胞与表达OKT3-scFv的CHO细胞和多种抗GITR抗体一起孵育，并测量了分泌的IL-2水平。这如实施例2中所述来进行。

显示于图9中的结果表明，具有IgG2同种型的CH1结构域以及IgG2同种型的铰链的所有抗GITR抗体都比具有IgG1铰链和CH1的抗GITR抗体更有效地刺激从CD4+T分泌IL-2。

因此，此实施例显示，相对于不具有IgG2同种型的铰链和/或CH1结构域的相同抗体，激动剂抗GITR抗体中IgG2铰链和IgG2 CH1结构域的存在进一步增强抗体的激动剂活性。相对于具有IgG2同种型的铰链而没有CH1的抗体，同时具有IgG2同种型的铰链和CH1结构域的抗体具有更强的激动剂作用。另外，具有来自IgG2的CH1结构域的抗体比具有来自IgG1同种型的CH1结构域的抗体具有更强的激动剂活性。具有来自IgG2的铰链和来自IgG1的CH1结构域的抗体比具有来自IgG1同种型的CH1和铰链的抗体具有更强的激动剂活性。

实施例6：IgG2 CH1和铰链中的某些氨基酸残基与改善抗体介导的CD73内化的相关性

制备了具有表17所示的重链恒定区的抗CD73抗体(CD73.4)，并如上所述将其在抗体介导的CD73内化测定中进行了测试。

表17：与抗CD73可变区融合的重链恒定区

等同物

显示于图10中的结果提供了在CD73内化的情况下的以下信息：

·CH2结构域似乎没有产生影响，如以下各项所示：

οa)观察到在具有形式“AY”的包含经修饰的重链恒定区的抗体(具有IgG2铰链ERKCCVECPPCPAP

22))之间在内化能力方面非常小的差异(组5、组6和组7)；

οb)CH2互换与野生型G1或G2是可比较的(组5和组6)；以及

οc)残基237对内化没有影响：向IgG2铰链添加“G”残基和在IgG1铰链中缺失C末端“G”都未对内化产生影响(组9)。

这表明CH2结构域不影响内化(即，CH2结构域可以来自IgG1或IgG2)；

·将IgG1中的组3中所示的CH1区域(KRGEGSSNLF；KRGEGS；SNLF；ITNDRTPR和SNLFPR)与IgG2的那些CH1区域互换几乎没有提供益处，即内化仍然类似于IgG1的内化(参见组3)；

·将IgG2中的组4中所示的CH1区域(RKEGSGNSFL；RKEGSG；NSFL；TIDNTRRP和NSFLRP)与IgG1的那些CH1区域互换产生可变的影响：改变NSFL没有影响，而改变其他2个区域(RKEGSG和RP)产生影响(参见组4)。根据组3和组4的结果，似乎CH1区域与铰链之间存在相互作用，其中RKEGSG和RP区域比NSFL区域更重要；

·铰链区影响内化，即相对于IgG1的铰链，IgG2的铰链提供更好的内化(参见组7和组8)。另外，相对于IgG1，具有缺失的IgG1(G1-delta-铰链)改善了内化。具有缺失的IgG2(G2-delta-铰链)提供了相对于IgG2铰链的内化水平类似的内化水平。这表明铰链区影响内化，这种影响通过IgG2 CH1增强(G2-G1-G2-G2-AY与G1-G2-G1-G1-AY是可比较的)；

·与IgG2.3(C219S)相比，IgG2.4(C220S)具有类似或降低的内化。与单独的IgG2.3或IgG2.4相比，IgG2.3/4(C219S/C220S)的内化大大降低(参见组10)。这表明具有IgG2铰链和C219S的抗体的内化与具有C220S的IgG2铰链的内化大致相同，两者均比具有C219S和C220S两者的IgG2铰链的内化要好得多；

·与具有C131的构建体相比，IgG2.5(C131S突变)的内化降低(参见组1、组6和组7)。

因此，这些结果表明CH1结构域和铰链均与抗体介导的CD73内化有关，并且相对于具有来自IgG1的这些区域的抗体，具有来自这些结构域的IgG2序列的抗体内化效果更好。

