由醋栗、草莓、覆盆子和葡萄酒工业的果渣生产香气物质的生物技术

技术领域

本发明涉及香气物质领域。更具体地，本发明涉及一种制备本文描述的香气物质或香气物质混合物的方法。本发明还涉及本文描述的转化培养基和/或本文描述的生物催化剂用于生产香气物质或香气物质混合物的用途，该转化培养基包含以醋栗科、蔷薇科或葡萄科的植物部分为基础的成分。此外，本发明涉及包含本文描述的化合物的组合物以及其在本文描述的营养、美容、保健或可食用的制剂中的用途。

背景技术

天然香气物质通常是从植物中提取而获得。本文可将芳樟醇作为实施例。芳樟醇是属于萜烯族的一元醇。该化合物无色、易燃并且具有独特的芳香气味。芳樟醇周知且丰富的来源是罗勒、香薄荷、芫荽、牛至和百里香等草药。芳樟醇可用于各种应用。例如，由于其香化和/或除臭功能，该化合物在芳香油中用作芳香剂，或在香料产业中用作佛手柑的替代品。此外，发现该化合物可以是葡萄酒中的一种香气物质。

为了满足对芳樟醇的强烈且稳步增长的需求，现在市场供应中有相当一部分是化学合成的。虽然化学合成提供了生产大量香味物质的可能性，但许多合成不是环境兼容的。特别地，正常条件下的反应速率几乎可以忽略不计，这意味着只能通过应用高温高压等严苛的合成条件来实现可接受的产率。此外，化学合成经常使用重金属催化剂、可燃气体和有机溶剂，使用它们充满了周知的缺陷。由于这个原因，对芳樟醇的替代生产工艺的需求以及对于其他香气活性化合物的需求日渐增多，这些化合物至少部分地克服了已知方法的缺陷。

这可通过生物技术工艺而改进，该生物技术工艺以使用微生物或它们的酶将天然前体生物转化为期望的香气物质为基础(Berger,R.G.,Flavors and Fragrances:Chemistry,Bioprocessing and Sustainability,(2007),Berlin Heidelberg,SpringerVerlag)。农业副产品可能在生物技术生产芳樟醇和其他香气物质方面具有巨大潜力，其中一些农业副产品富含膳食纤维和次级代谢产物作为潜在的香气前体。

发明内容

因此，本发明的主要目的是改进上述缺陷并且提供一种制备芳樟醇等香气物质的工艺。特别地，提供一种比已知的化学合成更环保的工艺受到关注。

WO2013/034613公开了一种生产饮料或饮料主剂的方法，其中培养基在至少一种好氧发酵工艺中发酵，并且该培养基由来自至少一种担子菌的菌丝发酵。

根据本发明，通过一种生产香气物质或香气物质混合物的方法来解决该主要目的，该方法包括以下步骤:

准备转化培养基(本文中也部分地称为菌种培养基或基质)，该转化培养基包含一种基于醋栗科(茶藨子科)、蔷薇科(科蔷薇科)和/或葡萄科(山葡萄科)的植物部分的成分；将所述转化培养基与生物催化剂接触；借助于该生物催化剂将所述以醋栗科、蔷薇科或葡萄科的植物部分为基础的成分转化从而形成香气物质或香气物质混合物；以及可选地

回收所述香气物质或香气物质混合物。

通过下述说明、添加的实施例、附图以及特别是所附的权利要求书，本发明其它的目的、方面和优选的实施方式将会显而易见。。

附图说明

图1:在根据本发明的菌种培养基(转化培养基)上进行的转化与使用真菌茯苓作为实施例在标准菌种培养基上进行的转化的对比图。示出了在不同菌种媒介上11天后茯苓的出水菌种照片。A:麦芽提取物琼脂(MEA)，B:MEA+0.624％L-天冬氨酸单钠，C:3％果渣，D:3％果渣+0.624％L-天冬氨酸单钠。

图2:在根据本发明的菌种培养基上进行的转化与使用真菌茯苓作为实施例在标准菌种培养基进行的转化的对比图。示出的为茯苓的出水菌种在四种不同媒介上的生长曲线:MEA(□)；MEA+Asp()；3TT(x)；3TT+Asp(○)。使用的缩写为:3TT:3％Titania变种的果渣，Asp:0.624％L-天冬氨酸单钠。

图3:在根据本发明的菌种培养基上进行的转化与使用真菌茯苓作为实施例在标准菌种培养基上进行的转化的对比图。示出的为茯苓在MEA(□)；MEA+Asp( )；3TT(x)；3TT+Asp(○)的出水培养期间媒介的pH值的进程。使用的缩写如前所述。

图4:使用茯苓在MEA上进行发酵作为实施例，在不根据本发明的菌种培养基上进行转化的GC-MS色谱图(不分流测量)。示出的为进行8天的培养后所取样品的色谱图，该色谱图表明物质产生。

图5:使用茯苓在3％红醋栗果渣、0.624％L-天冬氨酸单钠、3％琼脂-琼脂上进行出水发酵作为实施例，在根据本发明的菌种培养基上进行转化的GC-MS色谱图。示出的为在培养11天后所取样品的色谱图；上面:以分流比50:1测量，下面不分流，其中MS检测器在13.5分钟至13.7分钟(灰色背景)之间关闭。

图6:使用茯苓在3％红醋栗果渣和0.624％L-天冬氨酸单钠上进行出水发酵作为实施例，在根据本发明的菌种培养基上进行转化的GC色谱图，该GC色谱图具有ODP痕迹并且表明物质产生。示出的为在培养10天后所取样品的色谱图；在13.2分钟和13.7分钟之间，MS检测器停止工作(灰色背景)。带有数字的黑带通常表示根据以下概述预期的气味。

