肺炎支原体及肺炎衣原体抗体联检试剂盒、其制备方法及检测方法

技术领域

本发明属于体外诊断试剂领域，特别是涉及一种肺炎支原体及肺炎衣原体I gM和I gG抗体联检试剂盒。

背景技术

肺炎一直是威胁人类健康常见的感染疾病之一，也是造成全球经济损失主要原因。肺炎分为很多种类，其中社区获得性肺炎(CAP)和医院获得性肺炎(HAP) 是全球肺炎发病率和死亡率的主要原因。社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)，是指在医院外罹患的感染性肺实质炎症，包括具有明确潜伏期的病原体感染而在入院后潜伏期内发病的肺炎。轻微症状的CAP可能由肺炎支原体、肺炎衣原体和病毒引起，对于肺炎支原体和肺炎衣原体的共同检测对社区获得性肺炎的早期诊治非常有必要。

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)属于柔膜体纲，支原体属，是一种介于病毒和细菌之间最小的不易染色的无细胞壁原核微生物，其生长缓慢，培养周期长，体外分离培养比较困难。MP是引起儿童和成人呼吸道感染及社区获得性肺炎的常见病原体之一。MP经飞沫传染，潜伏期及病程较长，人群普遍易感。由于儿童抵抗力低，2-4岁为易感染年龄。MP感染后，可引起轻度呼吸道感染、咽炎、扁桃体炎、支气管炎，甚至非典型肺炎等，并可引起脑炎、心肌炎、肝炎等多系统损害。

肺炎衣原体(chlamydia pneumoniae，CP)，为CAP另一主要病原体，主要引起呼吸道和肺部感染。CP感染是世界各地广泛存在的常见病，无显著的性别和地区差异，一年四季均可发生，几乎每人一生中均受过感染，而且常常反复感染不同年龄人群均易感。肺炎衣原体经飞沫传染，无症状的感染者在本病的传播上比病人更为重要。肺炎衣原体主要引起人的非典型性肺炎，同时还可致支气管炎、咽炎、鼻窦炎、中耳炎、虹膜炎、肝炎、心肌炎、心内膜炎、脑膜炎、结节性红斑等疾病，也是艾滋病、白血病等继发感染的重要病原菌之一

免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)和免疫球蛋白G(Immunoglobulin G， IgG)是人体内最重要的两种抗体。一般情况下，IgM在病毒感染早期，约在感染病毒1周后出现，是急性期感染的诊断指标，但浓度相对较低、维持时间短、亲和力低。IgG约在感染病毒后3周出现，并在血液循环中较长时间存在，与病毒感染机体的特殊致病机理、潜伏期等因素有关。通过检测体内特异性IgM、 IgG抗体的存在，可诊断人体对病毒感染的免疫反应状态。若检测出特异性IgM 抗体，表明有近期感染的发生，但IgM抗体半衰期较短，IgM的检测阴性并不能证明机体未受感染，还需要检测半衰期较长，含量较高的IgG抗体，以明确诊断。当然检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊断还应结合其他实验室检查等信息综合考虑。

CN201210461987.8公开了一种肺炎支原体IgM、IgG抗体的胶体金法检测试纸条、试剂盒及其制备方法。该试纸条金标垫涂覆有重组MP抗原-胶体金复合物，硝酸纤维素膜分别包被有鼠抗人IgM抗体的检测线、鼠抗人IgG抗体的检测线、兔抗MP多克隆抗体的质控线。该试纸条的实际检测过程中，若待测肺炎支原体IgG含量太低，可能得出不正确的阴性结果。

CN201520364385.X公开了一种肺炎支原体IgM、IgG、IgA三联检测卡。该检测卡标记物垫吸附有标记肺炎支原体P1蛋白的胶体金颗粒，反应膜上设置有三条检测线和一条控制线，三条检测线分别包被鼠抗人IgM、鼠抗人IgG、鼠抗人IgA，控制线为羊抗鼠IgG。该检测卡在实际检测过程中，若待测肺炎支原体IgG含量过高，易引起与IgM的交叉感染，干扰IgM的检测。

