一种温肾补阳的药物组合物

技术领域

本发明具体涉及一种温肾补阳的药物组合物。

背景技术

子宫和卵巢都属于女性内生殖器官。子宫的功能是内膜周期性增厚和脱落形成月经，在妊娠期孕育胚胎和胎儿；卵巢的主要功能是产生和排出卵细胞，分泌性激素，以促进女性性征的发育并维持。子宫可能会出现宫颈炎症、宫颈肿瘤、子宫内膜异位、子宫腺肌病及子宫发育异常等疾病；卵巢可能会出现卵巢囊肿或者卵巢早衰，不管是子宫还是卵巢相关疾病都会引起不孕的发生。

冲任虚寒状态，通过女性生殖轴肾-天癸-冲任-胞宫最终影响到女性生育功能。正如《神农本草经》中记载：“女子风寒在子宫，绝孕十年无子。”《诸病源候论》也有“子脏冷无子”的论述。《圣济总录》有记载：“妇人所以无子，由充任不足，肾气虚寒故也。”张景岳《妇人规.子嗣类》提出了：“冲任不充则胎孕不受。”都说明了冲任虚寒与生殖功能降低的密切关系。

目前还没有通过温肾补阳法治疗女性生殖功能障碍的研究，更没有用于冲任虚寒导致的生殖功能降低的温肾补阳组合物。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种温肾补阳的药物组合物，它是由下述重量配比的原料药制备而成：

淫羊藿7～13份、骨碎补7～13份、肉苁蓉7～13份。

进一步地，它是由下述重量配比的原料药制备而成：

淫羊藿10份、骨碎补10份、肉苁蓉10份。

进一步地，它是由原料药的药粉、或原料药的水或有机溶剂提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

进一步地，所述制剂为口服制剂。

更进一步地，所述口服制剂为颗粒剂、散剂、丸剂或溶液剂。

本发明还提供了前述药物组合物的制备方法，它包括以下步骤：

(1)按照前述配比称取原料药；

(2)原料药研为粉末，或原料药的水或有机溶剂提取液，加入药学上常用的辅料或辅助性成分，即得。

本发明最后提供了一种前述的药物组合物在制备温肾补阳的药物中的用途。

进一步地：所述药物是改善子宫微环境的药物。

更进一步地，所述药物是提高血清性激素、子宫内膜厚度、腺体功能、雌孕激素受体表达、子宫微血管密度、和/或子宫局部面积因子的药物。

进一步地，所述药物是治疗卵巢功能低下的药物。

更进一步地，所述药物是上调卵子数量，降低异常卵泡率、改善卵巢血供，改善阳虚状态和/或增强卵巢储备的药物。

本发明药物组合物中，淫羊藿、肉苁蓉补肾壮阳，暖宫助孕，骨碎补补肾阳，益虚损，全方配伍温肾补阳，阴中有阳，阳得阴助，水火既济，共同发挥温肾益天癸的功效。

经试验证明：本发明温肾补阳复方可从血清性激素、子宫内膜厚度及腺体功能、雌孕激素受体表达、子宫微血管密度、子宫局部面积因子等多个方面改善子宫微环境，还能改善卵子功能，增强卵巢储备，促进卵母细胞成熟，并抑制细胞过度凋亡，减少异常卵子及闭锁卵泡发生，对冲任虚损生殖障碍有积极的改善作用，改变妊娠结局。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1对小鼠子宫MVD及RAV％表达的影响12h

图2对小鼠子宫MVD及RAV％表达的影响72h

图3对小鼠子宫组织学指标的影响12h

图4对小鼠子宫组织学指标的影响72h

图5 COH后16h小鼠输卵管采集MII期卵、异常卵(×100)

图6 JC-1荧光染色后激光共聚焦下的卵母细胞(×400)

图7小鼠卵泡期卵巢HE染色情况(×200)