实施例7：具有IgG2铰链和/或CH1结构域的抗体形成高分子量复合物

如实施例3中所述，还通过SEC-MALS和DLS实验测试了具有表14中列出的重链恒定区的CD73.4抗体的高分子量复合物的形成。

先前测试了本研究的16种抗体中的三种：CD73.4-IgG1.1f，CD73.4-IgG2-C219S(也称为CD73.4-IgG2.3)和CD73.4-IgG2-C219S-IgG1.1f(也称为CD73.4-IgG2.3G1.1f-KH)。单独抗体的SEC-MALS和DLS数据显示了每种抗体的保留时间、质量和流体动力学半径，这些对于单体单克隆抗体而言是典型的。与单独的抗体或hCD73-his相比，对于所有复合物，每种抗体(5.5uM)与hCD73-his(5.5uM)的等摩尔复合物都显示出更慢的保留时间，这表明复合物的形成。16种复合物中每种复合物的SEC色谱图数据的叠加显示于图11A中。色谱图数据可以分为4个不同的峰，其显示于图11B中。峰1含有最大的种类，其MALS确定的质量表明复合物的质量当量大于4:4hCD73-his:mAb复合物。峰2含有如下种类，其MALS确定的质量表明复合物为约2:2hCD73-his:mAb复合物。峰3是次要种类，其具有低的信号并且MALS确定的质量表明了约1:1hCD73-his:mAb复合物。峰4对应于单独mAb的洗脱，其MALS确定的质量与游离抗体一致。为了定量每个种类的相对量，将每个色谱图的4个峰按照峰1(<12.9min)、峰2(12.9-15.1min)、峰3(15.1-16.7min)、峰4(16.7-19.3min)进行积分。积分还包括另外的积分范围(称为峰5(>19.3min))以解释任何低分子量种类，发现这些种类是可忽略不计的(<所有复合物的3.5％)。来自这种积分的每个种类的百分比总结于表18中。所有复合物都含有类似小百分比的峰3(约6％-9％)，但其他峰的量是可变的。最值得注意的是，hCD73-his与含有来自hIgG1的CH1结构域的抗体之间的所有复合物都具有显著较大百分比的较小复合物(峰2)，而含有来自hIgG2的CH1结构域的那些具有较大百分比的较大复合物(峰1)(表18和图11C)。这表明在较高阶复合物的形成中，不仅铰链区而且CH1结构域均具有重要作用。

表18：具有经修饰的重链恒定区的CD73.4抗体的保留时间

实施例8：具有工程化恒定结构域的抗体的Fc受体结合

此实施例证实，具有包含IgG2的CH1和铰链的经修饰的重链恒定区的抗体在其含有IgG1的CH2和CH3结构域时与FcγR结合。

除了通过可变结构域结合抗原以外，抗体还可以通过与恒定结构域相互作用而与Fc-γ受体(FcgR)接合。这些相互作用介导效应子功能，如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。IgG1同种型的效应子功能活性高；但IgG2和IgG4的效应子功能活性非常低或不存在，因为这些同种型对FcgR具有较低的亲和力。另外，可以通过恒定区内氨基酸残基的突变来修饰IgG1的效应子功能，以改变FcgR亲和力和选择性。

使用包括Biacore表面等离子体共振(SPR)和Fortebio生物膜层干涉(BLI)在内的生物传感器技术研究了抗体与Fcγ受体(FcγR或FcgR)的结合。SPR研究是在25℃下在Biacore T100仪器(GE Healthcare)上进行的。使用EDC/NHS将来自鼠抗6xHis抗体的Fab片段固定在CM5传感器芯片上，达到约3000RU的密度。使用30s的接触时间以10ul/min经由C末端his标签捕获多种his标记的FcgR(7ug/ml)，并在10mM NaPO4、130mM NaCl、0.05％p20(PBS-T)的pH 7.1的运行缓冲液中评价1.0uM抗体的结合。用于这些实验的FcgR包括CD64(FcgRI)、CD32a-H131(FcgRIIa-H131)、CD32a-R131(FcgRIIa-R131)、CD32b(FcgRIIb)、CD16a-V158(FcgRIIIa-V158)、CD16b-NA1(FcgRIIIb-NA1)和CD16B-NA2(FcgRIIIb-NA2)。BLI实验是在Fortebio Octet RED仪器(Pall，Fortebio)上于25℃下在10mM NaPO4、130mMNaCl、0.05％p20(PBS-T)(pH 7.1)中进行的。将抗体从未稀释的表达上清液中捕获在蛋白A包被的传感器上，然后结合1uM hCD32a-H131、hCD32a-R131、hCD32b、hCD16a-V158或0.1uMhCD64分析物。

首先，制备了与各种靶标结合的抗体，其含有包含取代S267E(SE)和S267E/L328F(SELF)以及突变P238D、P271G、H268D、A330R、G237D、E233D的各种组合(称为V4、V7、V8、V9和V12)的经修饰的IgG1 Fc结构域。通过Biacore SPR研究了这些抗体的结合，其中与IgG1f、IgG2.3(IgG2-C219S)和IgG4.1(IgG4-S228P)抗体以及已工程化为降低与所有FcgR的结合的IgG1.1f抗体进行比较。显示于图12中的结果展现了对于IgG1f、IgG2.3和IgG4.1以及突变IgG1抗体所预期的FcgR结合特性，包括对于SE和SELF而言增加的CD32a-H131、CD32a-R131和CD32b结合，以及CD32b相对于CD32a-H131和CD32a-R131而言V4、V7、V8、V9和V12突变体增加的选择性，图12。

使用下一组构建体来将效应子功能工程化为原本效应子功能为负的IgG2同种型。对于本研究，在IgG2.3恒定区或称为IgG2.3G1-AY的IgG2.3/IgG1f杂合体的情况下，引入了上述突变，表19。将抗体以上清液的形式小规模表达，并使用Fortebio Octet生物膜层干涉生物传感器技术测试与FcgR的结合。由于抗体以低浓度存在于上清液中，因此通过使用蛋白A包被的传感器从上清液捕获抗体，然后在溶液中结合FcgR分析物来进行实验。还包括纯化的上清液对照IgG1f(包括野生型IgG1、SE、P238D、V4和V12抗体)以供比较，并且这些对照抗体中的每一种均展现出预期的FcgR结合特性，图13。IgG2.3抗体也展现出预期的结合图谱，仅与CD32a-H131具有明显结合。然而，用于将S267E、L328F、P238D、P271G、H268D、A330R、G237D或E233D突变引入IgG2.3中的所有突变都无法概括相应工程化IgG1 mAb的FcgR亲和力，图13。相比之下，IgG2.3G1-AY构建体在保留IgG2.3的CH1和铰链区时能够完全保存野生型IgG1的FcgR结合特性。另外，含有S267E、L328F、P238D、P271G、H268D、A330R、G237D和E233D的所有IgG2.3G1-AY突变体都展现出与含有相同突变的IgG1形式mAb可比较的FcgR结合特性，图13。这证实了具有IgG2的CH1和铰链区(与野生型或突变体IgG1的效应子功能相组合)的抗体的成功工程化。