因此，基于这些问题，仍需开发一种准确性高的肺炎支原体及肺炎衣原体 IgM和IgG抗体联检试剂盒，以满足临床检测应用的需要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种准确性高的肺炎支原体及肺炎衣原体IgM和IgG抗体联检试剂盒。

为实现上述目的，本发明提供了一种肺炎支原体及肺炎衣原体IgM和IgG 抗体联检试剂盒，采取以下技术方案：

一种肺炎支原体及肺炎衣原体IgM抗体和IgG抗体联检试剂盒，其特征在于，包括壳体及安装于壳体内的试纸条，所述壳体的上表面开设有第一观察窗及第二观察窗，所述第一观察窗及所述第二观察窗并排设置，并且为大小相同的长方形结构，所述第一观察窗及所述第二观察窗的下方还分别开设有第一加样孔和第二加样孔，所述试纸条包括第一试剂条及第二试剂条，所述第一试剂条及第二试剂条均包括底板和设置于底板上的依次搭接的样品垫、结合垫、NC 膜、吸水垫及用于连接样品垫、结合垫和NC膜的胶带，所述第一试剂条为肺炎支原体及肺炎衣原体IgM检测试剂条，所述第二试剂条为肺炎支原体及肺炎衣原体IgG检测试剂条，所述第一试剂条的样品垫与第一加样孔的位置相对，所述第二试剂条的样品垫与第二加样孔的位置相对，所述第一试剂条的NC膜与第一观察窗的位置相对，所述第二试剂条的NC膜与第二观察窗的位置相对。

进一步地，所述第一试剂条的结合垫上涂布有IgM胶体金复合物，所述第二试剂条的结合垫上涂布有IgG胶体金复合物，所述IgM胶体金复合物包括胶体金标记的IgM抗体-生物素-亲和素-胶体金复合物，所述胶体金标记的IgM抗体包括胶体金标记的鼠抗人肺炎支原体IgM单克隆抗体及胶体金标记的鼠抗人肺炎衣原体IgM单克隆抗体，所述IgG胶体金复合物包括胶体金标记的IgG抗体-生物素-亲和素-胶体金复合物，所述胶体金标记的IgG抗体包括胶体金标记的鼠抗人肺炎支原体IgG单克隆抗体及胶体金标记的鼠抗人肺炎衣原体IgG单克隆抗体。

进一步地，所述第一试剂条的NC膜上由下至上依次设有CP-IgM检测线、 MP-IgM检测线及IgM质控线，所述第二试剂条的NC膜上由下至上依次设有 CP-IgG检测线、MP-IgG检测线及IgG质控线，所述CP-IgM检测线和CP-IgG 检测线上均包被有肺炎衣原体蛋白，所述MP-IgM检测线和MP-IgG检测线上均包被有肺炎支原体蛋白，所述IgM质控线上包被羊抗鸡IgY抗体，所述IgG 质控线上包被羊抗鸡IgY抗体。

进一步地，所述第一试剂条的样品垫上还涂布有抗人IgG抗体吸附剂。

进一步地，所述第一试剂条的样品垫的制备方法包括，配置25mM Tris缓冲液后加入1％～3％酪蛋白和7％～9％BSA，而后加入海藻糖5g～10g，吐温 5mL～10mL充分混匀，调节PH为7.0，得到样品垫预处理液，在样品垫预处理液中添加浓度为25μg/mL抗人IgG抗体吸附剂，将样品垫浸入上述溶液，然后取出，经过干燥及裁切得到第一试剂条的样品垫。