具体实施方式

实施例1、本发明药物的制备

配方：淫羊藿10g、骨碎补10g、肉苁蓉10g。

制备方法：取上述各药味，加水煎煮，共煎煮2次，每次加入原料药材量6倍v/w,ml/g的水，合并两次煎煮液，浓缩至稠浸膏(相对密度约1.2)，药渣干燥后进行细粉，然后与浸膏混匀，喷雾干燥成颗粒。

实施例2、本发明药物的制备

配方：淫羊藿7g、骨碎补7g、肉苁蓉7g。

制备方法：取上述各药味，加水煎煮，共煎煮2次，每次加入原料药材量8倍v/w,ml/g的水，合并两次煎煮液，浓缩至稠浸膏(相对密度约1.35)，药渣干燥后进行细粉，然后与浸膏混匀，喷雾干燥成颗粒。

实施例3、本发明药物的制备

配方：淫羊藿13g、骨碎补13g、肉苁蓉13g。

制备方法：取上述各药味，加水煎煮，共煎煮2次，每次加入原料药材量7倍v/w,ml/g的水，合并两次煎煮液，浓缩至稠浸膏(相对密度约1.3)，药渣干燥后进行细粉，然后与浸膏混匀，喷雾干燥成颗粒。

以下通过试验例来说明本发明的有益效果。

试验例1本发明对子宫的作用

1.材料

1.1实验动物

SPF级雌性昆明小鼠72只，6周龄，动物批准号为scxk(川2020-030)，饲养方法同前。雄鼠40只，10周龄。饲养环境清洁通风，保持光照12小时/天，室内温度恒定，保持在25±1℃，小鼠自由饮水进食，保持所有小鼠处于同样的饲养环境。小鼠的饲养及处死均遵循了《实验动物管理条例》、《药物非临床研究质量管理规范》、《关于善待实验动物的指导性意见》的要求。

1.2实验药物及试剂

羟基脲片，齐鲁制药有限公司；孕马血清促性腺激素(PMSG)，北京索莱宝科技有限公司；注射用绒促性素(HCG)，丽珠集团丽珠制药厂；MOUSE E2、P、AMH、IgA、IgG、IgM、C3、C4、NK、CD4+、CD8+、ATP、NO、cAMP、cGMP ELISA KIT，上海联麦生物工程有限公司；无水乙醇，成都市科隆化学品有限公司；95％乙醇，成都市科隆化学品有限公司；二甲苯，成都市科隆化学品有限公司；多聚甲醛，成都市科隆化学品有限公司；中性环保速干胶，南昌雨露实验器材有限公司；组化二抗试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司；Anti-estrogen receptoralpha，Abcam；Anti-progesterone receptor antibody，Abcam；Envision

1.3实验仪器与设备

恒温干燥箱；恒温水浴锅；THERMO FISHER微量移液器；THERMO FISHER酶标仪；Leica石蜡切片机；OLMPUS光学显微镜；Leica显微成像系统；OLMPUS成像系统。

2.方法

2.1分组

小鼠适应性饲养1周，挑选周期处于动情间期的雌性小鼠，按照随机数字表的方式，将小鼠随机分为模型组、温肾补阳组，每组18只。

2.2造模

各组按照4℃羟基脲0.4g/kg/d的剂量进行灌胃，每日1次，连续给药3周。

2.3中药干预

温肾补阳组将实施例1制备的中药免煎颗粒配置为混悬液，每日每只小鼠给药剂量为0.9g/kg/d。

模型组予等量温水灌胃。

2.4超促排卵

采用PMSG+HCG的方式进行超促排卵，注射PMSG 5IU48h后腹腔注射HCG 5IU。

2.5合笼

注射HCG后按照雌鼠：雄鼠2：1的比例进行合笼。合笼后次日查看雌性小鼠阴道，见阴栓说明合笼成功。计数子代及存活情况。

2.6标本留取

小鼠分别于注射HCG后12小时、72小时后解剖。麻醉后采用目内眦取血法取血，离心后留取血清。留取子宫标本，经4％多聚甲醛液固定备查。

2.7检测指标

2.7.1血清ELISA检测

采用酶联免疫法测定小鼠血清性激素，使用上海联麦生物工程有限公司的MOUSEELISA E2、P、AMH、IgA、IgM、IgG、C3、C4试剂盒分别进行测定。操作步骤按照各试剂盒的说明书进行。