1 绿色 13 花，柑橘，清香

2 干酪 14 绿色

3 溶剂 15 略甜，花香

4 略甜，绿色 16 绿色，清香，柑橘

5 真菌，香草 17 绿色，冷杉

6 绿色，略甜，花香 18 冷杉，花香

7 真菌 19 溶剂，略甜

8 绿色，花香 20 不清晰，难闻，油炸

9 不清晰，绿色，冷杉，花 21 焦糖香

10 不清晰 22 果香

11 不清晰，绿色，花香 23 不清晰，绿色

12 杏仁蛋白糖果，略甜 24 绿色

图7:茯苓在不同媒介上培养期间所选择的香气的热图；14天的培养期间的相对变化。以m/z(苯甲醛)＝106，m/z(芳樟醇)＝93，m/z(芳樟醇氧化物I、II)＝111，m/z(2-十一酮)＝71，m/z(2-壬酮)＝58，m/z(香叶醇)＝69，m/z(甲基氨基甲酸甲酯)＝119处的EIC峰面积作为基峰。根据以下示出的方案，基于所选择的碎片在各个时间点(1至14天)的EIC(0％至100％)的相对峰面积，进行所选碎片的相应饱和度的赋值。

图8:芳樟醇和苯甲醛在根据本发明的菌种培养基上进行转化期间与使用茯苓的发酵作为实施例在标准菌种培养基上进行相应的转化期间相比香气特性的进展图。芳樟醇在MEA(□)上的进化；芳樟醇在3TT+Asp(○)的进化；苯甲醛在MEA( )上的进化；苯甲醛在3TT+Asp(x)上的进化。为了准备EIC，为芳樟醇选择m/z＝93处的碎片，为苯甲醛选择m/z＝106处的碎片。使用的缩写如前所述。

图9:邻氨基苯甲酸甲酯(m/z＝119)在根据本发明的菌种培养基上进行转化期间与使用茯苓的发酵作为实施例在标准菌种培养基上进行转化期间相比香气特性的进展图。邻氨基苯甲酸甲酯在MEA(x)上的进展；邻氨基苯甲酸甲酯在3TT+Asp(○)上的进展。

图10:使用茯苓在具有0.624％L-天冬氨酸单钠的3％果渣上进行发酵作为实施例，所选择的香气物质(○)在根据本发明的菌种培养基上进行转化后浓度的半定量估计图。本文中，菌种的顶部空间在10天后分析，并且与通过标准确定的标定系列(x)进行对比。A:芳樟醇；B:苯甲醛；C:邻氨基苯甲酸甲酯。估计的量以μg/平板标出。

图11:使用茯苓在3％红醋栗果渣上进行出水发酵作为实施例，在根据本发明的菌种培养基上进行转化的感官评价图。给定属性由四个经训练的人员评价为0至5的等级。使用的缩写:JhB:醋栗果渣、Asp:0.624％L-天冬氨酸单钠、d0:未培养的参考培养基、d10:用茯苓培养10天。

图12:使用茯苓在Müller-Thurgau变种的3％葡萄果渣上进行出水发酵作为实施例，在根据本发明的菌种培养基上进行转化的感官评价图。给定属性由四个经训练的人员评价为0至5的等级。使用的缩写:Wine:葡萄果渣、Asp:0.624％L-天冬氨酸单钠、d0:未培养的参考培养基、d10:用茯苓培养10天。

图13:使用茯苓在Muscaris变种的3％葡萄果渣、0.6％L-天冬氨酸单钠、1.5％琼脂-琼脂上进行出水发酵作为实施例，在根据本发明的菌种培养基上进行转化的GC-MS色谱图。示出的为进行10天培养后所取样品的色谱图；分流比3:1进行测量。

图14:使用茯苓在3％草莓果泥渣、0.6％L-天冬氨酸单钠、1.5％琼脂-琼脂上进行出水发酵作为实施例，在根据本发明的菌种培养基上进行转化的GC-MS色谱图。示出的为进行8天培养后所取样品的色谱图；分流比3:1进行测量。

图15:使用茯苓在3％覆盆子果泥渣、0.6％L-天冬氨酸单钠、1.5％琼脂-琼脂上进行出水发酵作为实施例，在根据本发明的菌种培养基上进行转化的GC-MS色谱图。示出进行8天培养后所取样品的色谱图；分流比3:1进行测量。

图16:茯苓在不同菌种媒介上和不同培养时间进行的培养期间所选香气的热图。以m/z(苯甲醛)＝106、m/z(芳樟醇)＝93、m/z(芳樟醇氧化物I、II)＝111、m/z(2-十一酮)＝71、m/z(2-壬酮)＝58、m/z(香叶醇)＝69、m/z(甲基氨基甲酸甲酯)＝119处的EIC峰面积作为基峰。根据以下示出的方案，基于所选择的碎片在EIC(0％至100％)的相对峰面积，进行所选碎片的相应饱和度的赋值。使用的出水菌种媒介:M1:3％果渣、M2:3％果渣和0.4％葡萄糖、M3:3％果渣和0.8％葡萄糖。培养时间:0d:未培养的参考培养基、8d:8天、10d:10天。使用的缩写:ER:非变种草莓果泥渣、HR:非变种覆盆子果泥渣、MUT:Muscaris变种酿酒葡萄果渣、Asp:0.6％L-天冬氨酸单钠。