表19：工程化IgG2构建体

通过产生用IgG2.3G1-AY、IgG2.3G1-AY-S267E(IgG2.3G1-AY-V27)以及IgG2-B形式变体(IgG2.5G1-AY和IgG2.5G1-AY-V27)改变形式的其他抗体和含有IgG1和IgG2恒定结构域的不同组合的其他杂合体抗体，并使用Biacore SPR技术测试这些抗体与抗his Fab捕获的his标记的FcgR的结合进一步探索了这种工程化策略。与Octet上清液数据一致，SPR数据显示，IgG2.3G1-AY和IgG2.3G1-AY-V27抗体分别具有与IgG1f和IgG1f-S267E可比较的FcgR结合特性，但所述抗体含有A型IgG2抗体(IgG2.3)的CH1和铰链区(图14A和图14B以及表20)。使用IgG2.5G1-AY和IgG2.5G1-AY-V27抗体也获得了类似的数据，这证实了具有IgG1f或经修饰的IgG1f样效应子功能的B型IgG2抗体(含有C131S突变，称为IgG2.5)的成功工程化。具有IgG2.3G1-AY、IgG2.3G1-AY-V27、IgG2.5G1-AY或IgG2.5G1-AY-V27恒定区但可变区不同的其他几种抗体的数据显示，这种工程化策略不依赖于可变结构域而广泛适用于其他抗体(图14A和图14B以及表20)。展现出IgG1f样FcgR结合特性的其他构建体是IgG1-G2.3G1-AY和IgG1deltaTHT，而几种经修饰的恒定区构建体无法保留IgG1f样FcgR结合特性，所述几种经修饰的恒定区构建体包括IgG2.3G1-KH、IgG2.5G1-KH、IgG2.3plusTHT、IgG2.5plusTHT和IgG2.3plusGGG构建体(图14A和图14B以及表20)。

表20：1uM抗体与抗his Fab捕获的FcgR-his蛋白的结合的Rmax％值

这些数据共同显示，铰链区中保守CPPCPAP基序的C末端紧接的序列赋予FcgR介导的效应子功能，而抗体的CH1和铰链上部可以被IgG2或经修饰的IgG2序列替代，从而潜在地将IgG1和经修饰的IgG1的效应子功能与含有IgG2CH1和/或铰链区的抗体的优越内化或信号传导特性组合。

实施例9：在具有IgG2铰链和CH1结构域的抗体中，GITR激动剂Ab内化得到增强

为了诱导GITR表达，将细胞与20ng/ml抗CD3+1000ng/ml CD28在37℃下一起孵育72h。作为T细胞激活的替代方法，通过三阶段培养方案制备了大批激活的CD4

已经使用上述T细胞激活方法评价了三种不同的GITR抗体。它们是作为G1同种型和不能与Fc受体结合的惰性(IgG1.1)同种型以及具有IgG2铰链代替IgG1铰链的嵌合体的GITR.6抗体。

使用alexa淬灭测定形式在CD3刺激的CD4+T细胞中评估了GITR抗体诱导的内化。将新鲜获得的CD4阳性T细胞在如上所述条件下孵育以诱导GITR表达。刺激后，将细胞重悬于新鲜培养基中并铺板用于如下的内化测定。将细胞与抗体如上所述一起孵育，用温热的培养基洗涤，并在固定和淬灭之前在37℃下孵育指示的时间。将内化抗体测量为在时间零点处观察到的不可淬灭的小信号之上增加的荧光，然后针对最初与细胞结合的总荧光“未淬灭的对照”进行归一化。如图15所示，对于所测试的每种抗体，GITR连接导致30-60分钟之间快速达到内化最高峰，而发现对照抗体则维持定位至质膜。结果表明，IgG2铰链区增强GITR连接诱导的内化。

为了进一步剖析内化和相关动力学的详细机制，分析了抗体内吞作用以及向早期内体区室的递送。在此实验中，用未标记的抗体对细胞进行了脉冲追踪分析。固定后，对细胞进行透性化处理并针对早期内体标记物EEA1进行染色(细胞信号传导技术)，洗涤，然后用alexa fluor-488缀合的抗兔二抗(EEA1)和alexa fluor-647缀合的抗人抗体(GITR)进行检测。将板在具有60X水浸物镜的Opera共聚焦系统上成像。结果指示在膜结合的抗GITR抗体染色与细胞内EEA1信号之间明显的分离。加热培养物后，检测到一些抗体的聚集，其似乎与内体蛋白共定位。使用HCS Studio软件对内体共定位进行定量，并将结果绘制为共定位像素强度相对于总染色之比(图16)。GITR抗体和早期内体的共定位在30分钟时最为明显。在此测试时间点处，GITR.6.G2.G1f显示出比GITR.6.G1f抗体更高的共定位分数。共定位结果与使用上述alexa淬灭方法获得的观察结果相关，并支持如下模型，所述模型表明G2铰链对于诱导GITR内化比G1具有潜在的优势。