进一步地，所述第二试剂条的样品垫的制备方法包括，将样品垫浸入所述样品垫预处理液，然后取出，经过干燥及裁切得到第二试剂条的样品垫。

进一步地，所述第一试剂条的结合垫的制备方法包括以下步骤：

(1)胶体金的制备，包括在加热煮沸的纯化水中快速加入1％氯金酸溶液，待溶液再次沸腾后，迅速加入还原剂，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，继续加热10min即可，待溶液冷却至室温后备用；

(2)胶体金-亲和素复合物的制备，包括在1mL胶体金溶液中加入4～8μL 的0.2MK

(3)IgM抗体-生物素复合物的制备，包括将肺支支原体IgM抗体和肺炎衣原体IgM抗体用生物素进行标记，标记成肺支支原体IgM抗体和肺炎衣原体 IgM抗体-生物素复合物。

(4)IgM胶体金复合物的制备，包括将胶体金-亲和素复合物和肺支支原体 IgM抗体和肺炎衣原体IgM抗体-生物素复合物分别混合后连接形成抗体-生物素-亲和素-胶体金复合物。

(5)铺金，包括测试抗体-生物素-亲和素-胶体金复合物的ODmax值，稀释至8OD～16OD范围后，对第一试剂条的结合垫进行喷金处理，然后干燥备用。

进一步地，所述第二试剂条的结合垫的制备方法包括以下步骤：

(1)胶体金的制备，包括在加热煮沸的纯化水中快速加入1％氯金酸溶液，待溶液再次沸腾后，迅速加入还原剂，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，继续加热10min即可，待溶液冷却至室温后备用；

(2)胶体金-亲和素复合物的制备，包括在1mL胶体金溶液中加入4～8μL 的0.2MK

(3)IgG抗体-生物素复合物的制备，包括将肺支支原体IgG抗体和肺炎衣原体IgG抗体用生物素进行标记，标记成肺支支原体IgG抗体和肺炎衣原体 IgG抗体-生物素复合物。

(4)IgG胶体金复合物的制备，包括将胶体金-亲和素复合物和肺支支原体 IgG抗体和肺炎衣原体IgG抗体-生物素复合物分别混合后连接形成抗体-生物素 -亲和素-胶体金复合物。

(5)铺金，包括测试抗体-生物素-亲和素-胶体金复合物的ODmax值，稀释至8OD～16OD范围后，对第二试剂条的结合垫进行喷金处理，然后干燥备用。

进一步地，所述试剂条的层压方法，包括将PVC底板揭开上端粘纸，将NC 膜粘贴于底板上，结合垫一端压住NC膜一端1-2mm，样品垫一端压住结合垫一端1-2mm，吸水垫一端压住NC膜一端1-2mm，胶带一端压住样品垫一端 0.5-1mm。

进一步地，所述试剂盒的检测方法包括：

(1)准备，将待测样本及样本稀释液从储存条件下取出，平衡至室温；试剂卡从包装袋中取出，平放于干燥平面上；

(2)加样，取10μL血清或血浆样本分别加到第一加样孔和第二加样孔中，垂直滴加2滴样本稀释液；或取20μL全血样本分别加到第一加样孔和第二加样孔中，垂直滴加2滴样本稀释液；

(3)检测，等待5-10分钟，从第一观察窗及第二观察窗读取结果。

本发明与现有技术相比，本发明具有以下有益效果包括：

(1)本发明的肺炎支原体及肺炎衣原体IgM和IgG抗体联检试剂盒，包括并排的第一试剂条和第二试剂条，第一试剂条用于检测肺炎衣原体和肺炎支原体的IgM抗体，第二试剂条用于检测肺炎衣原体和肺炎支原体的IgG抗体，避免了IgG抗体与IgM抗体之前的相互干扰，使联检的准确性提高。

(2)本发明试剂盒的第一试剂条的样本垫中涂布有IgG抗体吸附剂，能够吸附样本中高浓度的IgG抗体，进一步减少高浓度IgG抗体对IgM检测造成的假阴性和假阳性影响，使联检的准确性得到提高。