图17:使用茯苓在草莓果泥渣上的固定床菌种作为实施例，在根据本发明的菌种培养基上进行转化的GC-MS色谱图。示出的为进行28天培养后所取样品的色谱图；通过未分流模式的SPME-GC-MS进行测量。

具体实施方式

本发明实质上基于如下发现：具有以醋栗科、蔷薇科或葡萄科的植物部分为基础的成分的转化培养基包含极其受关注的能够生物转化为香气物质的香气前体。术语香气物质在本文中用于描述以香气活性的量赋予易察觉的味道或气味的化合物。在该情况下，术语“香气活性”是指该化合物的量在使用含有该化合物的制剂时足以在嗅觉和/或味觉感受器上引发感官效果。这种效果也可以通过减少或掩盖基于令人不快的味道和/或气味的感官感知来显化。

根据本发明的方法避免对严苛制造条件、有机溶剂或重金属催化剂的需求，这在化学合成的情况下几乎无法避免。因此，本发明提供了一种化学合成的环保替代品，其进一步满足了对诸如芳樟醇等香气物质不断增长的需求。

此外，根据本发明的方法的特点是，其提供了将醋栗科、蔷薇科或葡萄科的叶或果渣等农业废物流用作高品质香气物质的来源，从而被有益地整合到农业生产的价值链的可能性。由于这个理由，特别优选如下工艺：提供以醋栗科、蔷薇科或葡萄科的植物部分为基础的成分，以本文描述的叶和/或果渣和/或其提取物的形式。非常特别优选的是使用醋栗的果渣，特别是本文描述的黑醋栗的果渣。本文描述的根据本发明的方法中，以醋栗科、蔷薇科或葡萄科的植物部分为基础的成分的比例基于转化培养基的总重量，通常为0.2重量％至100重量％的范围。如果所述培养为出水或沉水培养，则在本文描述的根据本发明的方法中，以醋栗科、蔷薇科或葡萄科的植物部分为基础的成分的比例基于转化培养基的总重量，优选地为0.2重量％至20重量％，优选地为0.5重量％至10重量％，进一步优选地为1重量％至5重量％，并且最优选地为2重量％至4重量％。如果培养以固定床培养的形式进行，则在本文描述的根据本发明的方法中，以醋栗科、蔷薇科或葡萄科的植物部分为基础的成分的比例基于转化培养基的总重量，优选地为10重量％至100重量％，优选地为30重量％至90重量％，进一步优选地为50重量％至80重量％，并且最优选地为60重量％至70重量％。

术语“醋栗科”是指茶藨子科的植物。根据本发明优选的是如下方法：该方法使用适合进行软果生产的物种和变种的植物部分，特别是醋栗、鹅莓及其杂交种诸如黑醋栗树的植物部分。进一步优选的是使用白鹅莓或红鹅莓、红醋栗、白醋栗、黑醋栗或墨黑醋栗及它们的杂交种和变种的植物部分的方法。最优选地是根据本发明使用黑醋栗(黑果茶藨)及其变种和培育品种的植物部分的方法。

术语“蔷薇科”是指科蔷薇科的植物。根据本发明，优选如下方法：该方法使用适合进行软果生产的物种和变种的植物部分，特别是草莓和树莓及其杂交种和变种的植物部分。

术语“葡萄科”是指山葡萄科的植物。根据本发明，优选如下方法：该方法使用适合进行软果生产的物种和变种的植物部分，特别是葡萄藤及其杂交种和变种的植物部分。进一步优选的是使用贵族葡萄(酿酒葡萄)及其变种的植物部分的方法。

特别地，植物组分包括地上营养或生殖组织，优选地为叶、芽、花瓣和/或花蕾、浆果及它们的果核、果皮和果肉等子组分。优选地，该植物部分是叶和/或浆果并且进一步优选地为一整个成熟浆果。

以植物部分为基础的成分在本发明中意为由所涉及的植物的部分获得的成分。在这种情况下，根据本发明的方法使用的成分不一定必须以相同方式出现在自然界。相反，所涉及的植物的成分也可以通过进一步加工自然出现的成分获得。进一步加工的优选措施包括(部分)干燥、(部分)发酵和/或(部分)压制。优选地，该植物是来自使用相应植物或至少其部分作为原料的其他产业的废物。特别优选地，所述植物部分是浆果(一整个)或由果汁提取得到的残渣(所谓的果渣)。

本发明特别感兴趣的是令人感觉愉悦的味道和/或气味印象。评估一种味道和/或气味印象是否被认为是令人愉悦的或相当令人不快的能够通过经训练的小组基于评估阴性(令人愉悦)与阳性(令人不快)之间的感官印象进行感官分析而进行。可以为更精确的分类设置强阴性、中性和强阳性等进一步的等级。待评估的香气物质在其他化合物，可能是其他香气物质的混合物中出现，确定该待评估的香气物质的香调能够通过例如气相色谱嗅觉测量法进行。在本发明中，香气物质或香气物质混合物特别是赋予令人愉悦的气味印象的物质，因此也是指芳香物质。

在制备具有令人愉悦的味道和/或气味印象的香气物质的情况下，含有如下成分的转化培养基脱颖而出：该成分以黑醋栗的植物部分为基础，优选地以黑醋栗(黑穗醋栗)的植物部分为基础，并且特别地以黑醋栗Titania变种的植物部分为基础。这种成分显然含有香气前体，通过生物催化转化，该香气前体能够产生令人感觉极其愉悦的香气物质。因此，在根据本发明的方法中提供的转化培养基优选地含有以醋栗的植物部分为基础的成分，该醋栗优选地为黑醋栗并且进一步优选地为黑醋栗Titania变种。因而，能够使用合适的生物催化剂进行生产的香气物质具有花香、清香、果香或让人联想到野莓或柑橘的香调。当在以麦芽提取物为基础的标准菌种培养基上适当地转化时，这些香气不易察觉。相反，本文将嗅觉印象描述为真菌的、酸味以及热带水果的气味。其它优点由下述措施得到。