实施例10：在具有IgG2铰链和CH1结构域的抗体中，T细胞受体激活的CD4+和CD8+T细胞中的GITR激动剂Ab信号传导得到增强

为了进一步研究抗GITR激动剂抗体的机制，监测了涉及T细胞激活的几种信号传导途径，如NFkB和P38信号传导途径。

用板包被的0.4μg/ml抗CD3和0.4μg/ml抗CD28激活来自健康供体(M6576)的CD4+和CD8+T细胞。3天后，收集细胞并将其铺板在384孔成像板上以进行信号传导激活。细胞在板中静置2小时后，将它们用GITR抗体处理15分钟，并通过向测定板中添加甲醛达到最终10％来终止信号传导事件。然后，对细胞进行透性化处理并用磷-p65 NFKB抗体进行染色以进行信号传导检测。如图17所示，在CD4+和CD8+T细胞两者中，与GITR.6.G1f相比，GITR.6.G2和GITR.6.G2.G1f抗体具有更高的信号传导反应。尽管没有直接的证据将内化和信号传导途径激活联系起来，但有趣的是注意到，与GITR.6的IgG1相比，G2同种型似乎在抗体功能活性的两个方面都有所改善。

为了定量每种抗体的信号传导活性，计算了每种抗体的EC50和Emax两者，因为这两个参数对于捕获全部范围的信号传导事件至关重要。选择GITR.6.G2.G1f的反应水平为100％对照，并将所有其他抗体针对其进行归一化。如表21对于通过抗CD3和抗CD28抗体激活的CD4+和CD8+T细胞群体两者所示，就效力(EC50)和功效(Emax％)两者而言，GITR抗体具有一定的活性范围。尽管GITR.6.G2、GITR.6.G2.G1f和GITR.6.G1f显示出在10nM范围附近的类似的效力(EC50)，但不同同种型的功效(Emax)却大不相同，这表明G1抗体不能像G2或嵌合同种型一样有效地发信号。

表21.TCR激活的CD4+和CD8+T细胞中GITR HuMab NFKB信号传导活性的总结

为了进一步确认GITR.6.G2和GITR.6.G2.G1f与GITR.6.G1f相比的信号传导差异是仅限于NFkB信号传导还是对于其他信号传导事件也是如此，探索了P38MAPK信号传导读出。如图18所示，在CD4+细胞p38 MAPK激活测定中，与GITR.6.G1f抗体相比，GITR.6.G2和GITR.6.G2.G1f抗体具有更高的信号传导反应。因此，与G1同种型相比，GITR.6G2同种型的更好的信号传导活性不仅限于NFkB信号传导。

除了增强的激动剂活性和内化以外，还显示经修饰的重链恒定区可以(例如为刺激性受体的激动剂)赋予增强的ADCC，并为抗体提供新的活性。例如，发现将抗体(其与抑制性细胞表面分子结合并阻止所述细胞表面分子的抑制活性(拮抗剂))的恒定重链结构域改变为本文所述的经修饰的重链恒定区导致抗体失去了成为拮抗剂的能力，而赋予它激动剂活性(抑制活性的)。

实施例11：IgG2.3和IgG2.5构建体的二硫键的确认

通过比较未还原的和还原的Lys-C消化物确认了包含恒定结构域IgG2.3(A形式)、IgG2.3G1(A形式)和IgG2.5(B形式)的抗体中的二硫键结构是正确的。

用Lys-C消化抗体样品，所述Lys-C特异性地切割赖氨酸(K，Lys)残基的羧基末端侧上的肽键。使用Waters ACQUITY BEH C18柱(1.7μm，2.1x150mm，反相HPLC柱)分离消化物中的肽，并用紫外(UV)检测器在214nm处和Thermo LTQ质谱仪进行检测。

Lys-C酶促消化和二硫键还原：向含有100μg抗体样品的小瓶中添加120μL变性缓冲液，得到3.7M GuHCl、0.2M Tris溶液(pH 7.0)。将混合物在55℃下孵育30分钟。通过在上述溶液中添加1μl 50mM碘乙酰胺，然后在黑暗中于室温下孵育30分钟来进行蛋白质的烷基化。用80μL dH2O稀释烷基化的样品，并以1:10的酶与底物的比率添加Waco Lys-C。在黑暗中于室温下将抗体消化过夜。消化后，从Lys-C消化的样品移取100μL等分试样，并添加10μL的0.5M DTT。将此样品在室温下孵育1小时以还原二硫键。

获得的结果如下：

IgG2.3和IgG2.3G1抗体(A型)的二硫键结构：在重链的Fab区域内，Cys22(H)与Cys98(H)连接并且Cys151(H)与Cys207(H)连接。在重链的Fc区内，Cys265(H)与Cys325(H)连接并且Cys371(H)与Cys429(H)连接。在轻链的Fab区域内，Cys23(L)与Cys88(L)连接并且Cys134(L)与Cys194(L)连接。轻链的C末端Cys214(L)在Cys138(H)处与重链连接。重链的铰链区含有三个半胱氨酸残基Cys227(H)、Cys230(H)和Cys233(H)，它们提供三个链间二硫键。最可能的连接是Cys227(H)与Cys227(H)、Cys230(H)与Cys230(H)和Cys233(H)与Cys233(H)，这是IgG2A形式的正确理论二硫键布置。