2.7.2子宫组织学检测

4％多聚甲醛固定的组织样本，包埋组织块于石蜡中，切片、烘烤。切片经二甲苯脱蜡后，流水洗涤20min，用苏木素染色30min，流水洗涤20min，盐酸酒精分化，伊红染色5min，最后梯度酒精脱水，二甲苯透明后用树脂胶封片。显微成像系统对组织样品拍照，测量子宫内膜厚度及腺体面积、腺体最大直径。

2.7.3子宫免疫组化检测

免疫组化法测定子宫雌孕激素受体、CD138、子宫微血管密度(MVD)、血管面积占比(RVA％)表达。4％多聚甲醛固定的组织样本，包埋组织块于石蜡中。采用Leica RM2235切片机将组织切片，60℃烘烤切片至少2h。Envision二步法染色，脱水、封片。显微镜下观察雌孕激素受体阳性表达情况，并采图。

2.8统计分析

实验数据使用SPSS21进行统计分析。计量资料符合正态分布且方差齐性的数据，多组数据比较采用单因素方差分析进行；非正态分布或方差不齐采用秩和检验。p＜0.05为数据具有统计学差异，p＜0.01为数据有显著统计学差异。

3.结果

3.1本发明温肾补阳方剂对小鼠血清生殖激素的影响

对小鼠血清生殖激素的影响见表1。

表1本发明温肾补阳方剂对小鼠血清生殖激素的影响

注：与模型组比较，

从结果可见：72h孕酮水平，抗苗勒氏激素水平，温肾补阳组高于模型组(p＜0.05)。

3.2本发明温肾补阳方剂对小鼠血清免疫指标影响

小鼠血清免疫指标影响见表2。

表2本发明温肾补阳方剂对小鼠血清免疫指标的影响

从结果可见：本发明温肾补阳组C4高于模型组(p＜0.05)。

3.3本发明温肾补阳方剂对小鼠子宫局部循环的影响

3.3.1子宫微血管密度(MVD)及血管面积占比(RVA％)

对小鼠子宫微血管密度(MVD)及血管面积占比(RVA％)的影响，结果见表3及图1～图2。

表3本发明温肾补阳方剂对小鼠子宫微血管密度(MVD)及血管面积占比(RVA％)的影响

注：与模型组比较，

从结果可见：72h子宫微血管密度，温肾补阳组显著高于模型组(p＜0.01)。

3.3.2子宫组织学指标

对小鼠子宫组织学指标的影响见图3～图4，子宫内膜厚度结果见表4。

表4本发明温肾补阳方剂对小鼠子宫内膜厚度

注：与自然周期组比较，*p＜0.05，**p＜0.01

从结果可见：温肾补阳组12h子宫内膜显著高于模型组(p＜0.01)。

4、结论

实验结果表明，对于冲任虚损生殖障碍模型，从子宫局部微循环方面，本发明温肾补阳方增加了子宫内膜厚度、子宫微血管密度，从生殖激素方面，本发明提高了72h孕酮水平，抗苗勒氏激素水平，从免疫功能方面，本发明温肾补阳方升高了免疫C4，提高了免疫力。

试验例2本发明对卵巢的作用

1材料

1.1实验动物

SPF级昆明雌性小鼠，4～6周龄，体质量(20±2)g，144只。SPF级昆明雄性小鼠，6-8周龄，体质量(30±3)g，20只。均由成都达硕实验动物中心提供，生产许可证号为：SCXK(川)2020-030。饲养于屏障环境，采用分笼饲养，每笼6只小鼠，自由饮食、饮水，保持温度20～26℃，相对湿度40％～70％，昼夜光照。