优选地，回收香气物质或香气物质混合物的步骤包括至少部分地将产生的香气物质或香气物质混合物的至少一种香气物质与生物催化剂分离。优选地，进行与生物催化剂的基本完全分离。此外，回收的步骤可包括富集、浓缩和/或隔离产生的香气物质或香气物质混合物的至少一种香气物质。如本文使用的，术语“至少一种香气物质”可选地是指1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种香气物质。

出于本发明的目的，全细胞生物催化剂因其同时或相继再生进行了催化的转化反应的能力已被证明是特别有效。因此，转化步骤可包括在“生长”或再生生物催化剂的意义上进行培养。然而，本领域技术人员普遍知道的是，使用全细胞的转化最终依赖于一种或多种催化的反应，因此本发明也包括如下方法：用于生产香气物质或香气物质混合物的生物催化剂也仅包括用于生产香气物质或香气物质混合物的全细胞生物催化剂的催化性相关单元。

所述生物催化剂优选地为真菌，其真菌细胞或其至少一个催化性相关单元。本文的催化性相关单元是指所述转化需要的诸如酶或核酶、以及可选的辅因子和辅助底物等大分子。优选地，其是能够在木质纤维素上生长的真菌和/或选自食用菌群的真菌(或其相应的真菌细胞)。因此，在木质纤维素上生长的能力是有利的，因为这种真菌特别适合在本文描述的以醋栗为基础的成分上进行培养。另外，苯甲醛等香气物质可以直接由木质纤维素的降解得到。使用生产的香气物质或香气物质混合物时，就安全性而言，食用菌是有利的。这种优选的需求概况适用担子菌纲(门)(担子菌门)的许多真菌。此外，特别优良的气味印象能够利用来自担子菌纲的真菌获得，特别是当醋栗是本文描述的黑醋栗时。

特别值得注意的是如下发现：使用属于担子菌的品种的转化得到在整体印象中令人感觉愉悦的气味。这意味着真菌(蘑菇)的、酸味以及热带水果气味的香调，其称为典型真菌香气，不会或难以形成。因此，优选如下方法：真菌选自担子菌纲和/或醋栗科的植物部分选自醋栗的植物部分组，优选黑醋栗的植物部分组、进一步优选为黑醋栗Titania变种的植物部分组。

特别地，优选本文描述的方法，其中所述担子菌纲的真菌选自由四孢蘑菇、茶树菇、蜜环菌、烟管菌、鸡腿菇、皱缘黑蛋巢、金针菇、车轴草、簇生黄韧伞、鲑贝耙齿菌、鸡冠菌、香菇、紫丁香蘑、梨形马勃、群生小皮伞膜盖、M.pseudocorticola、蒜头状小皮伞、晚生扇菇、黄孢原毛平革菌、扇形侧耳、紫孢侧耳、绣球菌、毛韧革菌、香栓孔菌、薄皮干酪菌和茯苓组成的组。就它们形成具有令人愉悦的气味印象的香气物质的能力而言，这些物种显然优于已经测试而未在本文指明的大量其他真菌或真菌转化培养基组合。

进一步优选的是本文描述的方法，其中该真菌选自由四孢蘑菇、茶树菇、鸡腿菇、车轴草、簇生黄韧伞、鲑贝耙齿菌、鸡冠菌、香菇、梨形马勃、群生小皮伞膜盖、M.pseudocorticola、蒜头状小皮伞、晚生扇菇、黄孢原毛平革菌、扇形侧耳、紫孢侧耳、绣球菌、香栓孔菌、薄皮干酪菌和茯苓组成的组。该选择在至少一种可能的培养形式中得到特别令人愉悦的香气。

进一步优选的是本文描述的方法，其中该真菌选自由茶树菇、鸡腿菇、车轴草、簇生黄韧伞、鸡冠菌、M.pseudocorticola、蒜头状小皮伞、扇形侧耳、紫孢侧耳、绣球菌、香栓孔菌(T.suaveolens)和茯苓组成的组。以上选择在至少两种可能的培养形式中得到特别令人愉悦的香气。

进一步优选的是本文所述的方法，其中该真菌选自由茯苓和车轴草组成的组。该真菌车轴草和茯苓在所有测试的培养形式中在所有测试的基质上都显示非常强烈的气味印象。车轴草在本文中产生柑橘类香气，茯苓的香气是花香、果香和让人联想野草莓。因此，这种选择得到特别令人愉悦的香气，无论可能的培养形式如何。