IgG2.5抗体(B型)的二硫键结构：在重链的Fab区域内，Cys22(H)与Cys98(H)连接并且Cys151(H)与Cys207(H)连接。在重链的Fc区内，Cys264(H)与Cys324(H)连接并且Cys370(H)与Cys428(H)连接。在轻链的Fab区域内，Cys23(L)与Cys88(L)连接并且Cys134(L)与Cys194(L)连接。重链的铰链区含有四个半胱氨酸残基Cys226(H)、Cys227(H)、Cys230(H)和Cys233(H)。轻链的C末端Cys214(L)在铰链区中与重链的半胱氨酸残基连接，并且其余三个半胱氨酸残基提供三个链间二硫键。最可能的连接是Cys214(L)与Cys226(H)，然后是Cys227(H)与Cys227(H)、Cys230(H)与Cys230(H)和Cys233(H)与Cys233(H)，这是IgG2 B形式的正确理论二硫键布置。另外，利用使用离子阱质谱仪的电子转移解离(ETD)触发的串联质谱法来确认铰链区中的二硫键连接。

实施例12：IgG2 CH1和铰链中某些氨基酸残基与改善GITR对T细胞的激动作用的相关性

制备了具有表17中所示的重链恒定区的抗GITR抗体(GITR.6)并对其如实施例2中所述在IL-2产生测定中进行测试，但在所述测定中上清液是在40小时而不是48小时收获的。

显示于图20A至图20D中的结果与用具有与此实施例中所使用的那些相同的重链恒定区的抗CD73抗体获得的CD73内化结果(参见图10)基本一致。

实施例13：用P238K突变消除效应子功能

将抗体的可变区与如下IgG1 Fc融合，所述IgG1 Fc与野生型IgG1 Fc有单个氨基酸残基的差异：P238K(SEQ ID NO:198)。由于此单个突变，抗体展现出缺少效应子功能，对低亲和力Fc√R hCD32a-H131、hCD32a-R131、hCD32b、hCD16a-V158或hCD16b-NA2基本上无可检测的结合信号(参见实施例14中的数据)。另外，具有IgG1 P238K的抗体显示出对高亲和力Fc√R CD64的结合亲和力显著降低(参见实施例14中的数据)。相对于具有野生型IgG1恒定结构域的抗体，所述抗体与CD64的结合展现出更快的解离速率(解离常数)。

在抗体变体的情况下也证实了具有P238K突变的IgG1 Fc(SEQ ID NO:198)缺少效应子功能。

因此，具有单个突变(P238K)的人IgG1 Fc(例如，其中重链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO:198)可以用于不需要效应子功能的任何抗体中。

实施例14：用P238K和另外的突变消除效应子功能

产生了具有带有一个或多个突变的Fc的另外的抗体，以进一步降低效应子功能，优选ADCC和CDC两者。产生了突变体以进一步降低FcR结合，如表22所示。具体地，如上所示，P238K消除了除CD64以外的可检测的FcR结合，因此目标是将P238K与用于降低CD64结合的另外的突变组合。在IgG1同种型、IgG2.3和IgG2.5同种型以及IgG2.3G1同种型形式的情况下测试了突变。这些抗体中使用的Fc包含具有SEQ ID NO:234-245和247-262的氨基酸序列中的一个。

突变的位置显示于图21中。

使用Biacore 8K系统(GE Healthcare)通过表面等离子体共振研究了人FcγR与抗体的结合。对于这些研究，在10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂p20的运行缓冲液中，使用标准乙基(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学反应与乙醇胺封闭将蛋白A在CM5传感器芯片的流动池1-4上固定至约3000RU的密度。将纯化的抗体(10μg/mL)或表达上清液(稀释至约10ug/ml)捕获在蛋白A表面达到约1000-1200RU的密度，并在由10mM NaPO4、130mM NaCl、0.05％p20、缓冲液(PBS-T)组成的pH 7.1的运行缓冲液中于25℃下使用120s缔合时间和120s解离时间以20L/min的流速测试了FcγR分析物的结合。通过以下方式使用Biacore 8K评价软件分析了数据：假设100％分数活性并仅考虑没有糖基化的蛋白质质量，根据捕获抗体的水平，如下将测量的结合反应确定为每种抗体的理论最大结合反应的百分比(Rmax％)。为了比较不同分子的FcgR结合，通过将最大结合反应计算为理论最大结合反应的百分比(Rmax％)来分析SPR结合数据，所述计算总体如等式1所示：