(3)本发明试剂盒的结合垫上涂布有胶体金标记的IgM/IgG抗体-生物素- 亲和素-胶体金复合物，使得感染早期样本中IgM抗体或IgG抗体含量较低时，也能够检出，使联检的准确性进一步提高。

(4)本发明试剂盒适用的样本可以为血清、血浆或全血样本，能够对肺炎支原体及肺炎衣原体的IgM抗体和IgG抗体同时进行检测，可以很好的满足临床检测的需求。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明肺炎支原体及肺炎衣原体IgM和IgG抗体联检试剂盒的结构示意图；

图2为本发明肺炎支原体及肺炎衣原体IgM和IgG抗体联检试剂盒的试剂条结构示意图；

图3为本发明肺炎支原体及肺炎衣原体IgM和IgG抗体联检试剂盒的第二试剂条结构示意图。

其中，100-肺炎支原体及肺炎衣原体IgM抗体和IgG抗体联检试剂盒，110- 壳体，111-第一观察窗，112-第二观察窗，113-第一加样孔，114-第二加样孔， 120-第一试剂条，121-样品垫1，122-结合垫1，123-NC膜1，124-吸水垫，125- 胶带，126-CP-IgM检测线，127-MP-IgM检测线，128-IgM质控线，129-底板， 130-第二试剂条，131-样品垫2，132-结合垫2，133-NC膜2，134-CP-IgG检测线，135-MP-IgG检测线，136-IgG质控线。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

如图1、图2及图3所示，一种肺炎支原体及肺炎衣原体IgM抗体和IgG 抗体联检试剂盒100，包括壳体110及安装于壳体内的试纸条，壳体110的上表面开设有第一观察窗111及第二观察窗112，第一观察窗111及第二观察窗112 并排设置，并且为大小相同的长方形结构，第一观察窗111及第二观察窗112 的下方还分别开设有第一加样孔113和第二加样孔114，试纸条包括第一试剂条 120及第二试剂条130，第一试剂条120及第二试剂条130均包括底板129和设置于底板129上的依次搭接的样品垫(121或131)、结合垫(122或132)、 NC膜(123或133)、吸水垫124及用于连接样品垫、结合垫和NC膜的胶带 125，第一试剂条120为肺炎支原体及肺炎衣原体IgM检测试剂条，第二试剂条 130为肺炎支原体及肺炎衣原体IgG检测试剂条。

具体地，第一试剂条的样品垫121与第一加样孔113的位置相对，第二试剂条的样品垫131与第二加样孔114的位置相对，第一试剂条的NC膜123与第一观察窗111的位置相对，第二试剂条的NC膜133与第二观察窗112的位置相对。该肺炎支原体及肺炎衣原体IgM和IgG抗体联检试剂盒100，将第一试剂条120和第二试剂条130并排设置，第一试剂条120用于检测肺炎衣原体和肺炎支原体的IgM抗体，第二试剂条130用于检测肺炎衣原体和肺炎支原体的IgG 抗体，避免了IgG抗体与IgM抗体之前的相互干扰，使联检的准确性提高。

具体地，在一实施例中，第一试剂条的结合垫122上涂布有IgM胶体金复合物，第二试剂条的结合垫132上涂布有IgG胶体金复合物。进一步地，IgM 胶体金复合物包括胶体金标记的IgM抗体-生物素-亲和素-胶体金复合物，胶体金标记的IgM抗体包括胶体金标记的鼠抗人肺炎支原体IgM单克隆抗体及胶体金标记的鼠抗人肺炎衣原体IgM单克隆抗体，IgG胶体金复合物包括胶体金标记的IgG抗体-生物素-亲和素-胶体金复合物，胶体金标记的IgG抗体包括胶体金标记的鼠抗人肺炎支原体IgG单克隆抗体及胶体金标记的鼠抗人肺炎衣原体 IgG单克隆抗体。该实施例试剂盒通过在结合垫上将胶体金标记的IgM/IgG抗体与生物素-亲和素放大系统相结合，使得感染早期样本中IgM抗体或IgG抗体含量较低时，也能够检出，使联检的准确性进一步提高。