如上所述，优选的生物催化剂包括单细胞或上述优选的催化性活性单位和进一步优选的真菌。

此外，根据本发明，优选如下的方法：提供的转化培养基包括天冬氨酸源，优选地为L-天冬氨酸源，进一步优选地为L-天冬氨酸钠，最优选地为L-天冬氨酸单钠。因此，在进行实验的过程中，发现添加L-天冬氨酸单钠抵消了另外观察到的pH下降并且最终得到特别强烈的野草莓气味。经过大约10天的培养后，气味增强为花香以及让人联想到野草莓的强烈的果香。当在本文描述的补充天冬氨酸的转化培养基上培养时，所述香气的信号强度比在基于麦芽提取物的标准菌种培养基上培养时明显更高。芳樟醇的强度特别高，其与菌种的花香气味非常相关。一些香气活性物质，诸如苯甲醛、芳樟醇、芳樟醇氧化物I、II和2-十一酮在包含天冬氨酸的转化培养基上形成地特别好，其优选地以本文描述的果渣形式提供。天冬氨酸源的含量基于所述转化培养基的总重量，通常为0.1％至20.0％。如果培养的形式是出水或沉水培养，则在本文描述的根据本发明的方法中，所述天冬氨酸源的含量基于转化培养基的总重量，优选地为0.1重量％至5重量％，更优选地0.2重量％至3重量％，进一步优选地为0.3重量％至2重量％，并且最优选地为0.4重量％至1重量％。如果培养的形式是固定床培养，则在本文描述的根据本发明的方法中，该天冬氨酸源的含量基于转化培养基的总重量，优选地为0.1重量％至20重量％，更优选地2.5重量％至17.5％，进一步优选地为5重量％至15重量％，并且最优选地为7.5重量％至12.5重量％。

或者，pH下降可以利用其他缓冲物质抵消。优选地，所述转化期间转化培养基的pH范围为pH 2至pH 7，优选地为pH 4至pH 6，并且特别地为pH 4.2至pH 5.5。在该转换持续数天的情况下，这意味着在整个期间至少基本上保持该pH范围。

可以将额外的营养源添加到该转化培养基以优化香气特性和强度。除了本文描述的天冬氨酸源之外，这些额外营养源特别包括葡萄糖；选自由Mg2+、Zn2+、Fe3+、Mn2+、Cu2+、K+、Cl-、SO42-和PO43-组成的组的微量元素和其他氨基酸。

在本发明的上下文中，基本上设想了所有形式的培养，即使特定形式可能影响形成的香气物质。例如，使用出水菌种的转化获得了特别好的结果，特别是当茯苓和/或果渣用作相应的生物催化剂和本文描述的基于醋栗科的成分时。根据本文描述使用的真菌物种和本文描述的以醋栗科、蔷薇科或葡萄科为基础的成分的特定形式，沉水和固定床菌种也得到非常令人愉悦的香气。

已经发现对于可生产的香气物质特别有利的是，借助本文描述的担子菌，对包含本文描述的醋栗的植物部分且添加本文描述的天冬氨酸源的转化培养基进行转化。代替天冬氨酸源，也可以将pH缓冲组分添加到如上本文描述的转化培养基中从而在该转换期间将pH维持在本文描述的pH范围内。特别地，在Titania变种的醋栗渣上培养茯苓产生花香和让人联想野草莓的果香气味。茯苓也是一种用于传统中医的食用菌。除多种次要的组分外，芳樟醇、苯甲醛和邻氨基苯甲酸甲酯也形成为关键的香气组分。

根据本发明的方法特别适用生产香气物质或香气物质混合物，其包含选自2-辛酮、2-壬酮、2-十一酮、芳樟醇氧化物、苯甲醛、香叶醇、2-辛醇、邻氨基苯甲酸甲酯、芳樟醇和2-氨基苯甲醛的至少1种，优选地为2种或3种，更优选地为4种或5种并且最优选地为6种、7种、8种、9种或10种化合物。特别优选的为涉及生产芳樟醇、苯甲醛和邻氨基苯甲酸甲酯的至少1种化合物、优选地为2种化合物并且进一步优选地为所有化合物的方法。这些化合物是本文描述的转化培养基可产生的香气物质混合物的独特特征。特别地，邻氨基苯甲酸甲酯显示出野草莓的强烈果香气味。

因此所产生的香气物质(本文中也称为香气组合物)的类型和强度的确切组成能够通过改变回收该香气物质或香气物质混合物的时间而影响。在该情况下，已证明根据在本发明的方法中的采集时间有效，其中提取香气物质或香气物质混合物在接触开始后3至14天，优选地为5至14天并且特别为9至13天进行。除此之外，还设想将香气物质或香气物质混合物的提取时间确定为预定香气组合物的函数。除了其他方面外，这就使得能够在如下时间进行采集：在该时间存在一种特别令人愉悦的香气物质混合物和/或一种特别令人愉悦的香气物质显然优于可能形成的其他香气物质。

此外，本发明涉及转化培养基生产本文描述的香气物质或香气物质混合物的用途，该转化培养基包含本文描述的基于醋栗科的植物部分的成分和/或本文描述的生物催化剂。特别地，所述以醋栗科的植物部分为基础的成分是本文描述的以诸如黑醋栗的叶或果渣等植物部分为基础的成分。特别地，所述生物催化剂是来自本文描述的担子菌纲的真菌。

此外，本发明涉及一种组合物，特别是根据本文描述的方法制备(可制备)的组合物，其包含选自由芳樟醇、苯甲醛和邻氨基苯甲酸甲酯组成的组的2种或更特别地所有的化合物。优选的为根据本发明的如下组合物：芳樟醇与苯甲醛的体积重量比在100:1至4:1之间和/或芳樟醇与邻氨基苯甲酸甲酯的体积重量比在50:1至2:1之间和/或苯甲醛与邻氨基苯甲酸甲酯的体积重量比在3:1至1:10之间。根据本发明的组合物进一步优选地包含选自由2-辛酮、2-壬酮、2-十一酮、芳樟醇氧化物、苯甲醛、香叶醇、2-辛醇、邻氨基苯甲酸甲酯、2-氨基苯甲醛和芳樟醇组成的组的至少1种，优选地为2种或3种，更优选地为4种或5种并且最优选地为6种、7种、8种、9种或10种化合物。