具体地，使用以下等式计算Rmax％：

其中“分析物”是抗体并且“配体”是捕获的FcgR蛋白。此分析未考虑抗体或FcgR的糖基化的质量，并假设捕获的配体具有100％分数活性。

“Rmax％分析”对于评价“低亲和力”FcgR(例如，hCD32a-H131、hCD32a-R131、hCD32b、hCD16a-V158、hCD16a-F158、hCD16b-NA1和hCD16b-NA2)的结合特别有用，它们具有相对较快的缔合和解离速率以及接近或低于测试分析物浓度(1微摩尔(μM))的亲和力，因此在这些条件下通常不能实现表面的饱和。相比之下，与其他FcgR相比，“高亲和力”FcgRhCD64以更高的亲和力和更慢的解离动力学结合，特别是对于IgG1和IgG4；因此，这些同种型通常在微摩尔分析物浓度下确实使hCD64表面饱和，并且更难使用Rmax％区分亲和力。对于这些相互作用，可以通过比较传感图数据中的解离速率容易地观察到抗体之间的差异。

结果显示于表22中并且示例性传感图数据提供于图21A至图21L中。

如表22和图22所示，组合突变体展现出非常弱的FcR结合。向P238K同种型中添加L235突变使CD64结合降低至与IgG1.3f类似的水平。对于降低CD64结合，L235E优于L235A突变。向IgG2中添加P238K突变(IgG2.3-P238K)产生了完全惰性的同种型，这证实与任何FcR蛋白均无可检测的结合。在IgG1和IgG2.xG1形式的情况下，突变也显示出类似的趋势。降低c1q结合(CDC活性)并在一些构建体中添加的K322A突变对FcR结合的影响最小，因此未观察到K322A的太大影响。即使在存在交联的情况下，也观察到包含P238K的IgG1重链恒定区与低亲和力FcgR的结合降低。

所使用的构建体的氨基酸SEQ ID NO在下文列出，其中“第一”是指重链恒定区的主链，并且“第二”是指另外的氨基酸取代。“1.3”是指L234A、L235E和G237A。

构建体的CH2结构域的DSC热稳定性显示于下表中。结果显示，至少一些突变体保留了相当好的稳定性。

实施例15：用IgG1.3 Fc消除效应子功能

此实施例在共同提交和共同拥有的标题为“经修饰的IgG1 Fc结构域和与其的抗CD40结构域抗体融合物”(MODIFIED IgG1 Fc DOMAINS AND ANTI-CD40 DOMAIN ANTIBODYFUSIONS THEREWITH)的PCT申请的实施例2和实施例3中进行了描述。

此实施例显示具有IgG1.3 Fc的抗体或多肽基本上没有与CD16、CD32a、CD32b和CD64结合。也已在IgG1.3 Fc与抗TIM3抗体的可变结构域连接时观察到这一点(参见WO2018/013818)。IgG1.3是通过从“IgG1.1”Fc(“IgG1.1”是具有L234A、L235E、G237A、A330S和P331S取代的IgG1)去除A330S和P331S从而保留5个突变中的3个(即，L234A、L235E、G237A)而得到的。出人意料地发现，在IgG1.1 Fc中不存在A330S和P331S不会显著影响该Fc的惰性。下文是含有IgG1.1和IgG1.3(以及其他用于比较的其他Fc)的抗体和融合蛋白的示例性FcγR结合测量结果，比较了IgG1.1和IgG1.3在抗体情况下以及在非抗体蛋白的情况下的惰性。

此实施例中使用的材料和方法包括以下内容。

FcgR结合SPR：可以使用Biacore

一种方法测试纯化的抗体或dAb-Fc蛋白与His标记的FcgR蛋白(FcgR-His(“FcgR”与“FcγR”可互换使用))的结合，所述His标记的FcgR蛋白被捕获在抗His抗体的固定化Fab片段上。这些实验是在Biacore

为了定量地分析不同分子的结合反应和比较FcgR结合，可以通过将最大结合反应计算为理论最大结合反应的百分比(Rmax％)来分析SPR结合数据，所述计算总体如等式1所示：

具体地，使用以下等式计算Rmax％：

其中“分析物”是抗体或dAb-Fc并且“配体”是捕获的FcgR蛋白。此分析未考虑抗体、dAb-Fc或FcgR的糖基化的质量，并假设捕获的配体具有100％分数活性。

“Rmax％分析”对于评价“低亲和力”FcgR(例如，hCD32a-H131、hCD32a-R131、hCD32b、hCD16a-V158、hCD16a-F158、hCD16b-NA1和hCD16b-NA2)的结合特别有用，它们具有相对较快的缔合和解离速率以及接近或低于测试分析物浓度(1微摩尔(μM))的亲和力，因此在这些条件下通常不能实现表面的饱和。相比之下，与其他FcgR相比，“高亲和力”FcgRhCD64以更高的亲和力和更慢的解离动力学结合，特别是对于IgG1和IgG4；因此，这些同种型通常在微摩尔分析物浓度下确实使hCD64表面饱和，并且更难使用Rmax％区分亲和力。对于这些相互作用，可以通过比较传感图数据中的解离速率容易地观察到抗体之间的差异。

用于测试抗体或dAb-Fc蛋白与FcgR蛋白之间相互作用的第二种SPR测定是蛋白A捕获方法。这些实验也是在Biacore

蛋白A捕获测定还可以用于分析含有抗体或dAb-Fc分子的未纯化的上清液。对于此分析，可以从未稀释的上清液或从用运行缓冲液稀释的上清液捕获抗体或dAb-Fc蛋白。为了定量地分析不同分子的结合反应和比较FcgR结合，可以通过使用上述等式1计算Rmax％来分析SPR结合数据，其中分析物是纯化的FcgR蛋白，并且配体是捕获的抗体或dAb-Fc蛋白。