如图1、图2及图3所示，第一试剂条120的NC膜123上由下至上依次设有CP-IgM检测线126、MP-IgM检测线127及IgM质控线128，第二试剂条130 的NC膜133上由下至上依次设有CP-IgG检测线134、MP-IgG检测线135及IgG 质控线136。进一步地，CP-IgM检测线126和CP-IgG检测线134上均包被有肺炎衣原体蛋白，MP-IgM检测线127和MP-IgG检测线135上均包被有肺炎支原体蛋白，IgM质控线128上包被羊抗鸡IgY抗体，IgG质控线136上包被羊抗鸡IgY抗体。

在其中一实施例中，第一试剂条120的样品垫121上还涂布有抗人IgG抗体吸附剂。该抗人IgG抗体吸附剂能够吸附样本中高浓度的IgG抗体，进一步减少高浓度IgG抗体对IgM检测造成的假阴性和假阳性影响，使联检的准确性得到提高。

具体地，第一试剂条的样品垫的制备方法包括，配置25mM Tris缓冲液后加入1％～3％酪蛋白和7％～9％BSA，而后加入海藻糖5g～10g，吐温5mL～10mL 充分混匀，调节PH为7.0，得到样品垫预处理液，在样品垫预处理液中添加浓度为25μg/mL抗人IgG抗体吸附剂，将样品垫浸入上述溶液，然后取出，经过干燥及裁切得到第一试剂条的样品垫。第二试剂条的样品垫的制备方法包括，将样品垫浸入所述样品垫预处理液，然后取出，经过干燥及裁切得到第二试剂条的样品垫。

在其中一实施例中，第一试剂条的结合垫的制备方法包括以下步骤：

(1)胶体金的制备，包括在加热煮沸的纯化水中快速加入1％氯金酸溶液，待溶液再次沸腾后，迅速加入还原剂，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，继续加热10min即可，待溶液冷却至室温后备用；

(2)胶体金-亲和素复合物的制备，包括在1mL胶体金溶液中加入4～8μL 的0.2MK

(3)IgM抗体-生物素复合物的制备，包括将肺支支原体IgM抗体和肺炎衣原体IgM抗体用生物素进行标记，标记成肺支支原体IgM抗体和肺炎衣原体 IgM抗体-生物素复合物。

(4)IgM胶体金复合物的制备，包括将胶体金-亲和素复合物和肺支支原体 IgM抗体和肺炎衣原体IgM抗体-生物素复合物分别混合后连接形成抗体-生物素-亲和素-胶体金复合物。

(5)铺金，包括测试抗体-生物素-亲和素-胶体金复合物的ODmax值，稀释至8OD～16OD范围后，对第一试剂条的结合垫进行喷金处理，然后干燥备用。

在其中一实施例中，所述第二试剂条的结合垫的制备方法包括以下步骤：

(1)胶体金的制备，包括在加热煮沸的纯化水中快速加入1％氯金酸溶液，待溶液再次沸腾后，迅速加入还原剂，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，继续加热10min即可，待溶液冷却至室温后备用；

(2)胶体金-亲和素复合物的制备，包括在1mL胶体金溶液中加入4～8μL 的0.2MK

(3)IgG抗体-生物素复合物的制备，包括将肺支支原体IgG抗体和肺炎衣原体IgG抗体用生物素进行标记，标记成肺支支原体IgG抗体和肺炎衣原体 IgG抗体-生物素复合物。

(4)IgG胶体金复合物的制备，包括将胶体金-亲和素复合物和肺支支原体 IgG抗体和肺炎衣原体IgG抗体-生物素复合物分别混合后连接形成抗体-生物素 -亲和素-胶体金复合物。