1.2实验药物与配制

羟基脲，规格：500mg/片，生产厂家：齐鲁制药有限公司。将2g羟基脲片研成粉末，用50mL冰生理盐水配成混悬液，并放置4℃冰箱内保存。孕马血清促性腺激素(PregnantMare Serum Gonadotropin，PMSG)，规格：1000iu/支，生产厂家：北京索莱宝科技有限公司，溶于20mL 0.9％生理盐水中，放入-20℃冰箱中储存。人绒毛膜促性腺激素(chorionicgonadotropin，HCG)，规格：2000iu/支，生产厂家：丽珠集团丽珠制药厂，溶于20mL 0.9％生理盐水中，放入-20℃冰箱中储存。本发明温肾补阳免煎剂，按实施例1制备，一剂温肾补阳复方中药生药相当于免煎颗粒3.0g，溶于0.9％氯化钠溶液中配成0.06g/mL混悬液；生产厂家均为四川新绿色药业科技发展股份有限公司。

1.3实验试剂

透明质酸酶，(北京索莱宝科技有限公司，货号H3884)；Quinn’s缓冲培养液ART-1023，(美国SAGE公司，批号：19230140)；线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)，(中国上海碧云天生物有限公司，货号：C2006)；RNA提取液(Trizol，美国Invitrogen公司，货号：15596018)；三氯甲烷，(国药集团化学试剂有限公司，货号：10006818)；异丙醇，(国药集团化学试剂有限公司，货号：80109218)；无水乙醇，(国药集团化学试剂有限公司，货号：10009218)；HyPure

1.4实验仪器

洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司，SW-CK-2FD；台式冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司，Allegra X-15R；实时荧光定量PCR系统，美国BioRad公司，CFX96；组织匀浆机，北京鼎昊源科技有限公司，V4800；激光共聚焦培养皿，中国无锡耐思生命科技股份有限公司，80102；激光共聚焦显微镜，德国ZEISS公司，LSM710；解剖显微镜，日本Olympus公司，CK-40；CO

2方法

2.1分组与造模

将所有小鼠适应性饲养一周，观察其阴道涂片，将动情周期规律的48只4周龄小鼠纳入实验。运用随机数字表法将小鼠分为自然周期组、促排对照组、冲任虚寒模型组、温肾补阳颗粒组。自然周期组、促排对照组每日上午9：00灌胃15mL/kg生理盐水，冲任虚寒模型组、温肾补阳颗粒组小鼠于同时按体质量灌胃400mg/kg浓度的冰羟基脲混悬液，灌胃期间监测小鼠体质量、肛温以及动情周期改变，持续灌胃21天后出现体重下降明显，肛温下降，动情周期紊乱，提示造模成功。

2.2药物干预

造模结束后各组分别予对应中药进行干预，每日一次，用药剂量按照《人和动物间按体表面积折算的等效剂量比率表》(成人体质量按60kg计，小鼠平均体重按20g计)换算后20倍得出。温肾补阳颗粒组每日灌服温肾补阳颗粒0.9g/kg，自然周期组、促排对照组以及冲任虚寒模型组均灌服等容量生理盐水。各组小鼠均灌胃15天。

2.3合笼进行

干预结束后，除自然周期组，余各组小鼠下午16：00腹腔注射5IU PMSG，48h后即第三天下午16：00腹腔注射5IU HCG。各组超促排卵完成后每组随机选取6只雌鼠，以雌鼠与雄鼠1:1～2:1比例进行合笼，第二日晨观察各笼小鼠阴栓情况，如发现阴栓即代表受孕，受孕小鼠另归置于他笼进行饲养并进行标记，待子代小鼠出生后进行计数。

2.4标本收集与处理

各组超促排完成后随机选取6只雌鼠，于超促排卵后12h(自然周期组通过阴道涂片选取动情前期小鼠)腹腔注射4％水合氯醛麻醉，通过眼眶静脉丛采血法，将采集血收集到2mL离心管中，4℃冰箱静置过夜后，3000rpm离心10min，分离得到血清。脱颈椎法牺牲各组小鼠，摘取双侧卵巢，将一侧卵巢放在4％多聚甲醛固定液中，一侧卵巢组织置于冻存管内，放入液氮中备存待检。