除了Rmax％分析以外，也可以通过测试FcgR分析物的滴定液与蛋白A捕获的抗体或dAb-Fc蛋白的结合来对结合的动力学和亲和力进行定量分析。例如，可以将3:1连续稀释液中的FcgR从10μM滴定降至0.15nM(hCD64)或1.5nM(所有其他FcgR)。可以使用Biacore

dAb-Fc：在此实施例中研究的dAb-Fc显示于表23中。在这些序列中，单个可变结构域3h56-269残基为氨基酸1-118(加下划线)。接头AST是加双下划线的。

表23

表23中显示的均以“EPK”开始的IgG1.1f和IgG1.3f的序列(即，SEQ ID NO:77和78中的序列)分别与SEQ ID NO:83和248中以EPK开始的序列相同。

对照mAb：对照单克隆抗体(1F4)也用类似的Fc结构域突变改变形式。各个链序列显示于表24中，所述链序列包括1F4重链中包含可变区和CH1区域的部分的序列(SEQ IDNO:268)。此序列是在重链序列(SEQ ID NO:269-275)中加下划线的。每种1F4 mAb变体的重链和轻链序列对都显示于表25中。

表24

表25

结果：产生了在Fc结构域中具有降低FcgR结合的突变的dAb-Fc分子。具体地，将抗CD40结构域抗体3h56-269用以下Fc结构域变体改变形式：IgG1.1f、IgG1.3f和IgG1-D265A。在3h-56-269-IgG1.1f(SEQ ID NO:77)、3h-56-269-IgG1.3f(SEQ ID NO:78)和3h-56-269-IgG1-D265A(SEQ ID NO:79)中的每一种中，氨基酸1-116是3h-56-269dAb，氨基酸117-119是接头，并且氨基酸120-351是Fc结构域。

确认了这些dAb-Fc融合蛋白中的每一种以及3h56-269-IgG4.1和3h56-269-CT中的每一种均以高亲和力与纯化的人CD40单体(内部产生的hCD40单体)结合，如通过Biacore

表26：dAb-Fc分子与人CD40结合的SPR数据。

*由UCOE-CHO细胞表达并纯化的3h-56-269-CT。

将dAb-Fc分子和各种对照单克隆1F4抗体的FcgR结合特性通过SPR来表征。第一种测定涉及1μM或10μM dAb-Fc或人IgG1f抗体对照(1F4-IgG1f)与抗His Fab捕获的FcgR-His表面的结合。这些数据显示于表27中。

表27：1μM或10μM dAb-Fc或1F4-IgG1f抗体对照与抗His Fab捕获的hFcgR-His蛋白结合的Rmax％数据。

在另一种测定中，测试了FcgR分析物(1μM或10μM)与蛋白A捕获的dAb-Fc表面的结合(数据显示于表28中)和与抗体表面的结合(数据显示于表29中)。

表28：1μM或10μM FcgR与蛋白A捕获的dAb-Fc蛋白结合的RMax％数据。

表29：1μM或10μM FcgR与蛋白A捕获的抗体结合的Rmax％数据。

根据这些实验中存在结合反应或缺少结合反应，选择具有最强结合反应的较高亲和力dAb-Fc/FcgR或Ab/FcgR相互作用的亚组使用分析物滴定液(与蛋白A捕获的抗体或dAb-Fc结合的FcgR分析物)进行动力学/亲和力表征。这些数据呈现于表30中。

表30：与蛋白A捕获的抗体或dAb-Fc结合的纯化FcgR分析物的KD值(以nM为单位)。

这些FcgR结合SPR数据共同显示，与经修饰的Fc变体IgG1-D265A、IgG1.1f、IgG1.3f或CT分子相比，IgG1f和IgG4.1同种型分子在所有FcgR中均具有显著更高的FcgR亲和力。在经修饰的Fc变体中，hCD64结合亲和力对于3h56-269-CT最强(KD＝4.6nM)，对于3h56-269-IgG1-D265A较弱(KD＝62nM)，并且对于3h56-269-IgG1.1f和3h56-269-IgG1.3f最弱，它们的亲和力太弱以致无法在测试条件下进行定量(KD>5μM，5μM是测试的最高分析物浓度的一半)。IgG1-D265A、IgG1.1f、IgG1.3f和CT变体的所有其他FcgR相互作用(hCD32a-H131、hCD32a-R131、hCD32b、hCD16a-V158、hCD16b-NA2)同样太弱以致无法获得可靠的KD值(K

通过DSC、icIEF和质谱法评估了含有IgG1.3的融合蛋白或抗体。下文描述了材料和方法。

差示扫描量热法：DSC实验是在MicroCal VP-Capillary DSC仪器(MalvernInstruments，英国马尔文)上在10mM NaPO

成像毛细管等电聚焦：icIEF实验是在ProteinSimple iCE3

质谱法：对于质谱(mass spectrometry/mass spec)分析，使用100mM DTT还原样品，并用肽:N-糖苷酶(FPNGaseF)进行N-去糖基化。所使用的液相色谱-质谱法(LC/MS)仪器是Waters