(5)铺金，包括测试抗体-生物素-亲和素-胶体金复合物的ODmax值，稀释至8OD～16OD范围后，对第二试剂条的结合垫进行喷金处理，然后干燥备用。

在其中一实施例中，试剂条的层压方法，包括将PVC底板揭开上端粘纸，将NC膜粘贴于底板上，结合垫一端压住NC膜一端1-2mm，样品垫一端压住结合垫一端1-2mm，吸水垫一端压住NC膜一端1-2mm，胶带一端压住样品垫一端0.5-1mm。

在其中一实施例中，该试剂盒100还包括吸管和样本稀释液。进一步地，吸管为单人份一次性定量吸管。该吸管用于添加样本稀释液，该样本稀释液一般为含氯化钠的缓冲液，用于样本加样后，对样本的稀释。该试剂盒适用的样本可以为血清、血浆或全血样本，能够对肺炎支原体及肺炎衣原体的IgM抗体和IgG抗体同时进行检测，可以很好的满足临床检测的需求。

该发明肺炎支原体及肺炎衣原体IgM抗体和IgG抗体联检试剂盒100 的检测方法包括：

(1)准备。将待测样本及样本稀释液从储存条件下取出，平衡至室温；试剂卡从包装袋中取出，平放于干燥平面上。

(2)加样。a)血清或血浆：取10μL血清或血浆样本分别加到第一加样孔和第二加样孔中，垂直滴加2滴样本稀释液；b)血清或血浆：取20μL全血样本分别加到第一加样孔和第二加样孔中，垂直滴加2滴样本稀释液。

(3)检测。等待5-10分钟，从第一观察窗及第二观察窗读取结果。

本试剂盒检测原理为捕获法：本试纸条的结合垫上分别有胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体和鼠抗人IgG单克隆抗体，在硝酸纤维素膜上的检测线(T) 处包被肺炎支原体蛋白和肺炎衣原体蛋白，质控线(C)处包被有羊抗鸡IgY抗体。检测时，当待检样本中含有IgM或IgG时，与胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体和鼠抗人IgG单克隆抗体结合，形成免疫复合体，分别被膜上固定的试剂捕获富集在检测线(T)处，形成M线或G线。胶体金标记的抗体扩散到质控线(C)区域被二抗体捕获形成质控区紫红色带。

从第一观察窗及第二观察窗读取结果，有以下几种情况：a)如果样本中含有肺炎衣原体IgM抗体，经过第一试剂条的结合垫，会与胶体金标记的鼠抗人肺炎衣原体IgM单克隆抗体-生物素-亲和素-胶体金复合物结合，进而在CP-IgM 检测线处被肺炎衣原体蛋白捕获，形成酒红色的检测线。b)如果样本中含有肺炎支原体IgM抗体，经过第一试剂条的结合垫，会与胶体金标记的鼠抗人肺炎支原体IgM单克隆抗体-生物素-亲和素-胶体金复合物结合，进而在MP-IgM检测线处被肺炎支原体蛋白捕获，形成酒红色的检测线。c)如果样本中含有肺炎衣原体IgG抗体，经过第二试剂条的结合垫，会与胶体金标记的鼠抗人肺炎衣原体IgG单克隆抗体-生物素-亲和素-胶体金复合物结合，进而在CP-IgG检测线处被肺炎衣原体蛋白捕获，形成酒红色的检测线。d)如果样本中含有肺炎支原体 IgG抗体，经过第二试剂条的结合垫，会与胶体金标记的鼠抗人肺炎支原体IgG 单克隆抗体-生物素-亲和素-胶体金复合物结合，进而在MP-IgG检测线处被肺炎衣原体蛋白捕获，形成酒红色的检测线。e)无论样本是否含有待测抗体，结合垫上胶体金复合物都会被质控线上的抗体捕获，形成酒红色的质控线，若质控线不出现，表示试剂盒失效，检测结果无效。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。