2.5 Elisa法检测血清ATP、NO、cAMP、cGMP含有量

将各组已收集血清根据试剂盒说明书步骤，检测其中ATP、NO、cAMP、cGMP含有量。

2.6卵母细胞获取及计数

除自然周期组，余各组随机选取6只小鼠完成超促排卵后16h(自然周期组通过阴道涂片选取动情前期小鼠，16h后)进行水合氯醛麻醉，摘取双侧输卵管放到35mm培养皿中，体视显微镜下戳破输卵管壶腹部，并逐渐撕扯输卵管，将所有卵丘释放出来,将卵丘放到含有透明质酸酶的培养皿中，分离颗粒细胞，将分离出颗粒细胞的卵母细胞再次放入含有M2培养液的培养皿内，显微镜下观察卵母细胞分期并进行计数，各期卵母细胞特征及鉴定：

GV期：胞浆内可见生发泡；

MI期：生发泡破裂，第一极体尚未排出；

MII期：胞质均匀、卵周隙小，第一极体排出且表面光滑、透明袋清晰均匀；

异常卵：卵子形状不规则、胞质内出现折光区或大空泡、透明带增厚或凸起。

2.7激光共聚焦下检测卵母细胞线粒体膜电位(△Ψm)

分离卵母细胞方法同2.6，将卵母细胞放入含有JC-1工作液的培养皿内，于37℃孵育20分钟。孵育结束，用JC-1缓冲液进行洗涤2次，然后将卵母细胞转移共聚焦培养皿内，放置激光共聚焦显微镜下进行观察、拍照。图像运用Zen blue lite 2.3进行分析，测量卵母细胞红、绿荧光数值。

2.8 HE染色法观察卵巢组织

将卵巢固定完成后包经过冲洗、脱水、透明后包埋于石蜡中，采用Leica RM2235切片机将组织切成5μm薄片，在温水中将组织展平后捞在载玻片上进行烘烤，经二甲苯脱蜡后用苏木素、伊红进行染色，并用树脂胶封片，最后运用显微成像系统对组织样品拍照，采用Image Pro Plus 6.0对图片中卵巢的各级卵泡和黄体计数。

2.9统计学处理方法

各组数值均用均数和标准差表示，

3结果

3.1温肾补阳方对小鼠合笼情况的影响

由表5可见，产仔数组间对比，与自然周期、促排对照组比较，冲任虚寒模型组显著减少(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾补阳颗粒组增加显著(P<0.05)；活胎数组间对比，与自然周期组、促排对照组比较，冲任虚寒模型组显著减少(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾补阳颗粒组有所增加，差异显著(P<0.01)；死胎数各组间没有统计学差异。

表5各组小鼠合笼子代数量结果(

注：与自然周期组比较，

3.2温肾补阳方对小鼠血清ATP、NO、cAMP、cGMP表达的影响

由表6可见，与自然周期组比较，冲任虚寒模型组ATP表达含量较其减少(P<0.05)，与促排对照组比较，冲任虚寒模型组与其无意义。冲任虚寒模型组比较温肾补阳颗粒组ATP表达含量均较其增多(P<0.05，P<0.01)。与自然周期组、促排对照组比较，冲任虚寒模型组CAMP表达水平显著下降(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾补阳颗粒组较其显著增加(P<0.01)。与自然周期组比较，冲任虚寒模型组CGMP表达含量没有差异，与促排对照组比较，冲任虚寒模型组CGMP表达水平增加明显(p<0.05)，与冲任虚寒模型组比较，温肾补阳颗粒组表达组表达水平均显著下降(P<0.01)。