此外，本发明涉及本文描述的根据本发明的组合物作为营养、美容、保健或可食用的制剂的用途或在营养、美容、保健或可食用的制剂中的用途，特别是作为香气物质混合物的用途(优选地用于本文描述的目的)。因此，本发明还涉及包含本文描述的根据本发明的组合物或由本文描述的根据本发明的组合物组成的营养、美容、保健或可食用的制剂。

下面参考下述实施例更详细地解释本发明。

实施例

1.实验部分

1.1材料和化学品

醋栗产业和葡萄酒产业使用的侧流由德国盖森海姆大学提供。覆盆子或草莓果泥渣是通过将新鲜的、可商购的、非变种的浆果成泥并过筛来制备。剩余的果泥渣用作媒介组分。使用的担子菌门真菌的来源如表1所示。

表1：受测试真菌、它们的来源和培养介质的概况；DSMZ：莱布尼兹研究所DSMZ-德国微生物菌种保藏中心，德国布伦瑞克；CBS：CBS-KNAW菌种保藏中心，韦斯特迪克真菌生物多样性研究所，荷兰乌得勒支大学；S：吉森大学食品化学与食品生物技术研究所，吉森大学；MEA：麦芽提取物琼脂；SNL：标准营养溶液琼脂。

1.2菌株保持

待研究真菌(表1)在麦芽提取物琼脂平板(MEA)或标准营养溶液(SNL)琼脂平板培养用于菌株保持。所有媒介在121℃下蒸汽杀菌20分钟。所述媒介组成如下：

MEA：20g·L

SNL：30g·L

为了培养，将来自80％过度生长的琼脂平板的大约0.5cm

1.3对黑醋栗残渣流进行筛选

担子菌门的真菌在黑醋栗残渣流叶和果渣上的培养在沉水菌种、出水菌种和固定床菌种进行。最初，所述残渣流用作26种受测试真菌的唯一营养来源。

为了在出水菌种中培养真菌，准备具有不同浓度基质的琼脂平板。根据基质，需要不同浓度的琼脂。与菌株保持相似，它们与26种选择的真菌(表1)一起接种。在4至7天后，根据真菌的生长情况，第一次检查平板的感官特性。在醋栗果渣、酿酒葡萄果渣、草莓果泥渣或覆盆子果泥渣上进行茯苓出水菌种培养以进行进一步实验，将3％果渣添加到30％去离子水并且1.5％或3％琼脂的70％去离子水在倾倒之前高压灭菌并混合。每个平板包含大约16mL培养基。

为了在沉水菌种中培养真菌，首先在2％ME培养基中制备预制菌种(100mL)。这通过将来自菌株保持平板的菌丝过度生长的大约1cm

为了在固定床菌种中培养真菌，以前述的方式培养并均质化所述预制菌种。向固定床菌种培养基中添加2mL该悬浮液。为了制备固定床菌种培养基，将20g果渣、10g水和2gL-天冬氨酸单钠(Asp)在烧瓶中均质化并且高压灭菌。接种的固定床菌种媒介以150rpm在24℃下避光静态培养。为了进行对比，未培养的固定床媒介作为空白。

1.4对在黑醋栗残渣流上的培养进行优化

为了优化香气特性和强度，营养的其他来源被添加到基质。除调节pH，也补充葡萄糖、微量元素(Mg2+、Zn2+、Fe3+、Mn2+、Cu2+、K+、Cl-、SO42-、PO43-)、L-天冬氨酸单钠和其他氨基酸。另外，改变所述醋栗侧流的基质浓度。

1.5感官分析

感官分析由经训练的小组(n＝4)进行从而预选真菌-基质组合。为此目的，在“简单描述性测试”中检查菌种，评价几个培养日的整体印象。评估整体印象的等级包括从强阴性(0)到强阳性(5)的六个水平。通过GC-MS-O鉴别香气。

1.6确定菌丝生长

培养期间，通过在琼脂平板背面上画出过度生长区域并且确定该直径来每天记录真菌生长。由此，计算出过度生长的菌丝区域。

1.7确定pH值

为了确定沉水菌种的pH值的进程，取一份试样(2mL)并且使用pH计确定pH。对于出水菌种，菌种的pH如下确定：使用Ultratrurrax(10000rpm，10s)添加15mL去离子水后均质化一个平板的琼脂，然后离心(10分钟，4000g)并且使用pH计测量上清液的pH。

1.8GC-MS-O分析

醋栗果渣上出水菌种的香气在24℃下用搅拌棒吸附萃取法(SBSE)萃取60分钟。为此目的，具有0.5mm PDMS(聚聚二甲硅氧烷)涂层(Twister，GERSTEL，Mühlheim an derRuhr，德国)的10mm磁力搅拌棒用磁铁固定在培养容器的顶部空间。温育后，将磁力搅拌棒用磁棒取出，用去离子水冲洗，用无绒布干燥，并且放置在经调节的热解吸单元(TDU)衬垫(GERSTEL)。在不分流的情况下进行TDU解吸。使用冷进样系统4(CIS)(GERSTEL)中具有硅烷化玻璃填料(GERSTEL)的玻璃蒸发器管冷集分析物。使用由与5977B MSD(安捷伦科技公司)偶联的A7890B GC(安捷伦科技公司，瓦尔德布龙，德国)和嗅觉检测端口(ODP)(GERSTEL)组成的GC-MS-O进行气相色谱分析。使用安捷伦J&WVF-WAXms(30m×0.25mm ID×0.25μm)作为极性柱，并且使用安捷伦J&W DB-5ms(30m×0.25mm ID×0.25μm)作为非极性分离相。以1.56mL·min