加速稳定性研究：加速稳定性研究是通过首先在4℃下在目标制剂缓冲液中广泛透析dAb-Fc分子进行的。使用

结果-差示扫描量热法：DSC可以用于测量蛋白质的热稳定性。最佳拟合Tm值总结于表31中。

表31：如通过DSC确定的dAb-Fc分子的热解链温度(Tm)值。

根据IgG Fc结构域的特征性热变性图谱，将3h56-269-IgG4.1的Fc CH3结构域转变指定为具有69.6℃的中点(Tm)值的转变；并且将各种IgG1分子的Fc CH3结构域指定为具有接近约82℃-83℃的Tm的转变。将dAb-Fc的dAb结构域和CH2结构域的变性指定为低于65℃的一种或多种转变，其关于热变性的开始(T

结果-成像毛细管等电聚焦(icIEF)：成像毛细管等电聚焦(icIEF)可以用于表征样品均匀性或不均匀性。产生均匀产品的能力是另一个重要的可开发性标准。因此，在发现和最优化新型蛋白质治疗剂的过程中，使用各种分析方法来表征和定量样品不均匀性，并选择最均匀的分子。

通过icIEF表征了dAb-Fc分子的电荷图谱。数据显示于图23中。3h56-269-IgG4.1(图23A)、3h56-269-IgG1.1f(图23E)和3h56-269-IgG1.3f(图23F)的icIEF图谱都相对简单，每个图谱均由面积占69％-86％并且在处于较低丰度的两个与四个电荷变体之间的明显主峰组成。此icIEF图谱类似于针对抗体获得的典型图谱。3h56-269-IgG1-D265A的主峰(图23D)的丰度有点低(49％)，其中具有至少六个可检测种类的酸性变体的水平相应较高。相比之下，3h56-269-CT的图谱(图23B)是高度不均匀的，该图谱由至少16个不同的种类组成并且没有清晰的主峰。在不同细胞系(UCOE-CHO)中表达的3h56-269-CT的icIEF图谱同样是不均匀的(图23C)，尽管电荷变体的分布与HEK293表达的材料明显不同。

结果-质谱法：IgG或含Fc蛋白的Fc结构域上的典型糖基化是G0F、G1F和一些G2F种类的混合物。发现其他糖型(如唾液酸化或非岩藻糖基化形式)的丰度通常要低得多或处于不可检测的水平。

为了表征dAb-Fc蛋白的糖基化图谱和比较dAb-Fc蛋白与具有类似Fc突变的对照抗体，进行了质谱实验。数据显示于表32中。

表32：如通过质谱法确定的dAb-Fc和抗体分子中的可检测糖型。

对照抗体1F4-IgG1f和1F4-IgG1.3f以及dAb-Fc抗体3h56-269-IgG4.1、3h56-269-IgG1.1f、3h56-269-IgG1.3f的质谱数据显示，这些蛋白质由G0F、G1F糖型的典型混合物组成，其中G2F种类的丰度较低。

因此，IgG1.3(重链恒定区和Fc)基本上没有与CD16、CD32a、CD32b和CD64结合，并具有良好的生物物理学特性。也已在IgG1.3 Fc与抗TIM3抗体的可变结构域连接时观察到这一点(参见WO 2018/013818)。显示包含IgG1.3的抗TIM3抗体具有良好的热稳定性(Tml＝68.1℃，Tm2＝80.3℃，Tm3＝82.6℃)和热可逆性(在74℃下为95.6％，在80℃下为25.5％)，这表明所述分子在热应力下保留其结构完整性并在应力释放时具有稳健的重折叠特性。

实施例16：经修饰的重链恒定区的另外的特征

测试了重链恒定结构域变体IgG1.3f、IgG1f-P238K(PK)、IgG1f-L235E-P238K(LE-PK)、IgG1f--L235E-P238K-K322A(LE-PK-KA)、IgG1.3-P238K(IgG1.3-PK)、IgG1.3-P238K-K322A(IgG1.3-PK-KA)和IgG2-P238K(IgG2-PK)的FcR结合以及ADCC、ADCP和CDC功能。

结果表明，关于FcR结合，P238K敲除了所有低亲和力FcgR结合，而hIgG1.3f保留了一些与低亲和力FcgR的弱结合。向P238K中添加L235E突变将CD64结合降低了1000倍。K322A对FcgR结合没有影响，因为所述突变是降低C1q结合。向PK或PK-KA中添加两个突变L234A+G237A进一步降低了CD64结合。

关于效应子功能，结果表明IgG1.3f、IgG1f-P238K(PK)、IgG1f-L235E-P238K(LE-PK)、IgG1f--L235E-P238K-K322A(LE-PK-KA)、IgG1.3-P238K(IgG1.3-PK)、IgG1.3-P238K-K322A(IgG1.3-PK-KA)和IgG2-P238K(IgG2-PK)缺少ADCC、ADCP和CDC功能。

另外，所有这些同种型都展现出可接受的分析/生物物理学特性，如表33所示。

表33：经修饰的重链恒定区的特征

结果表明，所有同种型都展现出可接受的分析/生物物理学特性，并且Tm1(CH2结构域)是分析/生物物理学特性最清楚的区分物。

序列表34

仅仅使用常规实验，本领域技术人员便将认识到或能够确定本文所述的特定实施方案的许多等同物。此类等同物旨在被以下权利要求所涵盖。