表6各组小鼠ATP、NO、CAMP、CGMP表达(

注：与自然周期组比较，

3.3温肾补阳方对小鼠获卵数的影响

由表7可见，总卵数组间对比，与自然周期组比较，冲任虚寒模型组较其无差异，与促排对照组比较，冲任虚寒模型组较其显著减少(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾补阳颗粒组增多明显(P<0.01)。MII卵数组间对比，与自然周期组比较，冲任虚寒模型组较其无差异，与促排对照组比较，冲任虚寒模型组较其显著减少(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾补阳颗粒组较其明显增多(P<0.01，P<0.05)。异常卵数组间对比，与自然周期组比较，冲任虚寒模型组显著增多，与促排对照组比较，冲任虚寒模型组较其无差异，与冲任虚寒模型组比较，温肾补阳颗粒组较其无差异。MII卵率组间对比，与自然周期、促排对照组比较，冲任虚寒模型组均较其显著降低(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾补阳颗粒组较其显著增加(P<0.01，P<0.05)。异常卵率比较，与自然周期组比较，冲任虚寒模型组较其无差异，与促排对照组比较，冲任虚寒模型组较其显著增多(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾补阳颗粒组较其显著下降(P<0.01)。获卵情况见图5。

表7各组小鼠获卵分期及计数(

注：与自然周期组比较，

3.4温肾补阳方对小鼠卵母细胞△Ψm的影响

由表8可见，各组小鼠卵母细胞△Ψm对比，与自然周期、促排对照组比较，冲任虚寒模型组较其显著下降(P<0.01，P<0.05)，与冲任虚寒模型组比较，温肾补阳颗粒组较其升高明显(P<0.05)。(染色情况见图6)。

表8各组小鼠△Ψm(

注：与自然周期组比较，

3.5温肾补阳方对小鼠卵巢内各级卵泡的影响

由表9可见，原始卵泡数组间对比，与自然周期、促排对照组比较，冲任虚寒模型组数目显著减少(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾补阳颗粒组较其显著增加(P<0.01)。初级卵泡数组间对比，与自然周期组、促排对照组比较，冲任虚寒模型组显著增加(P<0.05)，与冲任虚寒模型组比较，温肾补阳颗粒组较其无差异。次级卵泡数组间对比，与自然周期、促排对照组比较，冲任虚寒模型组显著增加(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾补阳颗粒组较其无差异。成熟卵泡数组间对比，与自然周期、促排对照组比较，冲任虚寒模型组均较其减少，但与自然周期组无差异，与促排对照组差异显著(P<0.05)，与冲任虚寒模型组比较，温肾补阳颗粒组较其显著增加(P<0.01)。闭锁卵泡数组间对比，与自然周期组、促排对照组比较，冲任虚寒模型组较其显著增加(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾补阳颗粒组较其显著减少(P<0.01)。黄体数组间对比，与自然周期组、促排对照组组间对比，冲任虚寒模型组较其显著下降(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾补阳颗粒组黄体数目较其增加但无统计学差异。(染色情况见图7)。

表9各组小鼠卵巢各级卵泡及黄体数目(

注：与自然周期组比较，

4结论

由本实验结果可知，肾阳虚不足，温煦、推动功能减弱，无以温养冲任，导致卵子功能减退、卵巢储备功能降低，生殖能力低下，温肾助阳方擅于提高能量代谢缓解阳虚表征，纠正线粒体动力学状态，提升卵母细胞质量，增强卵巢储备，改变妊娠结局。

综上，本发明依据中医理论，将冰水与羟基脲复合进行灌胃，建立了冲任虚损生殖障碍的动物模型，随后用温肾补阳复方干预冰羟基脲建立的冲任虚损小鼠，观察其对生殖功能的影响，并从线粒体动力学及能量代谢角度阐述其效用机制。药物干预后发现，本发明组合物增加了子宫内膜厚度、子宫微血管密度，提高了72h孕酮水平，抗苗勒氏激素水平，显著提升ATP水平，获卵数及优卵率明显增加，说明本发明温肾补阳复方能改善子宫状态和卵母细胞质量。