为了调查香气相对强度的变化和使用VF-WAXms进行鉴别，以10℃·min

为了进行半定量估计和使用DB-5ms确定保留指数，所述烘箱以5℃·min

以前述方式使用顶部空间SBSE萃取茯苓在酿酒葡萄果渣、草莓果泥渣或覆盆子果泥渣上的出水菌种的香气。随后使用由与5977B MSD(安捷伦科技公司)偶联的8890GC(安捷伦科技公司)和火焰电离检测器组成的GC-MSFID进行气相色谱分析。使用的柱是安捷伦VF-WAXms(30m×0.25mm ID×0.25μm)。烘箱温度以3℃·min

为了分析固定床菌种，将3g菌丝生长的固定床菌种培养基称量至20mL顶空小瓶并且在顶部空间通过固相微萃取法(SPME)进行分析。为此目的，样品在45℃下以250rpm温育20分钟并且用聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯纤维萃取5分钟。在CIS 4中在230℃下不分流进行解吸60分钟。使用GC-MS进行气相色谱分析，该GC-MS由与5977B MSD偶联的7890B GC组成。使用安捷伦DB-FFAP(60m×0.25mm ID×0.25μm)作为柱。5分钟后烘箱温度以10℃·min

1.9鉴别香气物质

为了鉴别该物质，10-30mg参考物质根据溶解度与50-1000μL DMSO(Carl Roth，德国，卡尔斯鲁厄)混合,且如需要，用去离子水加满至1mL。以下香气物质用于分析：2-氨基苯甲醛≥98％(Sigma Aldrich)、2-壬酮≥99％(Accos Organics，赫尔，比利时)、芳樟醇97％(Accos Organics)、邻氨基苯甲酸甲酯99％(Acros Organics)、(+)-2-辛醇98％(AlfaAesar，黑弗里尔，美国)、香叶醇97％(Alfa Aesar)、2-辛酮98％(Sigma Aldrich，圣路易，美国)、芳樟醇氧化物异构体混合物(Sigma Aldrich)、2-十一酮纯(Honeywell Fluka，布加勒斯特，罗马尼亚)、苯甲醛纯(Applichem，达姆施塔特，德国)。由此，用水制备1:200和1:1000的稀释液并且在琼脂(1.5％琼脂的去离子水)上析出0.5mL溶液。1小时后，用磁铁将

1.10对邻氨基苯甲酸甲酯、芳樟醇和苯甲醛的浓度进行半定量估计

为了进行半定量估计，将芳樟醇、邻氨基苯甲酸甲酯和苯甲醛溶解在去离子水中。对于苯甲醛，分别制备浓度为3mg·L

2.结果

为了调查黑醋栗侧流的生物转化以合成天然香气，测试了担子菌门总共26种真菌。表2概述了对出水菌种和沉水菌种中的受测试真菌-基质组合的气味印象进行的评估。

表2：真菌-基质组合在0(强阴性)与5(强阳性)之间的整体印象的感官评估。-：未进行的培养。

基于感官分析，鉴别了几种关注的真菌-基质组合。真菌车轴草和茯苓在所有经测试的培养类型的所有经测试的基质上显示出非常强烈的气味印象。本文车轴草产生类柑橘香气，茯苓的香气是花香、果香和让人联想野草莓。

为了更详细地分析茯苓的生长特性，在不同的媒介上培养真菌。除果渣外，选择麦芽提取物琼脂，其非常适合作为真菌生长的全培养基。在果渣上培养时，添加L-天冬氨酸单钠得到特别强烈的香气。除气味外，培养物在视觉上和生长上有差异(参见图1)。

添加天冬氨酸后，菌丝和营养培养基变成棕色。此外，与参考培养基相比所述生长减少(参见图2)。形成更少生物量和非常平坦的菌丝。

添加0.624％的L-天冬氨酸单钠，该pH值比在无天冬氨酸的菌种中降低得更少(参见图3)。在果渣和MEA培养基的发酵中，在培养进程中pH值降低至约2.5。相反，添加天冬氨酸的果渣的培养基中未观察到pH降低。在这些菌种中，野草莓的气味特别强烈。

为了对香气组合物进行分析，与GC-MS-O组合进行SBSE分析。茯苓在添加0.624％L-天冬氨酸单钠的黑醋栗果渣上发酵被认定为特别受关注。检测到的香气明显不同于在未添加天冬氨酸的MEA或醋栗果渣或醋栗叶上进行的发酵中检测到的那些香气。

特别地，在MEA培养基中检测到3-辛酮、1-辛烯-3-醇、1-辛醇和(E)2-辛烯-1-醇等C8香气(参见图4)。它们被描述为典型真菌香气(Hofrichter,M.,ed.,IndustrialApplications,(2011),Berlin,Heidelberg,Springer Berlin Heidelberg)。这与嗅觉印象密切相关，其被描述为真菌的、酸味和热带水果气味。

相比之下，当茯苓在具有天冬氨酸的醋栗果渣上培养时，该香气有明显差异。仅在几天后，该菌种开始有花香和清香。此外，未察觉到让人联想真菌的香气。经过大约10天的培养后，该气味更强烈，有花香和让人联想野草莓的强烈果香香气。

当在补充了天冬氨酸的黑醋栗果渣上培养时，所述香气信号强度比在MEA上培养时明显更高(参见图5)。芳樟醇的强度特别高，其与该菌种的花香气味密切关联。

除芳樟醇外，通过GC-MS-O调查来鉴别另外的化合物，这些化合物的特征是具有真菌-基质组合的香气。特别地，邻氨基苯甲酸甲酯显示出野草莓的强烈果香气味。

通过嗅觉鉴别的化合物也突出所述香气组合物的复杂性。为此目的，为了检测特别强烈的香气，通过以界定的培养天数进行GC-MS-O来检查茯苓的出水菌种(参见图6)。

在由此进行的菌种的嗅觉评价中，非常强烈地察觉到物质芳樟醇和邻氨基苯甲酸甲酯。借助ODP也察觉到特征气味为苦杏仁味的苯甲醛。除这些关键香气物质外，可察觉到大量其他气味，物质分类有待确定。

表3示出对样品中包含的所选择物质的建议及其根据van den Dool和Kratz的保留指数(RI)以及与标准物质的保留指数和文献中描述的气味进行比较的气味。通过使用来自在3％果渣+0.624％L-天冬氨酸单钠上的茯苓的出水菌种的样品，与由NIST数据库得到的相应对照光谱进行对比，关联质谱(未示出)证实形成2-辛酮、2-壬酮、芳樟醇氧化物、苯甲醛、香叶醇、2-辛醇，2-氨基苯甲醛、邻氨基苯甲酸甲酯和芳樟醇。

表3：根据vanden Dool和Kratz的保留指数(RI)和样品中检测到的物质的气味与标准物质(STD)和文献中描述的气味对比。VF-WAXms和DB-5ms表示使用的各分离相(参见实验部分，1.8)。

(1992):2-Aminobenzaldehydes.The Source of the“Sweet Odor”of Hebelomasacchari-olens.In:Mycologia84(6),p.935.DOI:10.2307/3760296。

样品和标准的保留指数以及质谱和气味非常一致。

使用顶部空间SBSE，以24小时的间隔记录主要香气的形成动力学为期14天(参见图7)。

苯甲醛、芳樟醇、芳樟醇氧化物I、II和2-十一酮等一些香气活性化合物几乎只在果渣和天冬氨酸(3TT+Asp)的培养基上形成。在果渣和天冬氨酸的培养基上和在MEA和天冬氨酸(MEA+Asp)的培养基上形成诸如2-壬酮、香叶醇和邻氨基苯甲酸甲酯等其他化合物。

香气分析数据(参见图8和9)与感官分析的香气分析数据密切相关，其中特征气味被描述为在培养的第10天最强烈。

芳樟醇、邻氨基苯甲酸甲酯和苯甲醛被认为是所述香气特有的特征。由于这个理由，当茯苓在具有天冬氨酸的果渣上培养10天后，对香气浓度进行半定量估计(参见图10)。

基于校准系列，能够估计每平板95-135μg的芳樟醇，大约5μg的苯甲醛，5-20μg的邻氨基苯甲酸甲酯。考虑到约16mL的平板体积，这与大约7000±1500μg·L

经训练的小组对茯苓在转化媒介上的培养进行感官评价，该转化媒介以添加和未添加天冬氨酸的黑醋栗果渣为基础。在“果香”、“花香”和“野莓果”属性方面，添加天冬氨酸的出水菌种评定为明显更加强烈(参见图11)。

通过在具有以葡萄科或蔷薇科的植物部分为基础的成分的转化媒介中培养茯苓，也能够产生很受关注的香气特性。因此，取决于培养的持续时间，在由Müller-Thurgau、Gewürztraminer或Muscaris的酿酒葡萄果渣组成的媒介上培养茯苓得到具有让人联想野草莓的果香和花香的香气特性(参见表4)。

表4：使用茯苓在不同变种MT：Müller-Thurgau、GT：Gewürztraminer、MU：Muscaris的3％酿酒葡萄果渣上的出水发酵作为实施例，在根据本发明的菌种培养基上进行转化的感官评价。不同的培养持续时间概括的气味属性。

茯苓在转化媒介上的出水菌种的感官评价显示出与以红醋栗果渣为基础的出水菌种的类似之处，该转化媒介以添加天冬氨酸的Müller-Thurgau变种的葡萄果渣为基础(参见图12)。

借助气相色谱分析，茯苓在包含蔷薇科或葡萄科成分的媒介上的菌种检测到香气活性化合物2-辛酮、2-壬酮、2-十一酮、芳樟醇氧化物、苯甲醛、香叶醇、邻氨基苯甲酸甲酯和芳樟醇。如图13、14和15示出了茯苓在都添加0.6％L-天冬氨酸单钠的Muscaris酿酒葡萄果渣、草莓果泥渣或覆盆子果泥渣上的出水菌种的实施例色谱图。

图16示出当茯苓在包含蔷薇科或葡萄科成分且额外改变葡萄糖含量的媒介上出水生长时形成的香气活性化合物的量的比较。示出的香气活性化合物不能在未添加葡萄糖的未培养参考媒介(M1(0d))中检测到或仅检测到非常低的量。与培养基M1相比，在以草莓和覆盆子果泥渣为基础、另外包含0.4％和0.8％葡萄糖(分别为M2和M3)的媒介上进行培养，形成少量所呈现的香气活性化合物(参见图16)。由此，形成所呈现香气活性化合物主要通过存在于培养基的植物成分的生物技术转化实现。

使用的培养方法对所述菌种香气的定量组成具有明显影响。因此，所述香气活性化合物，其为茯苓的出水菌种的香气特征，也通过该真菌沉水培养或固定床培养检测到偏离的量。图17示出茯苓在具有草莓果泥渣和天冬氨酸的培养基上的固定床培养的实施例色谱图。